Инсектицидные белки, выделенные из видов бактерий bacillus, и их применение

Инсектицидные белки, выделенные из видов бактерий bacillus, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение связано с новым семейством нуклеотидных последовательностей, кодирующих инсектицидные белки и их инсектицидные фрагменты. В частности, настоящее изобретение связано с конкретными белками, обозначенными здесь как TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431, и их инсектицидными фрагментами, каждый из которых кодируется нуклеотидной кодирующей последовательностью, обозначенной здесь, соответственно, как tic901, tic1201, tic407, tic417, и tic431, так же как и нуклеотидной последовательностью гомологов, которая (1) кодирует инсектицидные белки и (2) гибридизуется с tic901, tic1201, tic407, tic417, и tic431 кодирующими последовательностями, в условиях гибридизации, выбранных из группы содержащей жесткие условия гибридизации и условия специфической гибридизации. Настоящее изобретение также связано с клетками хозяина, трансформированными нуклеотидными последовательностями согласно изобретению или трансформированными вариантами нуклеотидных последовательностей, на основе гена tic901, родственных генов и/или их гомологов, в частности, на основе тех последовательностей, которые были модифицированы для улучшения экспрессии в растениях. В предпочтительных воплощениях трансформированные клетки хозяина являются клетками растения.

ОСНОВЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Bacillus thuringiensis является грамм-положительной бактерией, которая продуцирует белковоподобные кристаллические включения в период споруляции. Данные кристаллические белки B.thuringiensis часто высокотоксичны для определенных насекомых. Инсектицидная активность против личинок насекомых из отряда чешуекрылых (гусеницы), двукрылых (москиты, мухи) и жесткокрылых (жуки) установлена для кристаллических белков из различных штаммов B.thuringiensis.

Присущие B.thuringiensis кристаллические белки, называемые также дельта-эндотоксинами или параспоральными кристаллами или токсическими белками, могут сильно различаться по структуре и инсектицидной активности. Данные инсектицидные белки кодируются генами, обычно локализованными на больших плазмидах размером более чем 30 мегадальтон (МДа), которые найдены в штаммах B.thuringienisis. Некоторые из токсических генов B.thuringienisis клонированы, и по их специфическим инсектицидным свойствам охарактеризованы инсектицидные кристалличекие белковые продукты. Существуют обзоры токсических генов и кристаллических белков B. thuringiensis (например, Hofte et al., 1989; Schnepf et al., 1998).

Инсектицидные свойства B.thuringiensis давно выявлены, и штаммы B.thuringiensis включали в коммерческие биологические инсектицидные продукты более сорока лет. Коммерческие инсектицидные составы B.thuringiensis обычно содержат сухие спорулированные сбраживаемые культуры B.thuringiensis, кристаллические белки которых токсичны по отношению к различным видам насекомых.

Традиционно коммерческие био-инсектицидные продукты B. thuringiensis получали из штаммов B.thuringiensis "дикого типа", то есть из очищенных культур штаммов B.thuringiensis, выделенных из природных источников. Новейшие коммерческие био-инсектицидные продукты B.thuringiensis основаны на генетически модифицированных штаммах B.thuringiensis, таких как трансконъюгатные штаммы B.thuringiensis, описанные в Патенте США № 5080897 и Патенте США № 4935353.

Различные штаммы B. thuringiensis классифицировали на основе реакции бактериального жгутика B.thuringiensis с антителами. Штамм B.thuringiensis, бактериальный жгутик которого реагирует с уникальным антителом, классифицировали как уникальный серовар (серовариант), и описано более тридцати различных сероваров или подвидов B.thuringiensis (DeBarjac and Frachon, 1990).

Каждый подвид B.thuringiensis зачастую продуцирует уникальные разновидности инсектицидных кристаллических белков. Например, подвиды B.thuringiensis kurstaki вырабатывают кристаллические белки размером приблизительно в 130 килодальтон (кДа) и в 70 кДа, которые токсичны для гусениц, в то время как подвиды B.thuringiensis tenebrionis вырабатывают кристаллический белок размером около 72 кДа, который токсичен для жуков.

Характерной чертой кристаллических белков является их способность сращиваться в форме кристаллов внутри материнской клетки B.thuringiensis. При лизисе материнской клетки белки высвобождаются во внешнюю среду в виде кристаллов. Кроме того, B.thuringiensis вырабатывают также и некристаллические белки, которые, в противоположность кристаллическим белкам, вырабатываются клетками B.thuringiensis в виде растворимых в культуральной среде белков. Выделяемые B.thuringiensis некристаллические белки включают в себя фосфолипазы, протеазы и лактомазы, которые если и обладают, то незначительной инсектицидной активностью. Однако, как было выявлено, три из секретируемых некристаллических белков B.thuringiensis, обозначаемых как Vip1, Vip2 и Vip3, токсичны в отношении жесткокрылых и чешуекрылых насекомых (Estruch et al., 1996; Патент США № 5866326; Международная заявка 94/21795; Международная заявка 96/10083). У некристаллического белка B.thuringiensis, обозначаемого как CryV, выявлена токсичность в отношении чешуекрылых насекомых (Kostichka et al., 1996). Ранее были идентифицированы некоторые из продуцируемых Bacillus thuringiensis очищенные внеклеточно секретируемые инсектицидные белковые токсины (Патент США, серийный № 5840868; Патент США, серийный № 5849870; Патент США, серийный № 5866326; Патент США, серийный № 5872212; Патент США, серийный № 5877012; Патент США, серийный № 5888801; Патент США, серийный № 6204435; Патент США, серийный № 6242669; Патент США, серийный № 6279369). Все такие штаммы, как было показано, выделяют один или более таких VIP или CryV токсичных белков или близкородственных гомологов. Как ни удивительно, авторы изобретения открыли здесь новый класс внеклеточно секретируемых инсектицидных белковых токсинов, у которых не выявлено гомологии с известными классами белков VIP или CryV.

Сравнение аминокислотных последовательностей показало, что классы белков Vip1, Vip2, Vip3, WAR, MIS и CryV не связаны с белками соглано изобретению. Следующее сравнение показало, что ни один из ста тридцати семи более или менее известных инсектицидно токсичных белков B.thuringiensis (Crickmore et al., 1998) не связан с белками согласно изобретению. Фактически не найдено значительной гомологии между последовательностями белков согласно изобретению и какой-нибудь из тысячи белковых последовательностей, содержащихся в Национальном центре Ресурсов Генома (GenBank), Santa Fe, NM. Исследования с помощью программы BLAST позволили идентифицировать только два белка в базе данных GenBank, которые предполагают возможную гомологию с TIC901. Инсектицидный белок Bacillus sphaericus Mtx2 обнаруживает только 21%-ую степень идентичности аминокислотной последовательности с последовательностью из 135 последовательных аминокислот, выровненной по TIC901. Предполагаемая аминокислотная последовательность, которая может быть экспрессирована из генома вируса оспы птиц, обнаруживает только 27%-ую степень идентичности аминокислотной последовательности с последовательностью из 147 последовательных аминокислот, выровненной по TIC901.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном воплощении настоящее изобретение связано с выделением и очисткой инсектицидного белка, выявлением аминокислотной последовательности, по существу представленной в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:33, либо в виде предшествующих форм аминокислотных последовательностей, либо в виде зрелых и/или прошедших стадию процессинга и секретируемых форм этих аминокислотных последовательностей или родственных им аминокислотных последовательностей и их гомологов. Инсектицидная активность TIC901 и родственных белков продемонстрирована в биоанализах на колорадском картофельном жуке (ККЖ) и методом Вестерн- и Саузерн-блоттинга на корневых личинках у зерновых. В частности, белки токсичны по отношению к жесткокрылым насекомым, включая и колорадского картофельного жука (Lymantria dispar), и, как здесь показано, по отношению к кукурузным жукам (КЖ).

В другом воплощении настоящее изобретение связано также с изолированной и очищенной нуклеотидной последовательностью, то есть кодирующей последовательностью, включающей в себя нуклеотидную последовательность, представленную последовательностями SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и/или SEQ ID NO:32 и родственными им последовательностями или их гомологами. Нативная последовательность или последовательность дикого типа, кодирующая tic901, представленная в SEQ ID NO:3, кодирует нативный предшественник TIC901, пре-белок или белковый пре-токсин, обнаруживающий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4. Организмы, вырабатывающие белок TIC901, проявляют инсектицидную активность и/или насекомоустойчивые свойства. Инсектицидная аминокислотная последовательность, соответствующая белку, локализуется во внеклеточном пространстве, окружающем клетку Bacillus, экспрессирующую белок из последовательности SEQ ID NO:3, соответствует белку, состоящему из аминокислоты приблизительно от положения 44 вплоть до аминокислоты в положении приблизительно 367, представленному в SEQ ID NO:4. Нативный или дикий тип кодирующей последовательности tic1201, представленной в SEQ ID NO:5, кодирует предшественник белка TIC1201, обнаруживающего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6. Инсектицидная аминокислотная последовательность, соответствующая белку, локализуется во внеклеточном пространстве, окружающем клетку Bacillus, экспрессирующую белок из SEQ ID NO:5, соответствует зрелому белку, состоящему из аминокислоты приблизительно от положения 44 и приблизительно до аминокислоты в положении 364, представленному в SEQ ID NO:6. Нативный или дикий тип кодирующей последовательности tic407, представленной в SEQ ID NO:7, кодирует предшественник TIC407, пре-белок или белок пре-токсина, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8. Инсектицидная аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому белку, локализуется во внеклеточном пространстве, окружающем клетку Bacillus, экспрессирущую белок из SEQ ID NO:7, и соответствует белку, состоящему из аминокислоты приблизительно от положения 44 вплоть до аминокислоты приблизительно в положении 367, представленной в последовательности SEQ ID NO:8. Нативная последовательность или последовательность дикого типа, кодирующая tic417, представленная в SEQ ID NO:9, кодирует предшественник TIC417, пре-белок или белок пре-токсина, которые имеют аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10. Инсектицидная аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому белку, локализуется во внеклеточном пространстве, окружающем клетку Bacillus, экспрессирущую белок из SEQ ID NO:9, и соответствует белку, состоящему из аминокислот приблизительно от положения 44 вплоть до аминокислоты приблизительно в положении 364, и представленному в SEQ ID NO:10. Нативный или дикий тип кодирующей последовательности tic431, представленной в SEQ ID NO:32, кодирует предшественник TIC431, пре-белок или белок пре-токсина, которые имеют аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO:33. Инсектицидная аминокислотная последовательность, соответствующая зрелому белку, локализуется во внеклеточном пространстве, окружающем клетку Bacillus thuringiensis, экспрессирующую белок из SEQ ID NO:33, соответствует белку, состоящему из аминокислот приблизительно от положения 44 вплоть до аминокислоты приблизительно в положении 364, представленную в SEQ ID NO:33. Нуклеотидная последовательность гомологов, то есть инсектицидных белков, кодируемых нуклеотидными последовательностями, которые гибридизуются с каждой или любой из описанных здесь последовательностей, в жестких условиях гибридизации, особо предназначены для включения в объем настоящего изобретения.

В следующем воплощении, настоящее изобретение связано с биологически чистой бактериальной культурой Bacillus thuringiensis, преобразованной плазмидным вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и/или SEQ ID NO:32, и/или родственные последовательности или гомологи, которые вырабатывают инсектицидный белок и секретируют белок во внеклеточное пространство, окружающее бактериальный штамм в процессе ферментации. Образец штамма EG12450 депонировали в перманентную коллекцию культур, согласно Будапештскому Соглашению, под № NRRL B-30357.

В следующем воплощении настоящее изобретение связано также с биологически чистой культурой бактерии B.thuringiensis, обозначенной как штамм EG2158, проявляющей инсектицидную активность против жесткокрылых насекомых. Штамм B.thuringiensis EG2158 представляет собой штамма B.thuringiensis дикого типа, из которого выделена кодирующая последовательность tic901, которая депонирована в перманентной коллекции культур, согласно Будапештскому Соглашению, под № NRRL B-18213. EG2158, как показано здесь, вырабатывает по меньшей мере два инсектицидных белка, включающих в себя аминокислотные последовательности, выбранные из группы, содержащей SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:10.

В следующем воплощении настоящее изобретение предоставляет вектором, включающим в себя нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, кодирующую аминокислотную последовательность TIC901, представленную в SEQ ID NO:4. Штамм Escherichia coli, содержащий вектор, включающий в себя последовательность SEQ ID NO:3, был внесен 6 февраля 2002 в Коллекцию NRRL (Northern Regional Research Lab of Agricultural Research Service Center Collection), USDA, в соответствии с условиями "Будапештского Договора о Международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры" под № NRRL B-30549. Плазмида, содержащая вышеуказанную нуклеотидную последовательность, представлена здесь как pEG1381.

В следующем воплощении настоящее изобретение связано с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, кодирующей нуклеотидную последовательность TIC901, и олигонуклеотидным сегментом, который можно пометить и использовать в качестве зонда для создания гибридов для идентификации дополнительных родственных генов, кодирующих родственные инсектицидные белки или их гомологи. Другое воплощение связано с нуклеотидными последовательностями, особо представленными здесь в качестве примера, включающими в себя последовательности, представленные в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32, каждая из которых кодирует инсектицидный белковый токсин, представленный в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:33, соответственно.

Кроме того, в следующем воплощении настоящее изобретение связано с клетками растения и растениями, которые трансформируются нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок TIC901, представленный в SEQ ID NO:4, или его инсектицидный фрагмент. Нуклеотидная последовательность может быть транслирована и экспрессирована клетками растения и тканями растения в дозе, достаточной для уничтожения жесткокрылых насекомых-вредителей. В рамках настоящего изобретения рассматриваются как односемядольные, так и двусемядольные растения. Необходима модификация последовательности для достижения максимального уровня экспрессии, а также для того, чтобы усилить способность растения, содержащего последовательность, вырабатывать инсектицидные уровни белка TIC901.

Кроме того, в следующем воплощении настоящее изобретение связано со способом получения трансгенного растения, которое проявляет повышенный уровень экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей TIC901, и следовательно повышенный уровень инсектицидного белка TIC901. Таким образом, растения, трансформированные модифицированными нуклеотидными последовательностями, описанными в настоящем изобретении, проявляли улучшенные и повышенные уровни сопротивления жесткокрылым вредителям по сравнению с растениями, не содержащими нуклеотидной последовательности, кодирующей TIC901 или родственный белок.

Из вышесказанного следует, что предложенный способ экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей белок TIC901 у растения, включающий в себя стадии встраивания в геном растительной клетки последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей в направлении от 5' к 3' функциональный промотор растительной клетки, оперативно связанный с последовательностью структурной ДНК, оптимизированной для экспрессии в клетках растений, которая вызывает продуцирование последовательности РНК, кодирующей полипептидную последовательность TIC901, представленную в последовательности SEQ ID NO:4, или последовательность, имеющую степень идентичности, составляющую по меньшей мере приблизительно от 80% и выше, или по меньшей мере приблизительно от 85% и выше, или по меньшей мере приблизительно от 90% и выше, или по меньшей мере приблизительно от 95% и выше, или по меньшей мере приблизительно от 99% и выше, по отношению к аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:4; и 3'-нетранслируемой последовательности ДНК, которая функционирует в клетках растения, вызывая терминацию транскрипции и полиаденилирование; получение трансформированных клеток растения, содержащих указанную последовательность нуклеиновой кислоты; и получение из трансформированных клеток растения генетически трансформированных растений, которые экспрессируют нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC901, причем трансформированные растения являются морфологически нормальными и проявляют повышенные или улучшенные уровни резистентности к жесткокрылым вредителям по сравнению с растением, не трасформированным с целью экспрессии указанного белка.

Другое воплощение согласно изобретению связано с обеспечением антител, специфически связывающихся с эпитопами, представленными только белком TIC901 или его гомологами. Антитела могут быть использованы для идентификации присутствия белка TIC901 или его гомолога, для очищения вышеуказанного белка или гомолога, для идентификации нуклеотидной последовательности, на основании которой белок TIC901 или гомолог экспрессирован, и для использования в наборах, предназначенных для выявления белка TIC901 или его гомолога или выявления нуклеотидной последовательности, экспрессирующей вышеуказанный белок или гомолог.

В частности, преимуществом согласно изобретению является улучшение контроля устойчивости насекомым. Возможность комбинировать два или более инсектицидных агента, каждый из которых токсичен в отношении одного и того же вида насекомых-вредителей, в единую композицию, где каждый агент проявляет действие, отличное от другого инсектицидного агента, с которым его комбинируют, создает вероятность более эффективного контроля конкретных видов насекомых-вредителей посредством существенного уменьшения вероятности того, что будет развиваться устойчивость к инсектицидной композиции в популяции. Белок TIC901 согласно изобретению можно комбинировать с любыми известными инсектицидными агентами для достижения уровня контролируемой резистентности в конкретной композиции, предпочтительно посредством экспрессии комбинации инсектицидных агентов в растения. В частности, композиции белка TIC901 можно сочетать с вариантами аминокислотной последовательности Cry3 или Cry3 для достижения контроля над различными видами жесткокрылых насекомых-вредителей или с другими подходящими белками, такими как PS149B1, CryET33/34, CryET80/76, CryET70, Cry22, CryET39, CryET76, Cry5Ba, Cry6a, и Cry12a, и, сходным образом, с белками VIP, WAR или MIS, и, сходным образом, с различными инсектицидными композициями, полученными из штаммов Xenorhabdus и Photorhabdus бактерий, которые, как было показано, проявляют инсектицидную биоактивность, направленную против жесткокрылых вредителей растений. Предпочтительное использование данных композиций in planta будет направлено на улучшение экспрессии белков в те части растения, которые проявляют значительную восприимчивость к жесткокрылым насекомым-хищникам. Для защиты картофеля от ККЖ предпочтительно достигнуть высокого уровня экспрессии в листья и стебли растения. Для вида кукурузы, подверженного проволочнику и личинкам, повреждающим корни, предпочтительно достигнуть высокого уровня экспрессии в подпочвенные части растения, то есть в корневую систему растений.

Другое воплощение согласно изобретению состоит в выделении полинуклеотида, который кодирует в Bacillus thuringiensis инсектицидный токсин или его инсектицидные фрагменты, активность которых направлена против насекомых-вредителей, где токсин или инсектицидный фрагмент имеет молекулярный вес приблизительно между 36000 дальтон и приблизительно 42500 дальтон. Кроме того, нуклеотидная последовательность, кодирующая токсин или его комплемент, гибридизуется в жестких условиях с последовательностью SEQ ID NO:3. Токсин проявляет предпочтительную биологическую активность в контролировании уничтожения жесткокрылых насекомых-вредителей, предпочтительно колорадского картофельного жука и/или кукурузного жука. В одном воплощении нуклеотидная последовательность, кодирующая токсин, оптимизирована для экспрессии в растениях и, по существу, кодирует токсин или его инсектицидный фрагмент, то есть кодирует ту же самую или по существу ту же самую аминокислотную последовательность, которая присутствует в нативной аминокислотной последовательности.

Другое воплощение согласно изобретению связано с трансформированными клетками-хозяевами, содержащими полинуклеотид, кодирующий инсектицидный белок согласно изобретению или его инсектицидный фрагмент. Предпочтительно, когда нуклеотидные последовательности согласно изобретению модифицированы с целью улучшения экспрессии белков согласно изобретению в предпочтительной клетке- хозяине. Клетка-хозяин согласно изобретению выбрана из группы, содержащей клетку бактерий, клетку грибов и клетку растения. Экспрессия в клетке растения может включать в себя экспрессию с целью достижения аккумуляции инсектицидного белка в цитоплазме или приводить к аккумуляции инсектицидного белка в субклеточной органелле, такой как плазмида, хлоропласт или митохондрия. Альтернативно, инсектицидный белок согласно настоящему изобретению или его инсектицидный фрагмент мог быть локализован в системе белковой секреции конкретной клетки-хозяина и в результате аккумулировать белковый продукт вне клетки и во внеклеточном пространстве вокруг клетки.

Дополнительное воплощение согласно изобретению определяет способ борьбы с заражением растения жесткокрылыми видами насекомых. Предпочтительно обеспечивали пестицидное количество инсектицидного белка согласно настоящему изобретению или его инсектицидного фрагмента, потребляемое насекомыми-вредителями с пищей. Пища может содержать часть растения, которым насекомое в норме кормится, такую как растительная ткань или растительная клетка. Инсектицидный белок или его инсектицидный фрагмент может быть представлен в композиции, которая наносится на поверхность растительной ткани, части растения или растительной клетки, или, более предпочтительно, может быть продуцирована системой синтеза белка клеткой и, как описано выше, аккумулирована внутри растительной клетки или секретирована из клетки растения, так что количество белкового токсина является инсектицидным количеством, достаточным для подавления насекомых-вредителей через принятие пищи или для подавления последующего роста и развития насекомых-вредителей или для гибели насекомых-вредителей. Пища, предоставляемая насекомым, может быть также искусственной пищей, содержащей токсичный белок, который равномерно распределен внутри или на наружной поверхности(тях) пищевой основы, или включена в виде градиента концентрации внутри или на наружной поверхности(тях) пищевого субстрата. Инсектицидный токсин или его фрагмент получали из нуклеотидной последовательности, которая кодируется в Bacillus thuringiensis нуклеотидной последовательностью, которая в жестких условиях гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, по существу комплементарной последовательности SEQ ID NO:3.

Настоящее изобретение также связано со способом выявления первой нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется со второй нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3, где первая нуклеотидная последовательность кодирует инсектицидный белок или его инсектицидный фрагмент и в жестких условиях гибридизации гибридизуется со второй нуклеотидной последовательностью. Примерами последовательностей являются последовательности SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3.

Настоящее изобретение также связано с неприродно возникающими или синтетическими нуклеотидными последовательностями, которые кодируют инсектицидный белок TIC901 или его инсектицидный фрагмент или его гомолог, где указанный белок TIC901 или его инсектицидный фрагмент или его гомолог выбраны из группы последовательностей, состоящих из последовательностей SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:7. Предпочтительно, чтобы неприродно возникающая нуклеотидная последовательность или последовательности, представленные в настоящем документе, которые кодируют инсектицидный белок или его инсектицидный фрагмент, предусматривались для экспрессии TIC901 или родственного белка в клетках растения. Таким образом, в настоящем документе предусмотрены клетки растения, трансформированные такими последовательностями. Растения, вырастающие из трансформированных клеток растения, также представлены в настоящем изобретении. Семена из трансформированных растений согласно настоящему изобретению также предусмотрены настоящим изобретением, если семена содержат последовательности, кодирующие инсектицидные белки или их инсектицидные фрагменты.

Примеры последовательностей согласно настоящему изобретению, в дополнение к родственным последовательностям SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, включают в себя по меньшей мере следующие последовательности: (1) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, и аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью SEQ ID NO:5, представленную в SEQ ID NO:6 и упоминаемую в этом документе также как инсектицидный белок TIC1201; (2) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, и аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью SEQ ID NO:7 и представленную в SEQ ID NO:8, также упоминаемую в настоящем документе как TIC407; (3) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, и аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью SEQ ID NO:9 и представленную в последовательности SEQ ID NO:10, и также упоминаемую в настоящем документе как инсектицидный белок TIC417, и (4) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:32, и аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью SEQ ID NO:32, представленной в SEQ ID NO:33 и также упоминаемой в настоящем документе как инсектицидный белок TIC431. Каждый из этих белков и нативные нуклеотидные последовательности B.t., кодирующие эти белки, связаны с TIC901, как описано в настоящем документе. Например, последовательность SEQ ID NO:5 является нуклеотидной последовательностью, кодирующей инсектицидный белок TIC1201, представленный в последовательности SEQ ID NO:6. Последовательность SEQ ID NO:5, как показано в настоящем документе, распознается посредством гибридизации с последовательностью SEQ ID NO:3 в жестких условиях гибридизации. Последовательность SEQ ID NO:5 кодирует белок, который проявляет токсическую биологическую активность в отношении жесткокрылых, проявляя токсичность в отношении кукурузных жуков и колорадских картофельных жуков. Каждая из последовательностей SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32 способна к гибридизации с остальными в условиях гибридизации, выбранных из группы, включающей в себя жесткие и условия специфической гибридизации. Каждая последовательность может также быть идентифицирована путем гибридизации с SEQ ID NO:2 в условиях, выбранных из группы, содержащей жесткие и условия специфической гибридизации. Каждая последовательность может также быть идентифицирована путем амплификации, например, с использованием олигонуклеотидной пары праймеров, представленных в последовательностях SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, и олигонуклеотидной пары праймеров, представленных в последовательностях SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:27. Пара праймеров, представленная в последовательностях SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, и пара праймеров, представленная в последовательностях SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:27, являются типичными и диагностическими критериями для идентификации присутствия нуклеотидной последовательности, кодирующей TIC901 или родственный инсектицидный белок в препарате. Данные олигонуклеотидные пары, когда используются по одиночке или вместе, при определенных условиях амплификации и в присутствии субстрата подходящей нуклеотидной последовательности, продуцируют ампликон, содержащий от 540 до 640 пар оснований. Тепловые реакции амплификации с использованием данных праймеров пригодны для определения присутствия гена B. t., кодирующего инсектицидный белок, соответствующий TIC901, или родственный ему белок в препарате, что значительно упрощает исследование и идентификацию таких родственных последовательностей. Другие ампликоны, получаемые при использовании других пар праймеров, также представляют собой основанную на выравнивании нуклеотидную последовательность, например последовательности SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:32. Области существенной идентичности аминокислотной последовательности белкам, кодируемым данными нуклеотидными последовательностями, соответствуют нуклеотидным последовательностям, которые могут быть использованы для получения комплементарных или по существу комплементарных последовательностей для применения в качестве зондов или затравок при использовании в тепловых реакциях, позволяющих определять последовательности, родственные TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и TIC431.

Вырожденные олигонуклеотидные зонды и праймеры, представленные в последовательностях SEQ ID NO:23 - SEQ ID NO:29, дополнительно представлены как средство для идентификации любой нуклеотидной последовательности, кодирующей инсектицидный белок, секретируемый по меньшей мере из видов Bacillus thuringiensis, в которых нуклеотидную последовательность идентифицировали при помощи вырожденных олигонуклеотиных зондов, гибридизованных в жестких условиях с одной или более последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:32. Примеры последовательностей, идентифицируемых при помощи таких олигонуклеотидов, включают в себя последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:30 и SEQ ID NO:32, каждая из которых кодирует пептиды, представленные, соответственно, в последовательностях SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:31 и SEQ ID NO:33.

Другое воплощение включает в себя способ выявления tic901 и родственных последовательностей, кодирующих белок, в штаммах Bacillus, включающий в себя стадии культивирования штаммов Bacillus от 16 до 45 часов в обогащенном бульоне в аэробных условиях, выявления в супернатанте культуры белка, который проявляет идентичность антигену, родственному TIC901, и/или перекрестной реактивности с антителом, которое специфически связывается с одним или более белковыми пептидами или антигенами TIC901, идентификации и очищения нуклеотидной последовательности, которая кодирует выявленный белок, экспрессии белка на основании нуклеотидной последовательности и демонстрации инсектицидной активности с помощью экспрессируемого белка.

Также рассматривается набор для выявления присутствия нуклеотидных последовательностей согласно настоящему изобретению, а также их зонды, праймеры, аналоги и производные. Такой набор содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, каждая из которых предназначена для использования либо в качестве зонда для выявления присутствия нуклеотидной последовательности, кодирующей инсектицидный белок согласно изобретению или его фрагмента, или родственной нуклеотидной последовательности, либо для использования в комбинации с одним или более другими зондами или праймерами, входящими в этот комплект, для амплификации одной или более последовательностей согласно настоящему изобретению или родственной нуклеотидной последовательности. Такие наборы могут также - или альтернативно - содержать антитело, специфичное в отношении связывания с одним или более пептидами или белками согласно изобретению, как и реагенты для использования с зондом или антителом, и указанные наборы будут содержать также контрольные образцы для их использования с той целью, чтобы убедиться, что нуклеотиды или пептиды, идентифицируемые с помощью зонда и/или антитела и реагентов, функционируют в соответствии с инструкциями изготовителей набора. Все реагенты, необходимые для выполнения способов идентификации либо нуклеотидной последовательности, либо пептидов, должны быть упакованы вместе в наборе, согласно инструкциям по применению. Примерный набор будет содержать нуклеотидную последовательность, полученную из TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417 и/или TIC431, кодирующую последовательность вместе с праймерами амплификации нуклеотидной последовательности, например, представленными в последовательностях SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12, или различными комбинациями последовательностей SEQ ID NO:23-26 и SEQ ID NO:27-29, вместе с реагентами, необходимыми для проведения реакции амплификации, вместе упакованными в указанный набор.

Следовательно, предполагается, что композиция и способы, описанные в настоящем изобретении, предоставят много преимуществ на фоне известных ранее способов, включая, в частности, те, которые были подчеркнуты выше. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет полностью новый класс инсектицидных белков и нуклеотидных последовательностей, кодирующих эти белки, которые не были ранее известны в данной области.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГУРЕ 1 представлено выравнивание аминокислотной последовательности белков-предшественников TIC901p, TIC407p, TIC417p, TIC1201p и TIC431p; каждая аминокислотная последовательность содержит предсказанную тридцати(30)-членную аминоконцевую аминокислотную последовательность, характерную для сигнального пептида типа II, с последующими тринадцатью дополнительтельными аминокислотами, от аминокислоты в положении тридцать один (31) до аминокислоты в положении сорок три (43) соответствующих им последовательностей, которые не представлены в зрелом белке, выделенном из использованной ферментационной среды. Подчеркнутая аминокислота в положении 44 в консенсусной последовательности представляет собой амино-концевую аминокислоту зрелого белка. Нативную нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующие затененные аминокислоты в положениях 75-83, 147-153 и 275-283, использовали в качестве основы для построения избыточных нуклеотидных зондов и праймеров, используемых для идентификации последовательностей, кодирующих эти и другие родственные инсектицидные белки из нуклеотидных последовательностей видов Bacillus.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:1 представляет собой полученную в результате деградации геля по Эдману аминокислотную последовательность очищенного инсектицидного белка приблизительно в 38 кДа, секретируемого в клеточную среду клетками EG2158 штамма B.thuringiensis, и соответствует главным образом аминокислотной последовательности, представленной в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:4 от положения 44 до положения 58.

SEQ ID NO:2 представляет собой синтетическую нуклеотидную последовательность для применения в качестве зонда для выявления tic901 или родственной нуклеотидной последовательности, или для использования в качестве одной из пары затравок тепловой амплификации для полной или частичной амплификации tic901 или родственной нуклеотидной последовательности, и соответствует триплетам кодонов, которые предпочтительны для применения штаммом B.thuringiensis и остальными штаммами Bacillus, в которых с особой частотой используется кодон, в котором частота встречаемости А или Т в положении третьей пары оснований внутри каждого кодона смещена в сторону повышенного содержания А или Т.

SEQ ID NO:3 представляет собой нативную (также упоминаемую здесь как последовательность дикого типа)) нуклеотидную последовательность Bacillus thuringiensis, кодирующую белок TIC901. Предсказанная последовательность блока Прибнова или Шайна и Дальгарно локализована вблизи нуклеотидов 141-147. Предсказанная открытая рамка считывания, кодирующая предсказанный предшественник белка TIC901, соответствует нуклеотидам от положения 153 до положения 1253. Нуклеотиды в положениях 282-325 по существу соответствуют гавным образом последовательности олигонуклеотидного зонда, как показано в последовательности SEQ ID NO:2, который гибридизируетс