Способ оценки раздражающего действия и активности природных, синтетических субстанций и готовых препаратов на куриных эмбрионах методом ультразвуковой допплерографии

Способ оценки раздражающего действия и активности природных, синтетических субстанций и готовых препаратов на куриных эмбрионах методом ультразвуковой допплерографии

Реферат

Изобретение относится к экспериментальной и клинической фармакологи, в частности к исследованию или анализу природных и синтетических субстанций, медицинских препаратов, пищевых продуктов и биологически активных добавок при определении безопасности их применения и биологической активности.

Для оценки безопасности фармакологических средств необходимо изучение раздражающего действия веществ.

К методам контроля безопасности применения и действия веществ относится ХЕТ-КАМ тест на хориоаллантоисной оболочке (ХАО) куриного эмбриона.

Куриный эмбрион является классическим объектом эмбриологических и токсикологических исследований, а его хориоаллантоисная мембрана обеспечивает естественную окружающую среду для сосудов и их взаимодействия с эмбрионом. К 9-10 дню развития у куриного эмбриона окончательно формируется аллантоис с мелкопетлистой сетью сосудов и лежащая поверх него хориоаллантоисная оболочка. Сосуды аллантоиса проходят в мезодерме, окружая желток. Кровь к аллантоису поступает по двум аллантоисным артериям, которые являются продолжением первичной аорты, и после распространения через капилляры возвращаются к первичному сердцу по двум венам. С этого момента поверхность аллантоиса и сосудистой сети уже не изменяются, что создает стабильные условия для экспериментов на сосудах. Однако, начиная с 11-12 дня развития зародыша, происходит утолщение белочной оболочки и более плотное прилегание ее к поверхности ХАО. Поэтому при вскрытии яйца и удалении белочной оболочки возможны значительные кровотечения, что делает невозможным дальнейшие исследования. Таким образом, эмбрион в возрасте 10 суток является наиболее адекватной и удобной моделью для изучения сосудов и их реакции на различные влияния.

Во время проведения теста раствор исследуемого вещества наносится на ХАО, и визуально оценивается степень повреждения сосудов. Например, в «Экспериментальном изучении гастропротекторной активности комбинированной лекарственной формы на основе облепихового масла» (Зацепина Е.Е. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.б.н., ВГМУ, 29.04.2008) оценка раздражающего действия бетулина проводилась с помощью теста на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона (ХЕТ-КАМ тест). Однако визуальная оценка эксперимента не позволяет точно и объективно интерпретировать результаты исследования.

Известно также использование ХЕТ-КАМ теста для оценки раздражающего действия композиций для лечения угрей и других заболеваний кожи (US 6168798, 2001). Тест проводился на 10-дневных куриных эмбрионах домашних кур породы белый леггорн. Перед началом эксперимента куриные эмбрионы инкубируют при 37,8-38,0°С в течение суток. Далее яйцо помещают на фиксирующую подставку. От скорлупы освобождают всю воздушную камеру, после чего поверхность подскорлуповой оболочки смачивают физиологическим раствором. После этого удаляют подскорлуповую оболочку так, чтобы не повредить ХАО, и наслаивают 400 мкл физиологического раствора для предотвращения высыхания. Изображение сосудов ХАО регистрировалось на протяжении 5 минут с контрольными точками 30 секунд, 2 минуты, 5 минут, после чего проводилась статистическая обработка данных. Известный способ коммерчески широко применим и соответствует современным этическим требованиям, однако его чувствительность недостаточна для оценки широкого круга веществ.

Технический результат, достигаемый при использовании настоящего изобретения, состоит в повышении точности ХЕТ-КАМ теста и объективности интерпретирования результатов исследования, универсальности применения теста для широкого круга препаратов, повышении экономичности, быстроте получения результатов и соответствии современным этическим требованиям, а также в возможности одновременной оценки биологического действия субстанций на сосуды хориоаллантоисной оболочки куриных эмбрионов.

Указанный результат достигается тем, что в способе оценки раздражающего действия и активности природных, синтетических субстанций и готовых препаратов на сосуды хориоаллантоисной оболочки куриных эмбрионов путем наслаивания исследуемого вещества на хориоаллантоисную оболочку 10-дневного куриного эмбриона и оценки повреждения сосудов оболочки, оценку проводят в динамике посредством ультразвуковой допплерографии, при этом ультразвуковой датчик первоначально располагают на поверхности хориоаллантоисной оболочки под углом к исследуемому венозному сосуду, а затем погружают вглубь белка к расположенным на желточном мешке артериям под углом к ним и получают венозную и артериальную допплерограммы соответственно, контрольное измерение проводят до наслаивания исследуемого вещества, а по полученным допплерограммам определяют линейную скорость кровотока Vs и частоту сердечных сокращений.

Предпочтительно для получения наиболее четко различимых изображений ультразвуковой датчик располагают на поверхности хориоаллантоисной оболочки под углом 60° к исследуемому венозному сосуду и под углом 60° к расположенным на желточном мешке артериям.

Данные гистологических исследований, проведенных в МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, показали, что на поверхности ХАО располагаются сосуды венозного типа, а на желточном мешке - артериального, что впоследствии было также подтверждено ультразвуковой допплерографией.

В ультразвуковой допплерографии основными процессами являются распространение и отражение ультразвуковых колебаний - если есть движение среды (кровотока), следовательно, есть допплеровский сигнал. С помощью ультразвукового сигнала возможен как визуальный, так и акустический контроль установки датчика в точке локации; определение по форме кривой типа сосудов (артериальный, венозный или смешанный), а по спектру - распределение частиц крови с разными скоростями движения, оценка направления кровотока. В предлагаемом способе степень прилегания датчика к сосуду не влияет на результат измерений, так как сигнал обеспечивается через контактную среду (физиологический раствор).

Одним из важнейших показателей функционирования как макро-, так и микрососудов является скорость кровотока. Скорость кровотока магистральных сосудов имеет большие перепады, а на более удаленных звеньях сердечно-сосудистой системы наблюдается снижение перепадов давления и более равномерное течение кровотока. Известно, что линейная скорость кровотока Vs прямо пропорциональна давлению крови, тем самым изменение скорости кровотока может являться свидетельством изменения кровяного давления. Таким образом, используя метод ультразвуковой допплерографии на сосудах ХАО 10-дневного куриного эмбриона, возможно проводить исследования биологической активности веществ, обладающих потенциальным гипер- или гипотензивным действием.

Предлагаемый способ применим для исследования образцов:

1. Водных, водно-спиртовых и масляных экстрактов растений.

2. Веществ с чистотой не менее 80% синтетического происхождения (БАД, фармпрепараты).

3. Веществ с чистотой не менее 80%, выделенных из природного сырья (БАД, фармпрепараты).

4. Продуктов питания (напитки, алкогольная продукция).

5. Масел и масляных композиций.

6. Средств гигиены полости рта.

7. Все вышеперечисленные позиции, полученные с применением нанотехнологий.

Для планирования эксперимента необходимы сведения о растворимости образца, стабильности раствора.

Исследуемые гидрофильные соединения растворяют в физиологическом растворе. Растворение гидрофобных соединений возможно с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) или 96%-ного этилового спирта. Допустимая концентрация ДМСО составляет 3,0%; этилового спирта - 5,0%. При исследовании гидрофильных соединений в качестве пассивного контроля используют физиологический раствор. При тестировании гидрофобных субстанций в качестве контроля применяют растворители, которые используют при растворении исследуемых субстанций.

В качестве активного контроля (референтного образца) используют растворы стандартных вазоконстрикторов или вазодилятаторов (например, норадреналин в концентрации 10^-11-10^-3 М, атенолол в концентрации 10^-5-10^-1 М).

Все исследуемые рабочие и контрольные растворы должны быть преинкубированы при температуре 37,8-38,0°С в течение 2 часов.

В экспериментах используются 10-дневные куриные эмбрионы домашних кур породы белый леггорн.

В качестве материально-технического обеспечения способа могут быть использованы ультразвуковые допплеровские сканеры типа «Минимакс-Допплер-К» фирмы «СП Минимакс» (Санкт-Петербург), оснащенный датчиком с частотой 25 МГц, и термостат с температурой 37,8-38,0°С.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед началом эксперимента куриные эмбрионы выдерживают в термостате при температуре 37,8-38,0°С в течение суток тупым концом вверх. Далее яйцо помещают на фиксирующую подставку тупым концом вверх, в центре которого начинают вскрытие. От скорлупы освобождают всю воздушную камеру, после чего поверхность подскорлуповой оболочки смачивают физиологическим раствором. После этого удаляют подскорлуповую оболочку так, чтобы не повредить ХАО, и наслаивают 400 мкл физиологического раствора (для предотвращения высыхания). Яйцо помещают в термостат на 20 мин для снятия травматического шока.

Если происходит повреждение ХАО или возникают кровотечения, то яйцо отбраковывается.

Следующим этапом является непосредственное допплерографическое исследование кровеносных сосудов ХАО куриных эмбрионов.

Выбрав наиболее крупный венозный сосуд на поверхности ХАО, датчик располагают так, чтобы он находился под углом 60° к исследуемому сосуду. Изменяя положение датчика, добиваются слабых по амплитуде, без острых пиков, пульсаций (медленно меняющаяся волна) допплерограмм, отображающихся на мониторе прибора.

Артериальные сосуды исследуют, погружая датчик вглубь белка, к располагающимся на желточном мешке артериям, также под углом 60°. При этом наблюдается остропиковая форма кривой (быстрая систола сердечных сокращений) и более пологая кривая (диастолическая скорость кровотока) допплерограмм, а также четко прослушивается восходящий и нисходящий звук, соответствующий пульсациям сосуда.

Допплерография проводится в динамике следующих промежутках времени: 0; 5; 10; 30 и 60 минут. Нулевая точка соответствует показателям, полученным после снятия травматического шока. По окончании каждого измерения яйцо помещают обратно в термостат.

В зависимости от целей исследования возможны три режима исследования.

I режим - моновоздействие:

0,4 мл раствора исследуемого вещества наносят на ХАО сразу после измерения показателей нулевой точки. Дальнейшие измерения проводят во временные промежутки, описанные ранее.

II режим - профилактический:

раствор исследуемого препарата наносят сразу после измерения показателей нулевой точки (без воздействия). Растворы стандартных вазоконстрикторов или вазодилятаторов наносят на 5 минуте (после проведения измерения). Далее проводят измерения в динамике.

III режим - лечебный:

раствор стандартного вазоконстриктора или вазодилятатора наносят на ХАО сразу после измерения показателей нулевой точки. Раствор исследуемого вещества - на 5 минуте после начала этой серии исследования (после измерения показателей). Далее проводятся измерения в динамике.

В медицинской практике для анализа допплерограмм существует множество индексов и показателей: линейная скорость кровотока Vs (см/сек), объемная скорость кровотока Qs (мл/сек), средневзвешенная скорость кровотока по огибающей Vam. Показатели объемной скорости кровотока (Qs и Vam) коррелируют с линейной скоростью кровотока Vs. Таким образом, для изучения влияния исследуемых веществ достаточно оценки одного из параметров.

Наиболее показательными и адекватными являются параметр Vs, относящийся к линейной скорости кровотока, определяемый по венозным допплерограммам; и частота сердечных сокращений, которая определяется по артериальным допплерограммам.

Линейная скорость находится в прямой зависимости от изменения артериального давления. Повышение давления приводит к усилению гемодинамики.

На допплерограмме венозного сосуда выбирается необходимый участок. На экране монитора ультразвукового сканера отображается измеряемый показатель Vs - максимальная систолическая скорость по кривой максимальной скорости (огибающей) (см/сек).

Частоту сердечных сокращений (ЧСС) вычисляют по количеству пиков на допплерограмме за 12 секунд. Таким образом проводят анализ допплерограмм, полученных в динамике, в течение всего эксперимента.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводят с помощью компьютерной программы Exel, при этом определяют следующие показатели: среднее арифметическое значение, стандартная ошибка.

Оценку раздражающего действия исследуемой субстанции вычисляют в процентах от начальной точки измерения по формулам:

Изменение скорости кровотока (%)=[(Vs)o-(Vs)n]/(Vs)o × 100%.

Изменение ЧСС (%)=[(ЧСС)о-(ЧСС)n]/(ЧСС)о × 100%,

где (Vs)o и (ЧСС)о - скорость кровотока и частота сердечных сокращений соответственно в нулевой точке измерения; (Vs)n и (ЧСС)n - скорость кровотока и частота сердечных сокращений соответственно в исследуемой точке измерения.

Далее приведены примеры исследования различных субстанций с использованием заявляемого способа. Результаты проведенных исследований представлены в таблицах.

Пример 1. Растительные экстракты.

Оценка влияния экстракта листа оливы на скорость кровотока в сосудах хориоалантоисной оболочки куриных эмбрионов.

Таблица 1.
Характеристика по скорости венозного кровотока.
Изменение скорости кровотока (в % от нулевой точки).
Группы	Время измерения, мин
	5	10	30	60
Контроль	-3,3±0,6	4,7±1,0	3,9±1,1	2,3±1,4
Экстракт оливы	-9,0±2,0	-13,5±3,6	-13,0±2,4	-10,7±1,7
НА	41,4±3,4	50,4±4,4	32,6±4,7	18,5±2,9
НА + Экстракт оливы	40,0±3,8	26,1±3,1	16,0±2,9	7,7±1,4
Экстракт оливы + НА	-9,1±2,0	16,7±4,2	10,4±3,2	5,6±2,6

Как видно из представленных данных, экстракт листа оливы снижает скорость венозного кровотока в среднем на 15-20% в течение 60 мин. При сочетанном применении с норадреналином (НА) отмечено протективное действие экстракта. Так, НА увеличивал скорость кровотока на 50% (10 мин наблюдения), при лечебном режиме применения экстракта листа оливы скорость кровотока снижалась на 25% относительно НА, а при профилактическом - на 35%.

Таблица 2.
Изменение частоты сердечных сокращений (в % от нулевой точки)
Группы	5	10	30	60
Контроль	-6,6±1,2	-15,1±1,9	-24,0±3,3	-28,8±3,9
Экстракт оливы	-10,1±3,2	-16,1±8,5	-18,6±3,9	-22,6±3,6
НА	2,5±3,2	-1,8±2,6	-10,1±3,2	-12,0±2,5
НА + Экстракт оливы	6,6±4,7	1,9±3,8	-12,4±3,8	-17,5±4,0
Экстракт оливы + НА	-4,2±1,9	-1,7±1,9	-5,8±2,5	-12,4±3,7

Частота сердечных сокращений под влиянием экстракта листа оливы практически не менялась. Полученные данные свидетельствуют о выраженном влиянии экстракта листа оливы на скорость кровотока, что позволяет предположить наличие гипотензивных свойств у этого экстракта.

Пример 2. Оценка влияния экстракта бадана на скорость кровотока в сосудах хориоалантоисной оболочки куриных эмбрионов.

Экстракт бадана, напротив, усиливал скорость венозного кровотока, однако оказывал также протективное действие на сосуды куриного эмбриона и при сочетанном применении с НА снижал скорость кровотока.

Учитывая тонизирующее действие экстракта бадана при моноприменении, было показано, что изменение частоты сердечных сокращений в группе, где применялся экстракт бадана, происходило медленнее, чем в контрольной группе.

Таблица 3.
Характеристика по скорости венозного кровотока
Изменение скорости кровотока (в % от нулевой точки).
Группы	Время наблюдений (мин)
	5	10	30	60
Контроль	-3,3±0,6	4,7±1,0	3,9±1,1	2,3±1,4
Экстракт бадана	15,4±2,9	12,9±1,6	6,1±2,2	5,5±2,9
НА	41,4±3,4	50,4±4,4	32,6±4,7	18,5±2,9
НА + Экстракт бадана	42,3±4,4	22,98±2,9	14,82±2,8	7,85±3,4
Таблица 4.
Изменение частоты сердечных сокращений (в % от нулевой точки)
Группы	5	10	30	60
Контроль	-6,6±1,2	-15,1±1,9	-24,0±3,3	-28,8±3,9
Экстракт бадана	-5,6±2,0	-12,4±2,3	-13,0±1,6	-13,5±3,4
НА	2,5±3,2	-1,8±2,6	-10,1±3,2	-12,0±2,5
НА + Экстракт бадана	10,3±3,5	4,2±3,4	-4,7±2,7	-9,5±2,2

Вещества, выделенные из растительных экстрактов.

Пример 3. В качестве примера представлены данные исследования влияния на скорость кровотока таксифолина (чистота 99,95%) и выделенных хроматографически 4-х фракций сушеницы.

Таблица 5.
Характеристика по скорости венозного кровотока
Изменение скорости кровотока (в % от нулевой точки).
	Время наблюдений, мин
Группы	5	10	30	60
Контроль	-3,6±2,2	3,2±1,6	4,3±1,1	2,8±1,6
Таксифолин	-1,2±0,7	-2,7±1,2	-5,6±1,9	-7,8±2,1
НА	42,6±2,3	48,5±4,1	33,1±4,3	18,4±2,9
НА + Таксифолин	42,1±3,8	32,2±4,4	17,5±3,1	12,0±3,1
Таксифолин + НА	-3,2±2,0	34,1±4,4	27,6±4,5	22,3±4,4

Представленные данные свидетельствуют о наличии у таксифолина гипотензивных свойств.

Таблица 6.
Изменение частоты сердечных сокращений (в % от нулевой точки)
Группы	Время наблюдений, мин
5	10	30	60
Контроль	-7,0±2,5	-13,0±1,1	-16,6±1,6	-17,8±3,1
Таксифолин	-6,4±2,9	-12,2±3,5	-16,6±4,2	-11,1±5,0
НА	8,1±2,0	-1,3±1,3	-3,1±1,3	-4,9±2,5
НА + Таксифолин	3,2±1,4	-2,8±1,7	-12,1±1,9	-16,9±3,1
Таксифолин + НА	-4,7±2,1	-2,7±1,4	-10,7±2,1	-10,7±4,9

Пример 4. Оценка влияния 4-х фракций сушеницы на скорость кровотока в сосудах хориоалантоисной оболочки куриных эмбрионов.

Таблица 7.
Характеристика по скорости венозного кровотока
Изменение скорости кровотока (в % от нулевой точки).
Группы	Время наблюдений, мин
5	10	30	60
Контроль	-3,3±0,6	4,7±1,0	3,9±1,1	2,3±1,4
Сушеница №1	-9,1±4,1	-8,1±3,5	-9,3±2,8	-7,8±2,3
Сушеница №2	-7,4±3,2	-7,3±3,2	-5,8±2,4	8,1±3,0
Сушеница №3	-6,0±2,1	-7,7±1,5	-6,1±3,2	5,5±1,8
Сушеница №4	-4,3±2,6	-6,9±2,6	-3,2±1,3	-5,1±2,0

Полученные данные свидетельствуют, что разные фракции сушеницы оказывают различное действие на скорость кровотока. Данный метод был использован для скрининга соединений, выделенных из сушеницы и обладающих потенциальным гипотензивным действием.

Таблица 8.
Изменение частоты сердечных сокращений (в % от нулевой точки).
Группы	Время наблюдений, мин
5	10	30	60
Контроль	-6,6±1,2	-15,1±1,9	-24,0±3,3	-28,8±3,9
Сушеница №1	-4,9±2,6	-12,4±4,8	-14,4±3,5	-17,1±4,6
Сушеница №2	-7,7±0,7	-18,1±1,3	-19,3±2,6	-16,0±3,2
Сушеница №3	-5,8±1,4	-9,6±1,1	-14,1±1,9	-9,3±3,4
Сушеница №4	-5,6±2,0	-11,0±2,0	-14,5±4,0	-15,6±3,5

Химически чистые вещества.

Пример 5. В качестве примера представлен стандартный вазоконстриктор - норадреналин. Его применяют также для моделирования повышенного давления, так как он стабильно усиливает скорость кровотока на 40% к 5 мин воздействия и на 50% - к 10 мин. Норадреналин также повышал частоту сердечных сокращений в эти же промежутки времени.

Таблица 9.
Характеристика по скорости венозного кровотока
Изменение скорости кровотока (в % от нулевой точки).
Группы	Время наблюдений, мин
	5	10	30	60
Контроль	-3,6±2,2	3,2±1,6	4,3±1,1	2,8±1,6
НА	42,6±2,3	48,5±4,1	33,1±4,3	18,4±2,9
Таблица 10.
Изменение частоты сердечных сокращений (в % от нулевой точки).
Группы	Время наблюдений, мин
	5	10	30	60
Контроль	-6,6±1,2	-15,1±1,9	-24,0±3,3	-28,8±3,9
НА	2,5±3,2	-1,8±2,6	-10,1±3,2	-12,0±2,5

Пример 6. Пищевая продукция.

Нами были исследованы энергетические напитки, экстракты зеленого чая и кофе различных сортов. Все исследуемые образцы оказывали влияние на скорость кровотока в большей или меньшей степени. Для примера представлены данные влияния на скорость кровотока энергетического напитка и кофе.

Оценка влияния энергетического напитка на скорость кровотока в сосудах хориоалантоисной оболочки куриных эмбрионов.

Таблица 11.
Характеристика по скорости венозного кровотока
Изменение скорости кровотока (в % от нулевой точки).
	Время наблюдений, мин
Группы	5	10	30	60
Контроль	-3,6±2,2	3,2±1,6	4,3±1,1	2,8±1,6
Энергетический напиток	36,0±3,2	16,8±3,3	14,7±3,4	7,4±3,5
НА	42,6±2,3	48,5±4,1	33,1±4,3	18,4±2,9
НА + Энергетический напиток	42,0±4,5	48,2±4,5	53,2±4,2	41,2±3,8

Как видно из представленных данных, энергетические напитки значительно усиливают скорость кровотока. Их действие сравнимо с действием норадреналина на 5 мин наблюдения. При моделировании повышенного давление (совместное действие с норадреналином) происходит потенциирование эффекта.

Таблица 12.
Изменение частоты сердечных сокращений (в % от нулевой точки).
Группы	Время наблюдений, мин
	5	10	30	60
Контроль	-7,0±2,5	-13,0±1,1	-16,6±1,6	-17,8±3,1
Энергетический напиток	-6,0±1,3	-12,7±1,3	-14,2±4,4	-12,7±1,4
НА	8,1±2,0	-1,3±1,3	-3,1±1,3	-4,9±2,5
НА + Энергетический напиток	11,1±3,8	-4,2±2,5	-12,4±4,5	-11,2±4,5

На частоту сердечных сокращений энергетически напиток практически не оказывает влияния.

Оценка влияния кофе (молотый) на скорость кровотока в сосудах хориоалантоисной оболочки куриных эмбрионов.

Таблица 13.
Характеристика по скорости венозного кровотока
Изменение скорости кровотока (в % от нулевой точки).
Группы	Время наблюдений, мин
5	10	30	60
Контроль	-3,9±0,2	3,7±1,4	3,1±1,4	1,9±0,7
НА	38,5±3,0	50,6±4,3	32,6±3,7	15,5±4,8
Кофе	8,5±3,9	10,3±1,5	10,0±2,7	8,9±2,0
НА + кофе	39,8±1,4	40,1±3,9	19,0±2,6	16,6±2,7
Кофе + НА	8,7±2,8	34,9±3,7	26,2±3,1	20,3±3,5
Таблица 14.
Изменение частоты сердечных сокращений (в % от нулевой точки)
Группы	Время наблюдений, мин
5	10	30	60
Контроль	-11,2±2,8	-13,8±3,9	-17,8±3,7	-18,4±5,9
НА	9,6±2,6	5,3±2,0	-3,5±2,1	-6,4±2,3
Кофе	-6,8±1,4	-8,2±1,5	-6,9±1,4	-9,2±1,5
НА + кофе	10,9±4,3	4,7±1,6	-2,9±1,8	-4,0±3,0
Кофе + НА	-5,8±1,3	4,4±1,9	-3,8±2,0	-6,4±2,3

Кофе повышает скорость кровотока приблизительно на 10% в течение 60 мин. При моделировании повышенного артериального давления кофе практически не повышает действие норадреналина. В тоже время кофе повышает частоту сердечных сокращений в сравнении с контрольной группой.

Пример 7. Глазные капли.

Нами было проведено исследование капель для глаз «Тауфон».

Таблица 15.
Характеристика по скорости венозного кровотока.
Изменение скорости кровотока (в % от нулевой точки).
Группы	Время наблюдений, мин
5	10	30	60
Контроль	-3,9±0,2	3,7±1,4	3,1±1,4	1,9±0,7
НА	38,5±3,0	50,6±4,3	32,6±3,7	15,5±4,8
Тауфон	-6,1±4,3	-3,8±2,9	-6,3±4,8	-9,4±4,8
НА + Тауфон	42,6±2,9	35,7±4,3	15,4±4,6	13,3±4,6
Тауфон + НА	-4,1±1,3	25,2±4,5	12,9±4,8	6,7±4,6
Таблица 16
Изменение частоты сердечных сокращений (в % от нулевой точки).
Группы	Время наблюдений, мин
5	10	30	60
Контроль	-11,2±2,8	-13,8±3,9	-17,8±3,7	-18,4±5,9
НА	9,6±2,6	5,3±2,0	-3,5±2,1	-6,4±2,3
Тауфон	-7,4±1,8	-9,7±1,8	-11,4±2,4	-11,3±2,8
НА + Тауфон	5,5±3,6	-2,2±1,1	-4,9±3,5	-6,7±2,8
Тауфон + НА	-9,3±4,6	-3,2±2,7	-9,9±4,7	-11,2±4,7

Глазые капли стабильно снижают скорость кровотока как при моноприменении, так и при моделировании повышенного артериального давления. Причем действие их в профилактическом режиме выражено сильнее. Такая же тенденция наблюдается и в отношении частоты сердечных сокращений.

Пример 8. Масляные эмульсии.

В качестве примера приведены исследования масляного раствора дигидрокверцетина (ДКВ).

Таблица 17.
Характеристика по скорости венозного кровотока
Изменение скорости кровотока (в % от нулевой точки).
Группы	Время наблюдений, мин
	5	10	30	60
Контроль	-3,6±2,2	3,2±1,6	4,3±1,1	2,8±1,6
Масло ДКВ 4%	-3,8±1,7	-3,9±1,4	-3,8±1,4	-5,4±2,5
Масло ДКВ 7%	-6,5±2,9	-5,9±2,6	-8,5±3,3	-10,8±3,9
Таблица 18.
Изменение частоты сердечных сокращений (в % от нулевой точки)
Группы	Время наблюдений, мин
	5	10	30	60
Контроль	-7,0±2,5	-13,0±1,1	-16,6±1,6	-17,8±3,1
Масло ДКВ 4%	-6,2±1,4	-6,7±3,2	-7,9±3,1	-7,3±2,5
Масло ДКВ 7%	-7,9±1,7	-8,4±2,8	-8,2±3,4	-8,6±4,0

Дигидрокверетин (ДКВ) в масляном растворе имеет более высокую биодоступность. Увеличение его концентрации в масле приводит к усилению гипотензивного действия ДКВ.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет оценивать влияние различных веществ синтетического и природного происхождения на скорость кровотока кровеносных сосудов.

1. Способ оценки раздражающего действия и активности природных, синтетических субстанций и готовых препаратов на куриных эмбрионах методом ультразвуковой допплерографии путем наслаивания исследуемого вещества на хориоаллантоисную оболочку 10-дневного куриного эмбриона и оценки сосудов оболочки, отличающийся тем, что оценку повреждения сосудов, скорости кровотока и частоты сердечных сокращений оболочки проводят в динамике посредством ультразвуковой допплерографии, при этом ультразвуковой датчик первоначально располагают на поверхности хориаллантоисной оболочки под углом к исследуемому венозному сосуду, а затем погружают вглубь белка к расположенным на желточном мешке артериям, под углом к ним, и получают венозную и артериальную допплерограммы, соответственно, контрольное измерение проводят до наслаивания исследуемого вещества, а по полученным допплерограммам определяют линейную скорость кровотока Vs и частоту сердечных сокращений и оценивают влияние вещества на скорость кровотока по их изменению.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ультразвуковой датчик располагают на поверхности хориоаллантоисной оболочки под углом 60° к исследуемому венозному сосуду и под углом 60° к расположенным на желточном мешке артериям.