Трансгенные копытные животные, имеющие пониженную активность прионного белка, и их применения

Трансгенные копытные животные, имеющие пониженную активность прионного белка, и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В общем случае, отличительным признаком изобретения являются клонированные трансгенные копытные животные (например, коровы), у которых активность прионного белка (PrP) снижена в результате одной или нескольких генетически сконструированных мутаций. Так как такие трансгенные коровы с пониженной активностью прионного белка должны быть резистентными к прионным заболеваниям, таким как губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (BSE, также известная как коровье бешенство), то они являются более безопасным и предпочтительным источником сельскохозяйственных и фармацевтических продуктов, таких как терапевтические антитела человека.

С момента обнаружения первого случая BSE в Великобритании в 1986 г. это инфекционное заболевание распространилось в другие части мира, например в Японию. Опасность этого заболевания сильно повлияла на сельскохозяйственную и фармацевтическую области и ограничила применение крупного рогатого скота в этих отраслях. На основании исследований, проведенных в последние десять лет, в качестве основной причины этого инфекционного заболевания был идентифицирован прионный белок. Желательны животные с пониженной активностью прионного белка, так как они, как полагают, будут обладать резистентностью к прионным заболеваниям.

До настоящего времени общеизвестными методами направленного воздействия на геном в эмбриональных стволовых (ЭС) клетках мышей, в которых возможна гомологичная рекомбинация, были созданы трансгенные мыши с пониженной активностью прионного белка. Однако сложно было получить, культивировать и генетически модифицировать ЭС клетки копытных животных, таких как крупный рогатый скот.

При создании нокаутированных по приону овец эмбриональные фибробласты трансфицировали нокаутирующим вектором, не содержащим промотора (KO), так как ген прионного белка очень активно экспрессируется в эмбриональных фибробластах (Denning et al., Nature Biotech., 19:559-562, 2001). Используя такой тип нокаутирующего вектора, можно отобрать гомологичные целенаправленно измененные клоны, используя соответствующее лекарственное средство, такое как G418 или пуромицин, так как не содержащий промотора ген лекарственной резистентности (например, ген резистентности к неомицину или пуромицину) в нокаутированном векторе может экспрессироваться только тогда, когда он интегрирован в активно экспрессируемые локусы генов. Однако переносом ядра из этих гемизиготных целенаправленно измененных фибробластов овцы был получен только один живой ягненок, и ягненок умер примерно через 12 дней после рождения. В отличие от мышиных ЭС клеток с неограниченной продолжительностью жизни соматические фибробласты имеют ограниченную продолжительность жизни, что делает трудным направленное воздействие на соматические гены из-за продолжительности времени, необходимого для культивирования клеток в условиях жесткой селекции лекарственным средством, чтобы отобрать желаемые нокаутированные клетки. Кроме того, в общем случае, частота гомологичной рекомбинации в соматических фибробластах примерно в 10-100 раз меньше, чем в мышиных ЭС клетках. Эти ограничения в отношении соматических фибробластов, кроме низкой доли успешных попыток при обычных способах ядерного переноса, затрудняли получение жизнеспособного крупного рогатого скота с желаемой сайт-специфической мутацией.

Предпринимались попытки уменьшить активность прионного белка у крупного рогатого скота путем направленного воздействия на геном. Насколько известно авторам, не сообщалось об успешном создании трансгенных коров с мутацией в прионном локусе, возможно, вследствие отсутствия соответствующих нокаутирующих векторов и/или способов ядерного переноса. Таким образом, необходимы улучшенные нокаутирующие векторы для получения мутаций в прионном локусе в клетках копытных животных (например, клетках коровы) с высокой эффективностью. Кроме того, требуются усовершенствованные способы создания трансгенных копытных животных (например, коров) из указанных генетически модифицированных донорных клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Признаком данного изобретения является конструирование нокаутирующих векторов, с помощью которых можно с высокой частотой осуществить гемизиготную или гомозиготную направленную интеграцию (так называемую гомологичную рекомбинацию) в прионный локус копытных животных (например, коров) в клетки доноров, такие как соматические фибробласты плода. Отличительным признаком изобретения также являются способы получения живых телят, имеющих гемизиготную или гомозиготную мутацию в прионном локусе, с использованием генетически модифицированных клеток донора в любом из способов переноса ядер, описанных здесь. Такой крупный рогатый скот может использоваться для получения фармацевтических и сельскохозяйственных продуктов, таких как терапевтические антитела человека для использования человеком.

Способ по настоящему изобретению осуществляют с использованием нескольких методик, таких как (i) методика получения клеток, нокаутированных по гену, кодирующему прион, описанная здесь, (ii) способы клонирования млекопитающих, такие как перенос ядра или перенос хроматина, описанные в публикации PCT No. WO02/051997, и (iii) введение искусственной хромосомы человека (HAC), такой как дельта-HAC, копытным животным (публикация PCT No. WO02/70648; Kuroiwa et al., Nature Biotechnol. 20: 889-894, 2002). Нокаутированную по приону клетку копытного животного используют в качестве источника донорного генетического материала в способе клонирования млекопитающих, получая нокаутированное по приону (геми- или гомо-) потомство.

Нокаутированные по приону копытные животные также могут обладать другим полезным свойством, таким как продукция антитела человека. Такие копытные животные могут быть созданы, используя сочетание указанных выше методик. Например, нокаутированное по приону и продуцирующее антитело человека животное может быть создано путем кроссбридинга нокаутированного по приону копытного животного и продуцирующего антитела человека копытного животного, как описано в публикации PCT No. WO02/70648. Последующую обработку эмбриональных фибробластов также можно использовать для создания такого копытного животного с или без скрещивания копытных животных. Последующая обработка эмбриональных фибробластов теленка включает повторение следующих стадий: (i) генетическая обработка фибробластов копытного животного (например, коров), (ii) клонирование млекопитающего, используя эти клетки, (iii) образование плода и (iv) выделение генетически модифицированного эмбрионального фибробласта. Например, нокаутированный по приону фибробласт может быть затем обработан для сохранения HAC и для инактивирования эндогенных генов Ig.

Полученные моноклональные или поликлональные ксеногенные антитела могут иметь различное применение; например, их можно использовать в качестве ингредиентов в профилактических или терапевтических композициях против инфекции патогенными микроорганизмами, такими как бактерии или вирусы.

Трансгенные копытные животные и клетки копытных

В одном из аспектов изобретение относится к копытному животному (например, корове) или к клетке копытного животного (например, клетке коровы), имеющей неприродную мутацию (например, мутацию после кодона инициации ATC, такую как мутация в 10, 20, 50 или 100 нуклеотидах этого кодона) в одном или обоих аллелях эндогенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок. Предпочтительно, мутация снижает или по существу исключает экспрессию функционального прионного белка. В предпочтительных вариантах осуществления экспрессия функциональной части или всего прионного белка снижается по меньшей мере на 10, 20, 40, 60, 80, 90, 95 или 100%. Мутация может быть гемизиготной или гомозиготной. В некоторых вариантах осуществления мутация включает инсерцию маркера для позитивной селекции (например, ген устойчивости к антибиотику) в нуклеиновую кислоту приона. Предпочтительно, маркер для позитивной селекции оперативно связан с ксеногенным промотором. В случае копытных животных или клеток копытного животного с геном устойчивости к антибиотику, встроенным в оба аллеля нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок, каждая аллель может содержать один и тот же или разные гены устойчивости к антибиотику. В предпочтительном варианте осуществления маркер негативной селекции (например, DT-A или Tk) оперативно связан с ксеногенным промотором и присутствует в векторе, используемом для мутирования эндогенного аллеля приона. Мутация может содержать или не содержать делецию одного или нескольких нуклеотидов (например, следующих друг за другом нуклеотидов) в нуклеиновой кислоте приона.

В предпочтительных вариантах осуществления указанного выше аспекта копытное животное (например, корова) или клетка копытного животного (например, клетка коровы) имеет один или несколько трансгенов и экспрессирует мРНК или белок (например, антитело), кодируемые трансгеном(ами). Предпочтительные копытные животные содержат природные участки хромосом человека (например, фрагменты хромосом человека) или искусственные хромосомы, которые содержат искусственно сконструированные фрагменты хромосом человека (т.е. фрагменты могут быть перегруппированы относительно генома человека). В некоторых вариантах осуществления в фрагменте хромосомы находится ксеногенная нуклеиновая кислота. Нуклеиновая кислота может быть интегрирована в хромосому копытного животного или может сохраняется в клетке копытного животного независимо от хромосомы хозяина. В различных вариантах осуществления нуклеиновая кислота находится в фрагменте хромосомы, таком как ΔHAC или ΔΔHAC. В других вариантах осуществления ксеногенным антителом является антитело другого рода, например антитело человека.

Предпочтительные копытные животные и клетки копытных животных имеют одну или несколько нуклеиновых кислот, содержащих локус гена ксеногенного антитела (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую весь или часть ксеногенного гена иммуноглобулина (Ig), который подвергнут перестройке и экспрессирует по меньшей мере одну молекулу ксеногенного Ig) в одной или нескольких B-клетках. Предпочтительно, нуклеиновая кислота содержит не подвергнутые перестройке участки нуклеиновой кислоты легкой цепи антитела, в которой все участки нуклеиновой кислоты, кодирующие V-сегмент гена, отделены от всех участков нуклеиновой кислоты, кодирующих J-сегмент гена, одним или несколькими нуклеотидами. Другие предпочтительные нуклеиновые кислоты содержат не подвергнутые перестройке участки нуклеиновой кислоты тяжелой цепи антитела, в которых либо (i) все участки нуклеиновой кислоты, кодирующие V-сегмент гена, отделены от всех участков нуклеиновой кислоты, кодирующих D-сегмент гена, одним или несколькими нуклеотидами и/или (ii) все участки нуклеиновой кислоты, кодирующие D-сегмент гена, отделены от всех участков нуклеиновой кислоты, кодирующих J-сегмент гена, одним или несколькими нуклеотидами. Другие предпочтительные копытные животные имеют одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих весь или часть подвергнутого перестройке ксеногенного гена иммуноглобулина (Ig), который экспрессирует по меньшей мере одну ксеногенную молекулу Ig.

В других предпочтительных вариантах осуществления легкая цепь и/или тяжелая цепь ксеногенных антител кодируется нуклеиновой кислотой человека. В предпочтительных вариантах осуществления тяжелая цепь относится к любому классу тяжелой цепи, такому как μ, γ, δ, ε или α, и легкая цепь является легкой цепью лямбда или каппа. В других предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая ксеногенную цепь иммуноглобулина или антитело, находится в своей не подвергнутой перестройке форме. В других предпочтительных вариантах осуществления копытное животное продуцирует более одного класса ксеногенного антитела. В различных вариантах осуществления копытное животное продуцирует более чем один различный ксеногенный Ig или антитело. Ксеногенное антитело может быть поликлональным или моноклональным антителом.

В различных вариантах осуществления указанного выше аспекта копытное животное (например, корова) или клетка копытного животного (например, клетка коровы) имеет мутацию, которая снижает экспрессию эндогенного антитела. Предпочтительно, мутация снижает экспрессию функциональной части тяжелой цепи IgM или по существу исключает экспрессию функциональной части тяжелой цепи IgM. В других предпочтительных вариантах осуществления мутация снижает экспрессию функциональной части легкой цепи Ig или по существу исключает экспрессию функциональной части легкой цепи Ig. В еще других предпочтительных вариантах осуществления мутация снижает экспрессию функциональной части тяжелой цепи IgM и функциональной части легкой цепи Ig или мутация по существу исключает экспрессию функциональной части тяжелой цепи IgM и функциональной части легкой цепи Ig. Предпочтительно, копытное животное также имеет мутацию в одном или обоих аллелях эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей альфа-(1,3)-галактозилтрансферазу и/или J-цепь. В других предпочтительных вариантах осуществления копытное животное имеет нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную J-цепь, такую как J-цепь человека. Предпочтительно, мутация снижает или исключает экспрессию эндогенного фермента альфа-(1,3)-галактозилтрансферазы, эпитопа галактозил(α1,3)галактозы и/или J-цепи. Предпочтительно, копытное животное продуцирует молекулы IgA или IgM человека, содержащие J-цепь человека. К предпочтительным клеткам копытного животного (например, клетки коровы) относятся соматические клетки, такие как эмбриональные фибробласты или B-клетки.

Изобретение также относится к гибридомам, которые продуцируют ксеногенные (например, человеческие) антитела. В одном из таких аспектов изобретение относится к гибридоме, полученной слиянием B-клетки по изобретению с миеломной клеткой. Предпочтительно, антитело взаимодействует с интересующим антигеном.

Способы получения трансгенных клеток копытных животных

Признаком изобретения также являются способы создания клеток копытных животных (например, клеток коровы) с мутацией в одном или обоих аллелях нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок. Эти клетки можно использовать в качестве донорных клеток для создания трансгенных копытных животных (например, нокаутированных по приону копытных животных, относящихся к крупному рогатому скоту). Предпочтительно, мутация приводит к снижению количества функциональной части прионного белка и/или к снижению частоты возникновения прионных заболеваний или заболеваний, таких как BSE.

Таким образом, в одном из таких аспектов признаком изобретения является способ получения трансгенного копытного животного (например, коровы). Этот способ заключается во введении первого вектора, который направленно воздействует на кодирующий прионный белок ген, в клетку копытного животного в условиях, при которых возможна гомологичная рекомбинация между первым вектором и первым аллелем эндогенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок в клетке, с введением, таким образом, гемизиготной мутации в клетку. Предпочтительно, первый вектор содержит первую гомологичную область с последовательностью, по существу идентичной первой области эндогенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок клетки, маркер позитивной селекции и вторую гомологичную область, имеющую последовательность по существу идентичную второй области нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок. В предпочтительном варианте осуществления одна гомологичная область по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 8 тысяч пар оснований длиннее, чем другая гомологичная область. Предпочтительно, способ также включает в себя повторное введение первого вектора в клетку в условиях, при которых может осуществляться гомологичная рекомбинация между первым вектором и вторым аллелем эндогенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок в клетке, с введением, таким образом, гомозиготной мутации в клетку. В других вариантах осуществления способ также включает в себя введение в клетку второго вектора, мишенью которого является кодирующий прионный белок ген, который имеет другой ген устойчивости к антибиотику, отличный от гена первого вектора, в условиях, при которых возможна гомологичная рекомбинация между вторым вектором и вторым аллелем эндогенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок в клетке, с введением, таким образом, гомозиготной мутации в клетку. Предпочтительно, первый и/или второй вектор вводят в клетку в присутствии 1 мМ спермидина. Предпочтительные клетки включают эмбриональные фибробласты коров.

В различных вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота, используемая для мутирования эндогенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок (например, нокаутирующая кассета, которая содержит промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей селектируемый маркер, и оперативно связанный с нуклеиновой кислотой по существу идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей прионный белок), содержится не в вирусном векторе, таком как аденовирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса. Например, нуклеиновая кислота может содержаться в плазмиде или искусственной хромосоме, которую встраивают в клетку копытного животного, используя стандартный способ, такой как трансфекция или липофекция, в котором не используется вирусное инфицирование клетки. В еще одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, используемая для мутирования эндогенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок (например, нокаутирующая кассета, которая содержит промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей селектируемый маркер, и оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, по существу идентичной последовательности с кодирующей прионный белок нуклеиновой кислотой) находится в вирусном векторе, таком как аденовирусный вектор или вектор на основе аденоассоциированного вируса. Согласно такому варианту осуществления вирус, содержащий вирусный вектор, используют для инфицирования клетки копытного животного, что приводит к инсерции части или всего вирусного вектора в клетку копытного животного.

Способы получения трансгенных копытных животных

Изобретение также относится к способам получения трансгенных копытных животных с одной или несколькими мутациями в эндогенных кодирующих прионный белок нуклеиновых кислотах. Один из таких способов заключается во встраивании клетки согласно любому указанному выше аспекту изобретения, хроматиновой массы клетки или ядра клетки в ооцит. Клетка имеет первую мутацию в эндогенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует прионный белок. Ооцит или эмбрион, образованный из ооцита, переносят в матку копытного животного-хозяина в условиях, при которых возможно развитие ооцита или эмбриона в плод. Предпочтительно, плод развивается в жизнеспособного потомка.

В предпочтительных вариантах осуществления первую мутацию вводят в клетку путем встраивания нуклеиновой кислоты, содержащей кассету, которая включает в себя промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей селектируемый маркер, и оперативно связанный с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами по существу идентичной последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей прионный белок, при этом кассета интегрируется в один эндогенный аллель нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок. В других предпочтительных вариантах осуществления мутацию вводят в клетку путем встраивания в клетку нуклеиновой кислоты, содержащей первую кассету, которая включает в себя первый промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей первый селектируемый маркер, и оперативно связанный с первой нуклеиновой кислотой, по существу идентичной последовательности эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей прионный белок, при этом первая кассета интегрируется в первый эндогенный аллель нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок, с образованием первой трансгенной клетки. В первую трансгенную клетку встраивают нуклеиновую кислоту, которая содержит вторую кассету, которая включает в себя второй промотор, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей второй селектируемый маркер, и оперативно связанный со второй нуклеиновой кислотой, по существу идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей прионный белок. Второй селектируемый маркер отличается от первого селектируемого маркера, и вторая кассета интегрируется во второй эндогенный аллель нуклеиновой кислоты, которая кодирует прионный белок, с образованием второй трансгенной клетки.

В других предпочтительных вариантах осуществления клетку выделяют из эмбриона, плода или потомка, развившегося из плода, и вводят другую мутацию в нуклеиновую кислоту, которая кодирует прионный белок, или другую нуклеиновую кислоту (например, нуклеиновую кислоту тяжелой или легкой цепи антитела) клетки. Затем осуществляют второй раунд переноса ядер, используя полученную клетку, хроматиновую массу клетки или ядро клетки, с получением трансгенного копытного животного с двумя или более мутациями. Мутации находятся в одном и том же или разных аллелях гена или в разных генах. Клетка, используемая в первом или, необязательно, втором раунде переноса ядер, кодирует ксеногенное антитело. В конкретных вариантах осуществления клетка содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих весь или часть ксеногенного гена Ig, которая способна перестраиваться и экспрессировать одну или несколько ксеногенных молекул Ig в B-клетках. В предпочтительных вариантах осуществления клетка, которую подвергают мутациям, является фибробластом (например, эмбриональным фибробластом). Предпочтительно, мутируемый эндогенный ген оперативно связан с эндогенным промотором, который не активен в фибробластах. В других предпочтительных вариантах осуществления эндогенный промотор, оперативно связанный с мутируемым эндогенным геном, активен менее чем на 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10% по сравнению с эндогенным промотором, оперативно связанным с эндогенным геном домашнего хозяйства, таким как GAPDH. Активность промотора можно измерить, используя любой стандартный анализ, такой как анализ, в котором измеряют уровень мРНК или белка, кодируемого геном (смотри, например, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, volume 2, p. 11.13.1-11.13.3, John Wiley and Sons, 1995). Преимуществом этого способа создания трансгенного копытного животного является возможность мутации гена, который не экспрессируется в донорной клетке (т.е. клетке, которая является источником генетического материала, используемого для переноса ядра).

Предпочтительно, клетка, используемая для получения трансгенного копытного животного, имеет мутацию в одном или обоих аллелях эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей альфа-(1,3)-галактозилтрансферазу и/или J-цепь. В других предпочтительных вариантах осуществления клетка содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую экзогенную J-цепь, такую как J-цепь человека, или нуклеиновую кислоту, кодирующую ксеногенное антитело. Предпочтительно, ксеногенная нуклеиновая кислота кодирует весь или часть ксеногенного гена Ig, и ген способен перестраиваться и экспрессировать более одной ксеногенной молекулы Ig в B-клетках. В других предпочтительных вариантах осуществления антитело является поликлональным антителом. В следующих предпочтительных вариантах осуществления цепь иммуноглобулина или антитело экспрессируются в сыворотке и/или молоке.

Авторами ранее были описаны некоторые улучшенные способы клонирования млекопитающих (например, копытных животных, таких как коровы), которые можно использовать для клонирования млекопитающих с одной или несколькими мутациями в нуклеиновой кислоте, которая кодирует прионный белок (смотри, например, публикацию патента США No. 2002-0046722 A1 и публикацию PCT No. WO02/051997). В некоторых из этих способов пермеабилизованную клетку инкубируют в средах для перепрограммирования (например, в клеточном экстракте) для добавления или удаления факторов из клетки и затем плазматическую мембрану пермеабилизованной клетки снова делают непроницаемой, чтобы сохранить внутри желаемые факторы и восстановить целостность мембраны клетки. Некоторые из этих способов также включают в себя конденсацию донорного ядра (например, изолированного ядра или ядра в пределах донорной клетки) в хроматиновую массу для обеспечения высвобождения ядерных компонентов, таких как факторы транскрипции, которые могут обеспечить транскрипцию генов, которые нежелательны для развития эмбриона с ядерным трансплантатом в жизнеспособное потомство. При желании стадии любого из этих способов можно повторять один или несколько раз или можно последовательно осуществлять различные способы перепрограммирования, чтобы повысить степень перепрограммирования, что приводит к большей выживаемости клонированных плодов.

Один из способов создания трансгенного копытного животного (например, коровы) заключается в инкубировании пермеабилизованной клетки согласно любому из указанных выше аспектов изобретения (например, клетки, которая имеет одну или несколько мутаций в эндогенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует прионный белок) в среде для перепрограммирования (например, в клеточном экстракте) в условиях, при которых происходит удаление фактора (например, ядерного или цитоплазматического компонента, такого как фактор транскрипции) из ядра, хроматиновой массы или хромосомы пермеабилизованной клетки или добавление фактора в ядро, хроматиновую массу или хромосому с образованием, таким образом, перепрограммированной клетки. Перепрограммированную клетку вводят в ооцит с удаленным ядром и полученный ооцит или эмбрион, образованный из ооцита, переносят в матку копытного животного-хозяина в условиях, при которых возможно развитие ооцита или эмбриона в плод. В предпочтительных вариантах осуществления пермеабилизованная клетка взаимодействует с одним или несколькими из следующих факторов в условиях, при которых возможно образование хроматиновой массы: экстрактом митотических клеток в присутствии или отсутствии анти-NuMA-антитела, раствором детергента и/или соли или раствором протеинкиназы. В еще одном предпочтительном варианте осуществления пермеабилизованную клетку инкубируют в интерфазных средах для перепрограммирования (например, в экстракте интерфазных клеток). В еще одном предпочтительном варианте осуществления ядро в пермеабилизованной клетке остается связанным с мембраной, и хромосомы в ядре не подвергаются конденсации во время инкубирования с интерфазными средами для перепрограммирования. В некоторых вариантах осуществления инкубация пермеабилизованной клетки в средах для перепрограммирования не вызывает репликации ДНК или вызывает репликацию ДНК только в менее чем 50, 40, 30, 20, 10 или 5% клеток. В других вариантах осуществления инкубация пермеабилизованной клетки в средах для перепрограммирования вызывает репликацию ДНК по меньшей мере в 60, 70, 80, 90, 95 или 100% клеток. В различных вариантах осуществления клетку пермеабилизуют путем инкубирования интактной клетки с протеазой, такой как трипсин, детергентом, таким как дигитонин, или бактериальным токсином, таким как стрептолизин O. В предпочтительном варианте осуществления перепрограммированную клетку не инкубируют в условиях, при которых мембрана перепрограммированной клетки может снова стать непроницаемой перед введением в ооцит. В еще одном варианте осуществления перепрограммированную клетку инкубируют в условиях, при которых мембрана перепрограммированной клетки может снова стать непроницаемой перед введением в ооцит. В других предпочтительных вариантах осуществления реконструированный ооцит или полученный эмбрион экспрессирует ламин A, ламин C или белок NuMA на уровне, который менее чем в 5 раз превосходит соответствующий уровень, экспрессируемый контрольным ооцитом или контрольным эмбрионом с таким же количеством клеток и из того же самого вида.

В другом аспекте изобретение относится к другому способу создания трансгенного копытного животного (например, коровы). Этот способ включает в себя (a) инкубирование донорного ядра из клетки согласно изобретению (например, ядра, которое имеет одну или несколько мутаций в эндогенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует прионный белок) в условиях, при которых возможно образование хроматиновой массы, не вызывая репликацию ДНК, (b) введение хроматиновой массы в лишенный ядра ооцит с образованием, таким образом, ооцита с перенесенным ядром и (c) перенос ооцита с перенесенным ядром или эмбриона, образованного из ооцита с перенесенным ядром, в матку копытного животного-хозяина в условиях, при которых возможно развитие ооцита с перенесенным ядром или эмбриона в плод. В предпочтительном варианте осуществления донорное ядро инкубируют в средах для перепрограммирования (например, в клеточном экстракте) в условиях, при которых возможно добавление или удаление из ядра или полученной хроматиновой массы ядерных или цитоплазматических компонентов, таких как факторы транскрипции, белки-репрессоры или ремоделирующие белки хроматина. Предпочтительно, донорное ядро контактирует с одним или несколькими из следующих факторов в условиях, при которых возможно образование хроматиновой массы: экстракт митотической клетки в присутствии или отсутствии анти-NuMA-антитела, раствор детергента и/или соли или раствор протеинкиназы. В других предпочтительных вариантах осуществления реконструированный ооцит или полученный эмбрион экспрессирует ламин A, ламин C или белок NuMA на уровне, который менее чем в 5 раз превосходит уровень, экспрессируемый контрольным ооцитом или контрольным эмбрионом с таким же количеством клеток и из того же самого вида. Предпочтительно, ядро имеет менее четырех наборов гомологичных хромосом (т.е. имеет менее двух пар полных хроматид).

Предпочтительные способы создания химерных копытных животных

Другие предпочтительные копытные животные являются химерными копытными животными, полученными с использованием клеток от двух или более эмбрионов. Например, клетки из эмбриона с перенесенным ядром (например, эмбриона, образованного введением клетки, ядра или хроматиновой массы в лишенный ядра ооцит) могут быть объединены с клетками из эмбриона, оплодотворенного in vitro, природного эмбриона или партеногенетически активированного эмбриона. Предпочтительно, большинство клеток и их потомство из эмбриона с перенесенным ядром введены в ткань плода полученного химерного эмбриона. По меньшей мере некоторые клетки и их потомство из второго эмбриона, предпочтительно, введены в плацентарную ткань и способствуют выживаемости полученного химерного эмбриона. В предпочтительных вариантах осуществления эмбрион с перенесенным ядром имеет мутацию в эндогенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует прионный белок, и имеет нуклеиновую кислоту, кодирующую ксеногенное антитело.

Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к способу получения трансгенного копытного животного путем введения клетки, ядра или хроматиновой массы по изобретению (например, клетки, ядра или хроматиновой массы, имеющей мутацию в эндогенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует прионный белок и, необязательно, содержащей одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих ксеногенное антитело) в ооцит с образованием, таким образом, первого эмбриона. Одну или несколько клеток первого эмбриона подвергают взаимодействию с одной или несколькими клетками из второго эмбриона с образованием, таким образом, третьего эмбриона. Второй эмбрион является оплодотворенным in vitro эмбрионом, природным эмбрионом или партеногенетически активированным эмбрионом. Третий эмбрион переносят в матку копытного животного-хозяина в условиях, при которых возможно развитие третьего эмбриона в плод.

В другом родственном аспекте изобретение относится к другому способу создания трансгенного копытного животного (например, коровы). Этот способ заключается в инкубировании пермеабилизованной клетки согласно изобретению (например, клетки, имеющей мутацию в эндогенной кодирующей прионный белок нуклеиновой кислоте и, необязательно, содержащей одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих ксеногенное антитело) в средах для перепрограммирования (например, клеточном экстракте) в условиях, при которых возможно удаление фактора ядра, хроматиновой массы или хромосомы пермеабилизованной клетки или добавление фактора из сред для перепрограммирования в ядро, хроматиновую массу или хромосому с образованием, таким образом, перепрограммированной клетки. Перепрограммированную клетку вводят в лишенный ядра ооцит с образованием, таким образом, первого эмбриона. Одну или несколько клеток из первого эмбриона подвергают взаимодействию с одной или несколькими клетками из оплодотворенного in vitro эмбриона, природного эмбриона или партеногенетически активированного второго эмбриона, образуя третий эмбрион. Третий эмбрион переносят в матку копытного животного-хозяина в условиях, при которых возможно развитие третьего эмбриона в плод.

В предпочтительном варианте осуществления пермеабилизованную клетку инкубируют в среде для перепрограммирования (например, в клеточном экстракте) в условиях, при которых возможно добавление или удаление из ядра или полученной хроматиновой массы ядерных или цитоплазматических компонентов, таких как факторы транскрипции. В других предпочтительных вариантах осуществления проводят взаимодействие пермеабилизованной клетки с одним или несколькими из следующих факторов в условиях, при которых возможно образование хроматиновой массы: экстрактом митотических клеток в присутствии или отсутствии анти-NuMA-антитела, раствором детергента и/или соли или раствором протеинкиназы. В еще одном предпочтительном варианте осуществления пермеабилизованную клетку инкубируют в интерфазных средах для перепрограммирования (например, в экстракте интерфазных клеток). В еще одном предпочтительном варианте осуществления ядро в пермеабилизованной клетке остается связанным с мембраной, и хромосомы в ядре не подвергаются конденсации во время инкубирования в интерфазных средах для перепрограммирования. В некоторых вариантах осуществления инкубирование пермеабилизованной клетки в средах для перепрограммирования не вызывает репликации ДНК или вызывает репликацию ДНК только в менее чем 50, 40, 30, 20, 10 или 5% клеток. В других вариантах осуществления инкубирование пермеабилизованной клетки в средах для перепрограммирования вызывает репликацию ДНК по меньшей мере в 60, 70, 80, 90, 95 или 100% клеток. В различных вариантах осуществления клетку пермеабилизуют при инкубировании интактной клетки с протеазой, такой как трипсин, детергентом, таким как дигитонин, или бактериальным токсином, таким как стрептолизин O. В предпочтительном варианте осуществления перепрограммируемую клетку не инкубируют в условиях, при которых мембрана перепрограммированной клетки снова может стать непроницаемой перед введением в ооцит. В еще одном варианте осуществления перепрограммированную клетку инкубируют в условиях, при которых мембрана перепрограммированной клетки снова может стать непроницаемой перед введением в ооцит.

В следующих вариантах осуществления копытное животное создают в результате контактирования донорного ядра из клетки согласно изобретению (например, ядра, имеющего мутацию в эндогенной нуклеиновой кислоте, которая кодирует прионный белок, и, необязательно, содержащего одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих ксеногенное антитело) в среде для перепрограммирования (например, в клеточном экстракте) в условиях, при которых возможно образование хроматиновой массы, и введения хроматиновой массы в лишенный ядра ооцит с образованием, таким образом, первого эмбриона. Одну или несколько клеток из первого эмбриона подвергают взаи