Получение пептидов и белков путем аккумулирования в эндоплазматическом ретикулуме растений

Получение пептидов и белков путем аккумулирования в эндоплазматическом ретикулуме растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Изобретение относится к получению интересующих пептидов и белков в растениях-хозяевах путем аккумулирования в эндоплазматическом ретикулуме растений, производящем белковые тельца, к нуклеиновой кислоте, кодирующей такие продукты, и к использованию указанных нуклеиновых кислот для производства конструкций и векторов для трансформирования систем растений-хозяев. В частности, раскрыт способ экспрессии и выделения интересующих гетерологичных продуктов, таких как кальцитонин (СТ), в растениях.

Предпосылки создания изобретения

Так как предполагается, что потребность в биофармацевтических препаратах значительно возрастет, благодаря замечательным достижениям в знании генома и в соответствующих биомедицинских исследованиях, то имеется значительный интерес к разработке недорогих рекомбинантных продукционных систем.

Генная инженерия растений для продуцирования биофармацевтических препаратов является относительно новой, в то время как другие трансгенные системы, включая бактерии, грибки и культивируемые клетки млекопитающих, широко и долгое время адаптировали для биопродуцирования. Тем не менее, некоторые рекомбинантные терапевтические белки, использующие растительные экспрессионные системы, уже имеются на рынке или находятся на разных стадиях клинических испытаний на человеке, например гирудин, антикоагулянтный белок для лечения тромбоза (Parmenter et al., 1995), химерная IgG-IgA вакцина против зубного кариеса (Ма et al., 1998), бактериальный вакциноген против энтеротоксигенного штамма Е. coli (Haq et al., 1995), и рекомбинантная желудочная липаза собак для лечения кистозного фиброза (Benicourt et al., 1993).

Растительные экспрессионные системы привлекательны потому, что уровень экспрессии рекомбинантных белков может быть повышен путем использования природных механизмов сортировки и нацеливания, которые используют растения для нацеливания хозяйских белков к органеллам. Кроме того, биофармацевтические препараты, произведенные растениями, могут быть легко увеличены до массового производства и имеют преимущество, обусловленное минимальным риском для здоровья, возникающим из-за контаминации патогенами или токсинами.

Растения оказываются все более и более привлекательными экспрессионными системами из-за их потенциала, предоставляющего неограниченные количества биологически активного материала при низкой стоимости производства и с пониженным риском для здоровья. Способность растений аккумулировать высокие уровни рекомбинантных белков и осуществлять большинство из посттрансляционных модификаций позволяет рассматривать их в качестве биореакторов для молекулярного выращивания рекомбинантных терапевтических препаратов (см. обзор Fischer and Emans, 2000). Однако важные решения, касающиеся выбора видов культур, выбора тканей, стратегий экспрессии и выделения и посттрансляционной обработки, являются определяющими для осуществимости коммерческого производства на основе растений (Cramer et al., 1999).

Внутриклеточное нацеливание рекомбинантных белков является важным условием для высокого уровня аккумулирования и правильной сборки и складывания таких белков в растениях. Компартментализация хозяйских белков во внутриклеточных накопительных органеллах в основном достигается путем использования подходящих сигнальных пептидов или целых слияний белков. Ряд рекомбинантных терапевтических белков был направлен к последующим компартментам растений: апопластическое пространство (McCormick et al., 1999), хлоропласта (Staub et al., 2000), эндоплазматический ретикулум (ЭР) (Stoger et al., 2000). Иммуноглобулины, направленные в ЭР компартмент в трансгенных растениях, оказалось, дают в 10-100 раз большие выходы, чем направленные к другим компартментам, таким как апопласт или цитозоль (Conrad and Fiedler, 1998).

Нацеливание сложных белков, таких как антитела, в ЭР компартмент особенно интересно, потому что большинство посттрансляционных модификаций, требуемых для получения функционального продукта, происходят внутри ЭР (Düring et al., 1990; Ma and Hein, 1995; Conrad and Fiedler, 1998). Несомненно, внутри ЭР сигнальный пептид расщепляется и напряженные белки, такие как связывающий IgG белок (BiP) и энзимы, такие как протеиндисульфидизомераза (PDI), функционируют как компаньоны, связывают несобранный белок и направляют последующее накопление и сборку. Вдобавок к этим особым характеристикам полезно указать, что растительный ЭР является высокоэластичным, что делает его идеальным резервуаром для гетерологичных фармацевтических белков. ЭР, даже если он появляется на входе секреторного пути, также способен сохранять белки в течение короткого или длинного периода времени. Растения сохраняют аминокислоты в течение долгого периода в форме специфических запасных белков. Одним из механизмов защиты этих запасных белков от неконтролируемого преждевременного разрушения является помещение их в ЭР-производные накопительные органеллы, называемые белковыми тельцами (БТ) (см. Müntz, 1998). Сборка таких органелл как простое аккумулирование рекомбинантных белков в ЭР просвете требует, в качестве первого шага, сохранения хозяйского белка. Секреторные белки, верно накопленные и собранные в ЭР, имеют ряд клеточных назначений, главным образом с помощью продвижения через аппарат Гольджи. Однако ЭР сохранение растворимых транспорт-компетентных белков может быть вызвано с помощью карбокси-концевой сохраняющей/восстанавливающей сигнальной KDEL (или HDEL) (Munro et al., 1987; Wandelt et al., 1992; Vitale et al., 1993). Это консервативное С-концевое звено, распознаваемое в аппарате Гольджи через трансмембранные рецепторы, допускает рециклинг выделенных ЭР резидентных белков обратно в ЭР (Vitale and Denecke, 1999; Yamamoto et al., 2001). Многие фрагменты рекомбинантных антител были удлинены KDEL сигналом для того, чтобы стабильно аккумулировались в растительных ЭР (Vitale et al., 1998; Torres et al., 1999). Альтернативным путем генерированию сохранения и аккумулирования рекомбинантных белков в ЭР компартменте является создание подходящего слияния с природным ЭР резидентом, таким как запасной белок семени.

WO 01/75312 раскрывает способ продуцирования цитокина в системе растения-хозяина, где указанная система растения-хозяина трансформирована химерной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный цитокин, указанную химерную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую первую последовательность нуклеиновой кислоты, способную к регуляции транскрипции в указанной системе растения-хозяина второй последовательности нуклеиновой кислоты, где указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует сигнальную последовательность, которая связана в рамке считывания с третьей последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей цитокин, и четвертую последовательность нуклеиновой кислоты, связанную в рамке считывания с 3′ концом указанной третьей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующую "KDEL" аминокислотную последовательность.

Зеины являются группой белков, которые синтезируются во время развития эндосперма в зерне, и могут быть разделены на четыре группы α, β, γ и δ на основании их растворимости. Зеины могут объединяться в БТ прямо в ЭР. Растения или ткани растений, содержащие руминовые стабильные белковые тельца, экспрессируемые в виде слитых белков, содержащих полный белок зеина и операбельно связанный белковый материал, раскрыты в WO 00/40738.

γ-Зеин, запасный белок маиса, является одним из четырех маисовых проламинов и составляет 10-15% от общего белка в эндосперме маиса. Как и другие зерновые проламины, α и γ-зеины биосинтезируются в мембранно-связанных полисомах на цитоплазматической стороне шероховатого ЭР, собираются внутри просвета и затем секвестируются в ЭР-производных БТ (Herman and Larkins, 1999, Ludevid et al., 1984, Torrent et al., 1986). γ-Зеин состоит из четырех характеристических доменов: i) пептидный сигнал из 19 аминокислот, ii) повторяющийся домен, содержащий восемь единиц гексапептида PPPVHL (53 ак), iii) proX домен, где пролиновые остатки заменены другими аминокислотами (29 ак) и iv) гидрофобный богатый цистеином С-концевой домен (111 ак). Способность γ-зеина собираться в ЭР-производных БТ не ограничивается семенами. Действительно, когда ген γ-зеина коститутивно экспрессировали в трансгенные растения Arabidopsis, запасный белок аккумулировался внутри ЭР-производных БТ в клетках мезофилла листа (Geli et al., 1994). Рассмотрение сигнала, ответственного за помещение γ-зеина в ЭР-производные БТ (проламины не имеют KDEL сигнала), показало, что богатый пролином N-концевой домен, включающий тандем повторяющегося домена, необходим для сохранения ЭР, и что С-концевой домен вовлечен в образование БТ. Однако механизмы, с помощью которых эти домены стимулируют сборку БТ, все еще не известны.

Кальцитонин (СТ), гормональный пептид из 32 аминокислот, является необходимым для правильного метаболизма кальция и нашел широкое клиническое применение при лечении остеопороза, гиперкальцемического шока и болезни Паджета (Reginster et al., 1993; Azria et al., 1995; Silverman et al., 1997). Человеческий СТ синтезировали в виде препропротеина с сигнальным пептидом из 25 аминокислот и двух пропептидов при N- и С-концах (57 ак и 21 ак, соответственно). Результирующий активный пептид имеет в длину 32 аминокислоты с единственной дисульфидной связью (Cysl-Cys7) и амидирован по карбокси-концу. In vitro человеческий СТ собирается в агрегаты, что ограничивает его использование в качестве терапевтических средств. Поэтому лососевый СТ, который менее склонен к агрегации, обычно используется взамен (Cudd et al., 1995). Производство СТ в настоящее время осуществляется путем химического синтеза, но стоимость этого производства подтолкнула некоторые исследовательские группы к разработке альтернативных подходов. Человеческий и лососевый СТ были получены в Е. coli (Ray et al., 1993; Hong et al., 2000), в мышиных клетках (Merli et al., 1996), в нонендокриновых линиях клеток Cos-7 и СНО (Takahashi et al., 1997) и совсем недавно в молоке трансгенных кроликов (McKee et al., 1998). Получение биоактивного кальцитонина с помощью биотехнологических методов включает, по меньшей мере, два этапа: i) генерирование глицин-удлиненного кальцитонина (Bradbury et al., 1988) и ii) образование карбокси-концевого пролинамида посредством действия фермента амидирования, пептидилглицин α-амидирующей монооксигеназы (РАМ) (Eipper et al., 1992). Так как точно не известно, протекает ли карбокси-амидирование в клетках растений, in vitro амидирование растительного глицин-удлиненного кальцитонина с РАМ ферментом дало С-концевой амид (Ray et al., 1993).

Краткое изложение изобретения

Задача, решаемая настоящим изобретением, заключается в разработке альтернативной системы для получения интересующих пептидов и белков в системе растения-хозяина.

Представленное здесь решение основано на способности богатых пролином доменов γ-зеина к самосборке и обеспечению стабильности слитых белков в ЭР системы растения-хозяина. Использование системы, основанной на слитом белке γ-зеина, для аккумулирования интересующего продукта в системе растения-хозяина представляет успешный подход к аккумулированию указанного интересующего продукта внутри ЭР-производных БТ растений.

Изобретение иллюстрируется примерами, где описана основанная на слитом белке система аккумулирования рекомбинантного СТ в ЭР-производных БТ в растениях табака. Ряд богатых пролином доменов были выделены из γ-зеина для использования в качестве партнера слияния через расщепляемый протеазой сайт. Кодирующая область зрелого кальцитонина была слита с С-концом доменов γ-зеина и экспрессирована в трансгенные растения табака. Слитые белки аккумулировались в ЭР-производных БТ листьев табака. После очистки слитые белки подвергали расщеплению энтерокиназой, позволяющему высвобождение кальцитонина.

Соответственно, один из аспектов настоящего изобретения относится к последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей (i) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок γ-зеин, или ее фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, способную к направлению и сохранению белка в эндоплазматическом ретикулуме; (ii) нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется с помощью ферментативных или химических способов; и (iii) нуклеотидную последовательность, кодирующую интересующий продукт; где указанные нуклеотидные последовательности являются оперативно связанными между собой.

В другом аспекте изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей указанную последовательность нуклеиновой кислоты.

В следующем аспекте изобретение относится к вектору, содержащему указанные последовательность или конструкцию, и к клетке, трансформированной указанным вектором.

В следующем аспекте изобретение относится к трансформированной системе растения-хозяина, имеющей указанные последовательность нуклеиновой кислоты, конструкцию или вектор.

В следующем аспекте изобретение относится к трансгенной системе растения-хозяина, содержащей интегрированную в ее геном указанную последовательность нуклеиновой кислоты.

В следующем аспекте изобретение относится к способу продуцирования интересующего продукта в системе растения-хозяина.

В следующем аспекте изобретение относится к способу продуцирования кальцитонина в системе растения-хозяина.

В следующем аспекте изобретение относится к слитому белку, причем указанный слитый белок имеет аминокислотную последовательность, соответствующую вышеуказанной последовательности нуклеиновой кислоты.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показаны нуклеотидные последовательности и трансляции γ-зеина (Фиг.1.А) и производных γ-зеина RX3 (Фиг.1.В, верхняя), R3 (Фиг.1.В, нижняя), Р4 (Фиг.1.С, верхняя) и Х10 (Фиг.1.С, нижняя).

На Фиг.2 показаны нуклеотидная последовательность (полоса 2) и трансляции (полоса 1) синтетического кальцитонина (СТ). Ген синтетического кальцитонина был сконструирован с использованием предпочтительного кодона растения. Модификации кодона подчеркнуты в сравнении с геном лососевого СТ дикого типа (полоса 3). Синтетический ген содержит при 5′ конце линкерную последовательность, соответствующую сайту расщепления энтерокиназой (ЭК), и удлинен при 3′ для получения С-концевого глицина.

На Фиг.3 показана схема конструирования pCRX3CT плазмиды. Представленный процесс был таким же для получения следующих плазмид pCZeinCT, pCR3CT, рСР4СТ и рСХ10СТ, различие между ними состоит в том, введены соответствующий γ-зеин или производные от γ-зеина последовательности. Разные плазмиды изображены не в пропоции.

На Фиг.4 показано схематическое изображение плазмид pBZeinCT, рВRХ3СТ, pBR3CT, рВР4СТ и рВХ10СТ. Разные плазмиды изображены не в пропорции.

На Фиг.5 показано схематическое изображение различных слитых белков. Домены γ-зеина и производных γ-зеина (RX3, R3, Р4 и Х10) были слиты с кальцитонином (СТ) через сайт расщепления энтерокиназой (ЭК). SP - сигнальный пептид; REPEAT - восемь единиц повторяющегося домена (PPPVHL); RI - одна повторная единица; Рrо-Х - пролин-Хаа; РХ - фрагмент Pro-Х домена; C-term - богатый цистеином С-концевой домен; N - N-концевая последовательность зрелого белка. Число аминокислот для каждого слитого белка указано справа.

На Фиг.6 показаны результаты иммуноблот-анализа слитых белков в трансгенных растениях табака с использованием антисыворотки γ-зеина. Растворимые белки экстрагировали из листьев дикорастущего (WT) и трансгенного табака (То), разделяли на 15% SDS-полиакриламидном геле (20 мкг на полосу) и переносили в нитроцеллюлозу. Числа указывают независимые трансгенные линии, полученные для различных химерных генов: γ-zein-CT, RX3-CT, R3-CT, Р4-СТ.

На Фиг.7 показаны: А. Сравнительный вестерн-блот анализ различных рекомбинантных слитых белков с использованием СТ антисыворотки. Экстракты растворимых белков были получены из дикорастущих растений (WT) и линий трансгенного табака (Т1), имеющих максимальную экспрессию слитого белка родственного химерного гена. 8 мкг растворимых белков помещали на 15% SDS-полиакриламидный гель и переносили в нитроцеллюлозу. В. Сравнительный нозерн-блот анализ различных транскриптов химерных генов. Общие РНК были выделены из анализируемых трансгенных линий с помощью иммуноблот-анализа (Фиг.7А), фракционированы с использованием денатурирующего формамидного гель-электрофореза (30 мкг на полосу) и капиллярно блоттированы на нейлоновой мембране. Блоты были гибридизированы с произвольно выбранной зонд-заправкой (129 оснований), полученной из кДНК кальцитонина.

На Фиг.8 показана внутриклеточная локализация RX3-CT и Р4-СТ белков в трансгенных растениях табака: (А) Иммунолокализация RX3-CT белка в RX3-CT трансгенных линиях с использованием антисыворотки СТ (разбавление 1:100). (В) Иммунолокализация Р4-СТ белка в Р4-СТ трансгенных линиях с использованием антисыворотки СТ (разбавление 1:100). (С) Иммунолокализация RX3-CT белка в RX3-CT трансгенных линиях с использованием антисыворотки γ-зеина (разбавление 1:1500). (D) Иммунолокализация BiP белка в RX3-CT трансгенных линиях с использованием антисыворотки BiP (разбавление 1:250). (Е) Иммунолокализация в дикорастущих растениях с использованием антисыворотки γ-зеина (разбавление 1:1500). (F) Иммунолокализация в RX3-CT трансгенных растениях без первичных антител (разбавление 1:1500). Иммуноцитохимия на срезах табачных листьев была выполнена с использованием индикаторных первичных антител и протеинового А-коллоидального золота (15 нм). cw: клеточная стенка; ch: хлоропласт; pb: белковое тельце; v: вакуоль.

На Фиг.9 показаны результаты иммуноблот-анализа ЭК расщепления RX3-СТ и Р4-СТ слитого белка. 12 мкг каждого частично очищенного слитого белка инкубировали с 0,2 U ЭК в течение 24 часов при 20°С. Гидролизованные слитые белки фракционировали с использованием 18% Трис-трицин-полиакриламидного гель-электрофореза и переносили в нитроцеллюлозу. Полосы 1 - негидролизованные слитые белки (1 мкг); полосы 2 - гидролизованные продукты; полосы 3 - стандарт, синтетический лососевый СТ.

На Фиг.10 показаны результаты RP-HPLC фракционирования RX3-CT слитого белка, гидролизованного с помощью ЭК. рСТ, выделенный из RX3-CT слитого белка, был обнаружен в фракции 3 (Tr=13 мин) с помощью TOF-MALDI с использованием синтетического лососевого СТ в качестве стандарта.

На Фиг.11 показаны результаты TOF-MALDI масс-спектроскопии (А) синтетического лососевого СТ (MW=3433.24) и (В) растительного СТ (MW=3491.93), элюированных при Tr=13 мин при RP-HPLC фракционировании.

Подробное описание изобретения

Первый аспект изобретения представляет последовательность нуклеиновой кислоты, в дальнейшем определяемой как последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению, содержащую:

первую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок γ-зеин, или ее фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, способную к направлению и сохранению белка в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР);

вторую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется с помощью ферментативных или химических способов; и

третью последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует интересующий продукт;

где 3′ конец указанной первой последовательности нуклеиновой кислоты связан с 5′ концом указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты и 3′ конец указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты связан с 5′ концом указанной третьей последовательности нуклеиновой кислоты.

Первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок γ-зеин, или ее фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, способную к направлению и сохранению белка в ЭР.

Используемый здесь термин "γ-зеин" относится к запасному белку маиса, который состоит из четырех характеристических доменов, упомянутых ранее в разделе "Предпосылки создания изобретения". Указанный термин включает нативные белки γ-зеина, а также его варианты и рекомбинантные белки γ-зеина, которые способны к направлению и сохранению белка в ЭР.

Может быть использована практически любая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок γ-зеин, или ее фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, способную к направлению и сохранению белка в ЭР.

Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую всю длину белка γ-зеина. В частном варианте осуществления изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая всю длину белка γ-зеина, показана на Фиг.1А и идентифицирована в SEQ ID NO:1.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент белка γ-зеина, указанный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, способную к направлению и сохранению белка в ЭР. В этом случае первая последовательность нуклеиновой кислоты может содержать:

- одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих весь или часть повторяющегося домена белка γ-зеина;

- одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих весь или часть ProX домена белка γ-зеина; или

- одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих весь или часть повторяющегося домена белка γ-зеина, и одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих весь или часть ProX домена белка γ-зеина.

В частном предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент белка γ-зеина, указанный фрагмент, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, способную к направлению и сохранению белка в ER, выбирали из группы, состоящей из:

- нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2 [нуклеотидная последовательность идентифицирована как RX3 (Фиг.1В)],

- нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:3 [нуклеотидная последовательность идентифицирована как R3 (Фиг.1В)],

- нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:4 [нуклеотидная последовательность идентифицирована как Р4 (Фиг.1С)], и

- нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:5 [нуклеотидная последовательность идентифицирована как X10 (Фиг.1С)].

Вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется ферментативными или химическими способами. В частном варианте осуществления изобретения указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует сайт расщепления протеазой, например, аминокислотный сайт, расщепляющийся с помощью протеазы, такой как энтерокиназа, Arg-C эндопротеаза, Glu-C эндопротеаза, Lys-C эндопротеаза, фактор Ха и аналогичных.

Альтернативно, вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислоту, которая специфически расщепляется химическим реагентом, таким как, например, цианбромид, который расщепляет остаток метионина, или любой другой подходящий химический реагент.

Вторая последовательность нуклеиновой кислоты может быть генерирована как результат объединения указанной первой последовательности нуклеиновой кислоты и указанной третьей последовательности нуклеиновой кислоты. В этом случае каждая последовательность содержит ряд нуклеотидов таким образом, что когда указанные первая и третья последовательности нуклеиновой кислоты становятся связанными, образуется функциональная нуклеотидная последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется ферментативными или химическими способами, т.е. вторая последовательность нуклеиновой кислоты. В альтернативном варианте осуществления изобретения вторая последовательность нуклеиновой кислоты является чужеродной последовательностью, оперативно вставленной между указанными первой и третьей последовательностями нуклеиновой кислоты.

Третья последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует интересующий продукт. В принципе, любой интересующий продукт может быть экспрессирован с помощью системы, предлагаемой настоящим изобретением. В предпочтительном варианте осуществления изобретения интересующий продукт является белковым (т.е. белок или пептид) лекарственным средством, например, пептидный гормон, такой как кальцитонин, эритропоэтин, тромбопоэтин, гормон роста и подобные, интерферон, т.е., белок, продуцируемый в ответ на вирусную инфекцию, и как цитокин при иммунном ответе, и т.д. Предпочтительно, указанные интересующие терапевтические продукты являются эффективными для лечения человека или животных.

В частном варианте осуществления изобретения третья последовательность нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую кальцитонин (СТ), например, человеческий кальцитонин (hCT) или лососевый кальцитонин (sCT). В общем, в этом случае указанная третья последовательность нуклеиновой кислоты, предпочтительно, включает кодон для глицина при 3′ конце указанной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей кальцитонин, воспроизводя таким образом глицин-удлиненный кальцитонин.

Согласно изобретению, 3′ конец указанной первой последовательности нуклеиновой кислоты связан с 5′ концом указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты и 3′ конец указанной второй последовательности нуклеиновой кислоты связан с 5′ концом указанной третьей последовательности нуклеиновой кислоты, т.е. указанные первая, вторая и третья последовательности нуклеиновой кислоты находятся в рамке считывания.

Последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению может быть получена с использованием обычных методик, известных специалисту в данной области. В основном, указанные методики включают связывание различных фрагментов последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению с подходящим вектором. Обзор указанных традиционных методик можно найти, например, в "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2^nd ed., by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Конструирование некоторых векторов, содержащих нуклеиновую кислоту по изобретению, приведено в примерах и проиллюстрировано на Фиг.3 и 4. Как там показано, различные богатые пролином домены были выделены из γ-зеина для использования в качестве партнера слияния через расщепляемый протеазой сайт. Кодирующая область зрелого кальцитонина (32 ак) была слита с С-концом доменов γ-зеина и экспрессирована в трансгенные растения табака. Слитые белки аккумулировались в ЭР-производных белковых тельцах в листьях табака. После очистки слитые белки подвергли расщеплению энтерокиназой, обеспечивающему высвобождение кальцитонина, который может быть далее очищен из гидролизной смеси с помощью хроматографии с обращенными фазами.

В другом аспекте изобретение представляет слитый белок, далее называемый слитый белок по изобретению, содержащий (i) аминокислотную последовательность белка γ-зеин, или ее фрагмент, способный к направлению и сохранению белка в ЭР, (ii) аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется с помощью ферментативных или химических способов, и (iii) интересующий продукт; указанный слитый белок является продуктом экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты по изобретению в системе растения-хозяина.

Слитый белок по изобретению аккумулируется в стабильных ЭР-производных БТ в системе растения-хозяина. Ферментативно или химически расщепляемый сайт, который находится при С-концах доменов γ-зеина, позволяет получать впоследствии интересующий продукт. Интересующий продукт затем может быть выделен и очищен общеизвестными методами. Следовательно, слитый белок по изобретению представляет новый и успешный подход к аккумулированию интересующего продукта.

В одном варианте осуществления изобретения слитый белок по изобретению содержит полный белок γ-зеина. Специфическая аминокислотная последовательность полного γ-зеина показана на Фиг.1А и идентифицирована как SEQ ID NO:6.

В другом варианте осуществления изобретения слитый белок по изобретению содержит фрагмент белка γ-зеина, указанный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, способную к направлению и сохранению белка в ЭР. В частном варианте осуществления изобретения слитый белок по изобретению содержит фрагмент белка γ-зеина, выбранный из группы, состоящей из:

- аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:7 [аминокислотная последовательность, соответствующая RX3 (Фиг.1В)],

- аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:8 [аминокислотная последовательность, соответствующая R3 (Фиг.1В)],

- аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:9 [аминокислотная последовательность, соответствующая Р4 (Фиг.1С)], и

- аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:10 [аминокислотная последовательность, соответствующая X10 (Фиг.1С)].

Слитый белок по изобретению содержит аминокислотную последовательность, которая специфически расщепляется с помощью ферментативных или химических способов. В частном варианте осуществления изобретения указанный расщепляющийся сайт содержит сайт расщепления протеазой, например, аминокислотный сайт, расщепляющийся с помощью протеазы, такой как энтерокиназа, Arg-C эндопротеаза, Glu-C эндопротеаза, Lys-C эндопротеаза, фактор Ха и аналогичных, или аминокислотный сайт, расщепляющийся с помощью химического реагента, такого как, например, цианбромид, который расщепляет остаток метионина, или любой другой подходящий химический реагент.

Слитый белок по изобретению также содержит интересующий продукт, например, белковое (т.е. белок или пептид) лекарственное средство, например, пептидный гормон, интерферон, и аналогичные. Предпочтительно, указанный интересующий продукт является эффективным для лечения человека или животных. В частном варианте осуществления изобретения слитый белок по изобретению содержит кальцитонин (СТ), например, необязательно глицин-удлиненный человеческий кальцитонин (hCT) или лососевый кальцитонин (sCT).

В следующем аспекте изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей (i) последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению, и (ii) регуляторную нуклеотидную последовательность, которая регулирует транскрипцию нуклеиновой кислоты по изобретению (i), причем указанная регуляторная последовательность (ii) является функциональной в растениях. Указанные последовательности нуклеиновой кислоты являются оперативно связанными.

Практически может быть использована любая функциональная регуляторная последовательность растения. В одном варианте осуществления изобретения указанная регуляторная последовательность (ii) является, предпочтительно, тканеспецифичной, т.е. она может регулировать транскрипцию нуклеиновой кислоты по изобретению в специфичных тканях, таких как семена, листья, клубеньки и т.д.

Регуляторная последовательность (ii) может содержать промотор, функциональный в растении. Фактически может быть использован любой промотор, функциональный в растении. В частном варианте осуществления изобретения указанная регуляторная последовательность (ii) содержит промотор 35SCaMV. В другом частном варианте осуществления изобретения указанная регуляторная последовательность (ii) содержит промотор "пататина", промотор запасного белка, промотор гена убихитина, регуляторную последовательность гена γ-зеина, или аналогичные.

Регуляторная последовательность (ii) может также содержать последовательность окончания транскрипции. Фактически может быть использована любая последовательность окончания транскрипции, функциональная в растении. В частном варианте осуществления изобретения указанная последовательность окончания транскрипции содержит терминатор 35SCaMV, терминатор гена октопинсинтазы (ocs), терминатор гена нопалинсинтазы (nos), терминатор гена γ-зеина, и аналогичные.

Регуляторная последовательность (ii) может также содержать трансляционный энхансер, функциональный в растении. Фактически может быть использован любой трансляционный энхансер, функциональный в растении, например, промотирующая последовательность для транскрипции вируса гравировки томата, и т.п.

Последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению или конструкция, полученная с помощью этого изобретения, может быть вставлена в подходящий вектор. Поэтому в следующем аспекте изобретения представлен вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению или конструкцию нуклеиновой кислоты, полученной с помощью настоящего изобретения. Подходящие векторы включают плазмиды, космиды и вирусные векторы. В одном варианте осуществления изобретения указанный вектор является подходящим для трансформирования растений. Выбор вектора может зависеть от клетки-хозяина, в которую он впоследствии вводится. В качестве примера, вектор, где вводится последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению, может быть плазмидой, космидой или вирусным вектором, который, когда вводится в клетку-хозяин, интегрируется в геном указанной клетки-хозяина и реплицируется вдоль хромосомы (или хромосом), в которую он был интегрирован. Для получения указанного вектора могут использоваться традиционные способы (Sambrook et al., 1989).

В следующем аспекте изобретения представлена система растения-хозяина, указанная система растения-хозяина трансформируется нуклеиновой кислотой по изобретению или конструкцией или вектором, полученными по настоящему изобретению.

Используемый здесь термин "система растения-хозяина" включает растения, включая, но не ограничиваясь ими, односемядольные, двудольные, и, особенно, зерновые (например, кукуруза, рис, овес и т.д.), бобовые (например, соя и т.д.), крестоцветные (например, Arabidopsis thaliana, рапс и т.д.) или пасленовые (например, картофель, томаты, табак и т.д.). Система растения-хозяина также включает клетки растений. Клетки растений включают суспензионные культуры, завязи, меристематические области, ткани каллуса, листья, корни, побеги, гаметофиты, спорофиты, пыльцу, семена и микроспоры. Система растения-хозяина может быть на различных стадиях зрелости и может быть растущей в жидкой или твердой культуре, или в почве или в подходящей среде в горшке, в теплице или в поле. Экспрессия в системе растения-хозяина может быть кратковременной или постоянной. Система растения-хозяина также относится к любому клону такого растения, семени, самого или гибридного продукта, отводку, размножаемому половым путем или бесполым, и потомкам любого из них, таким как отростки или семена.

Трансформация систем растений-хозяев может быть осуществлена с использованием традиционных методов. Обзор генетического переноса в растениях можно посмотреть в руководстве, озаглавленном "Ingenieria genetica and transferencia génica", написанном Marta Izquierdo, Ed. Pyramide (1999), в частности, глава 9,"Transferencia génica a plantas", стр.283-316.

В следующем аспекте изобретения представлена трансгенная система растения-хозяина, сконструированного так, что содержит новый лабораторно определенный трансген, причем указанная трансгенная система растения-хозяина содержит интегрированную в его геном нуклеиновую кислоту по изобретению. Указанная трансгенная система растения-хозяина может быть получена с помощью общеизвестных методик, например, путем использования обычных методик антисмысловой мРНК и/или переэкспрессии (в смысле подавления) или других, например, путем использования бинарных векторов или других векторов, пригодных для ныне используемых методик трансформации различных растений. Примеры транс