Экстракт piper laetispicum c.dc., способ его получения и применение

Экстракт piper laetispicum c.dc., способ его получения и применение

Реферат

Область техники

Данное изобретение касается лекарственного растения Piper Laetispicum C.DC., в частности, описан способ получения экстракта Piper Laetispicum C.DC., экстракт, полученный посредством указанного способа, а также применение данного экстракта.

Предпосылки изобретения

На сегодняшний день заболевания, связанные с нарушением обмена медиаторов моноаминов, таких как серотонин (5-НТ), норадреналин (NA), дофамин (DA) и др., стали одними из основных заболеваний, подрывающих здоровье человечества. В соответствии с данными Всемирной Организации Здравоохранения, в развитых странах общая численность заболеваний, вызванных данным фактором, уступает только коронарным. В Китае же нервно-психические заболевания по своей численности занимают первое место и составляют около 1/5 всех заболеваний по стране. Так, целый ряд медицинских и социологических исследований показывает, что на сегодняшний день наблюдается высокий процент пациентов, страдающих от депрессии и тревожного расстройства. В ходе общего медицинского обследования в Соединенных Штатах Америки было выявлено, что 17,3% населения страдали от приступов депрессии, а 24,5% на том или ином этапе своей жизни переживали тревожные расстройства. Все указанные исследования однозначно свидетельствуют о том, что в ближайшем будущем еще большее количество людей может столкнуться с проблемами синдрома повышенной тревожности и депрессии. При этом в некоторых социальных группах (например, у лиц с физическими недостатками, у страдающих хроническими заболеваниями, а также злоупотребляющих лекарственными средствами, страдающих от алкогольной зависимости, у одиноких людей) наблюдается повышенный уровень заболеваемости, а также повышенная предрасположенность к заболеваниям, связанным с нарушением обмена медиаторов моноаминов, таких как серотонин, норадреналин, дофамин и др. По мере все возрастающего процесса старения населения земного шара наблюдается процентный рост численности психических заболеваний среди пожилых людей, при этом особенно необходимо выделить такие, как старческое слабоумие, депрессия и/или тревожные расстройства.

Группы больных, страдающих указанными заболеваниями, будучи не в состоянии радикально излечиться от этих недугов, уже давно сформировали колоссальный по своим масштабам потребительский рынок ингибиторов обратного поглощения серотонина/норадреналина/дофамина.

Если говорить о новейших исследованиях, касающихся применения Piper Laetispicum C.DC., то можно встретить лишь небольшие специализированные статьи в области биологии относительно применения данного растения в изданиях «Растения Китая», «Деревья и травы Китая» (издание 2000 года). Так, в издании «Деревья и травы Китая» можно найти следующее описание: «Данное лекарственное растение обладает мягкими свойствами, имеет резкий запах, применяется для активизации кровообращения, устранения отечности, снятия боли. В основном используется при лечении травм от падений и ушибов, при застое крови, опухолях, боли. Настой указанного лекарственного средства готовится на водяной бане или приготавливается на спирту…».

В результате многолетних систематических исследований авторам настоящего изобретения удалось опытным путем выявить ярко выраженную антидепрессантную активность экстракта данного растения, а также определенную успокаивающую, седативную и обезболивающую биологическую активность препаратов из этого растения.

Ранее изобретатели уже принимали участие в подаче двух других заявок на получение патента КНР на изобретения, относящиеся к растению Piper Laetispicum C.DC. В первой заявке (№00119452.6) раскрыт способ применения Piper Laetispicum C.DC. и его экстракта для приготовления фармацевтической смеси. Во второй заявке описан один из способов получения экстракта из частей лекарственных растения Piper Laetispicum C.DC. Экстракт, полученный описанным в ней способом, может применяться для лечения и профилактики депрессии, а также других заболеваний, связанных с эмоциональными нарушениями.

Однако в ходе последующих исследований было отмечено, что ректификационный способ, применявшийся ранее в процессе экстрагирования, довольно затруднителен, поскольку требует выполнения целого ряда сложных и продолжительных по времени операций, таких как подогрев, фильтрация, обогащение (концентрация) и т.д. И что еще более существенно, при получении экстракта ректификационным методом наблюдается высокий процент потери полезных компонентов растения, что является причиной недостаточно высокого уровня фармакологической активности и безопасности экстракта. В связи с изложенными причинами возникла необходимость усовершенствования способа получения экстракта.

Задача изобретения

Основной задачей данного изобретения является восполнение недостатков предыдущего способа, применявшегося ранее для приготовления экстракта Piper Laetispicum C.DC. Усовершенствованный высокоэффективный способ приготовления экстракта Piper Laetispicum C.DC. не только позволит избежать разрушения активных компонентов, обусловленного высокотемпературным нагреванием препарата в процессе экстрагирования, но и поможет значительно упростить технологию приготовления экстракта, сделает способ приготовления удобным и доступным.

Еще одной задачей данного изобретения является обеспечение экстракта Piper Laetispicum C.DC., полученного при помощи вышеописанного способа получения.

Также еще одной из задач данного изобретения является обеспечение способа применения вышеописанного экстракта Piper Laetispicum C.DC.

Краткое описание изобретения

Согласно изобретению для решения поставленных задач предложен способ получения экстракта Piper Laetispicum C.DC., который включает следующие этапы.

В качестве лекарственного сырья берут Piper Laetispicum C.DC., при этом используют корень растения, а также корневище, стебель, листья и плоды, или цельное растение. Сначала проводят первичную обработку растений, после чего растения замачивают или перколируют органическим растворителем при нормальной температуре или же при температуре ≤70°С для получения первичного экстрактивного раствора. Затем для получения экстракта при температуре ≤70°С производят концентрацию раствора посредством сушки.

Также можно произвести очистку первичного экстрактивного раствора, полученного на первом этапе. После чего при температуре ≤70°С осуществить концентрацию раствора посредством его сушки с получением очищенного экстракта. Способы очистки включают в себя (однако не ограничиваются ими) следующие способы: очистка при помощи макропористой смолы, абсорбция на полиамиде, силикагелевый метод, ионообменный метод, экстрагирование спиртом и осаждение водой, экстрагирование кислотой и осаждение щелочью и т.д.

Также возможно приготовление экстракта путем применения способа сверхкритической флюидной экстракции (Supercritical Fluid Extraction) непосредственно сразу после проведения первичной обработки растения Piper Laetispicum C.DC.

Первичный или очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC., приготовленный при помощи вышеописанных способов, представляет собой полутвердое пастообразное вещество, цвет которого варьирует от желто-коричневого до черно-бурого, вещество не растворяется в воде и имеет вязкую консистенцию. В состав экстракта входят следующие алкалоиды: N-изобутил-транс-2-транс-4-диенамид (пеллиторин), 1-[(2Е,4Е)-2,4-декадиен-ацил]пирролидин, 3',4'-метилен-диоксикоричная кислота-изобутил-амид, 5'-метоксил-3',4'-метилен-диоксикоричная кислота-изобутил-амид, пиперин (пипериноил-пиперидин) С5:1(2Е), 5'-метоксил-3',4'-метилен-диоксикоричная кислота-тетрагидропирол, 4,5-дигидропиперлонгуминин (пиперлонгуминин), пиперин и т.д.

Эффективная доза ED₅₀ очищенного экстракта для мышей, мг/кг, составляет: 4,56 (FST), 3,49 (FHT); для крыс ED₅₀: 1,85 (FST). Безопасность LD₅₀/ED₅₀ очищенного экстракта для мышей составляет =116-124 (FST).

Эксперименты in vitro (в пробирке), а также функциональные механические эксперименты доказывают, что экстракт Piper Laetispicum C.DC., полученный при помощи способа, описанного в данном изобретении, обладает ярко выраженным ингибирующим действием в отношении обратного поглощения серотонина (5-НТ), и/или норадреналина (NA), и/или дофамина (DA). Кроме того, по сравнению с экстрактом, приготовленным при помощи ректификационного способа, данный вид экстракта содержит большее количество алкалоидов и отличается более высоким уровнем биологической активности. Таким образом, описанный в данном изобретении экстракт Piper Laetispicum C.DC., являясь ингибитором обратного поглощения серотонина, и/или норадреналина, и/или дофамина, может быть преобразован в следующие средства: антидепрессант; успокаивающее; седативное; снотворное; а также в средство для лечения старческого слабоумия и т.д. Данный препарат может быть использован в качестве основного компонента или составляющей в фармацевтических препаратах, биологически активных добавках или пищевых добавках. Препарат может быть применен для лечения и/или профилактики шизофрении, маниакально-депрессивного синдрома, перепадов настроения, мутизма, комплексных психических расстройств органического происхождения, невроза навязчивых состояний, депрессии, синдрома повышенной тревожности, расстройств сна, эпилепсии, болезни Паркинсона, головных болях, невралгии, старческом слабоумии, а также других психиатрических заболеваний, связанных с нарушением обмена медиаторов моноаминов 5-НТ, NA и DA.

Конкретные примеры реализации изобретения

Ниже приведены примеры конкретной реализации способов изобретения с более подробными комментариями, касающимися данного изобретения. Необходимо отметить, что нижеприведенные примеры представлены исключительно для пояснения этого изобретения и не предназначены для определения его границ.

Пример реализации изобретения 1

Приготовление экстракта Piper Laetispicum C.DC.

Как показано в табл.1, для приготовления экстракта Piper Laetispicum C.DC. отдельно берут корень растения, корневище, стебель, листья и плоды, или цельное растение. Конкретные описания способов приготовления экстракта приведены ниже.

Пример 1-1: берут 1 кг сухих корней и корневищ Piper Laetispicum C.DC., нарезают кусочками, добавляют 90%-ный (примерно) этанол (метилкарбинол), после чего растения замачивают при нормальной температуре в течение 48 часов. Затем образовавшийся объем доводится до 20 л путем добавления этанола с аналогичной степенью концентрации, после чего производят перколяцию массы для получения первичного экстрактивного раствора. В отфильтрованный раствор добавляют 15 л теплой воды, после чего раствор тщательно перемешивают до получения однородной смеси. Разбавленный и отфильтрованный раствор пропускают через фильтрующую колонну с макропористой смолой D101 (Компания научно-технического развития «Да Дяо», Лтд., г.Тяньцзинь, Филиал компании по производству смол). Затем производят поочередную промывку соответственно 40- и 90%-ным этанолом, при этом жидкость, образовавшуюся после промывки 90%-ным этанолом, собирают и производят процесс ее сгущения упариванием при температуре менее 70°С, в результате чего получают очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC.

Пример 1-2: берут 1 кг корней и корневищ Piper Laetispicum C.DC., нарезают кусочками, добавляют 80%-ный (примерно) этанол (метилкарбинол), после чего растения замачивают при нормальной температуре в течение 48 часов. Затем образовавшийся объем доводят до 10 л путем добавления этанола с аналогичной степенью концентрации. Раствор постепенно подогревают до температуры 50°С, после чего производят горячую перколяцию массы для получения первичного экстрактивного раствора. Первичный экстрактивный раствор сгущают до 2 л в вакуум-концентраторе (вакуум-выпарном аппарате) при температуре 60°С. В полученный раствор добавляют 10 л 40%-ного этанола, после чего раствор тщательно перемешивают до получения однородности. Разбавленный раствор пропускают через фильтрующую колонну с макропористой смолой HPD100 (Компания биологического и научно-технического развития «Хэбей Бао Энь», Лтд.). Затем производят поочередную промывку соответственно 50- и 80%-ным этанолом, при этом жидкость, образовавшуюся после промывки 80%-ным этанолом, собирают и производят процесс ее сгущения упариванием при температуре менее 70°С, в результате чего получают очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC.

Пример 2: берут 1 кг стеблей и листьев Piper Laetispicum C.DC., измельчают в порошок, добавляют 90%-ный (примерно) этанол (метилкарбинол), после чего замачивают при нормальной температуре в течение 24 часов. Образовавшийся объем доводят до 16 л путем добавления этанола с аналогичной степенью концентрации, после чего производят перколяцию массы для получения первичного экстрактивного раствора. Объем раствора доводят до 1/3 первичного объема при помощи сгущения в концентраторе с понижением давления. Затем в раствор добавляют равное количество холодной воды, раствор настаивают в течение 3 сут, после чего фильтруют и проводят отстаивание. Затем проводят процесс сгущения упариванием раствора при температуре менее 70°С, в результате чего получают очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC.

Пример 3: берут 1 кг цельных растений Piper Laetispicum C.DC., нарезают кусочками, добавляют 10 л 0,5%-ного раствора уксусной кислоты, после чего растения замачивают при нормальной температуре в течение 24 часов. Затем производят фильтрацию массы для получения первичного экстрактивного раствора, в раствор добавляют 2 л 2%-ной аммиачной воды, после чего раствор слегка встряхивают, далее в него добавляют хлороформ и проводят экстрагирование. Извлеченный раствор подвергают сгущению упариванием при температуре менее 70°С, в результате чего получают очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC.

Пример 4: берут 1 кг корней и корневищ Piper Laetispicum C.DC., нарезают кусочками, добавляют 55%-ный (примерно) этанол (метилкарбинол), после чего растения замачивают при нормальной температуре в течение 24 часов. Затем образовавшийся объем доводят до 20 л путем добавления этанола с аналогичной степенью концентрации. Раствор постепенно подогревают до температуры 60°С, после чего проводят горячую перколяцию массы для получения первичного экстрактивного раствора. Указанный раствор сгущают и сушат, после чего проводят разделение (сепарацию) при помощи силикагелевой колонны (силикагель Н, Химико-промышленная корпорация «Хай Ян», Шань Дун, Цин-дао). Затем проводят промывание при помощи циклогексана - этилацетата и петролейного эфира-ацетона, далее раствор, выделенный при промывании петролейным эфиром-ацетоном в соотношении от 10:1 до 2:1, собирают и подвергают сгущению и сушке при температуре менее 70°С, в результате чего получают очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC.

Пример 5: берут 1 кг стеблей и корней Piper Laetispicum C.DC., измельчают в порошок, добавляют 5 л этилового (серного) эфира, после чего растения замачивают в герметичных условиях при нормальной температуре в течение 24 часов. Образовавшийся экстракт собирают, указанный процесс повторяют три раза подряд. Собранный экстрактивный раствор возвращают обратно в этиловый эфир, после чего растворяют в ацетоне, и производят обработку с помощью полиамидной фильтрующей колонны (Химико-промышленный завод «Шао Тань», г.Сян Тань). Затем раствор подвергают сгущению и сушке при температуре менее 70°С, в результате чего получают очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC.

Пример 6: берут 1 кг корней и корневищ Piper Laetispicum C.DC., нарезают кусочками, добавляют 5 л 0,5%-ного раствора уксусной кислоты, после чего растения замачивают в холодных условиях в течение 24 часов. Затем при температуре менее 70°С раствор немного подогревают, при этом емкость, в которой находится раствор, не следует накрывать крышкой. После этого водный раствор проходит обработку в ионообменной колонне (катионообменная смола 732, Завод по производству смол «Сян Ян», г.Хэби), после чего промывают 2%-ной аммиачной водой. Промывочный раствор подвергают сгущению и сушке при температуре менее 70°С, в результате чего получают очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC.

Пример 7: берут 1 кг стеблей и корней Piper Laetispicum C.DC., измельчают в порошок, добавляют хлороформ, после чего растения замачивают в герметичных условиях при нормальной температуре в течение 24 часов. Образовавшийся объем доводят до 10 л путем добавления хлороформа, после чего производят фильтрацию первичного экстрактивного раствора. После возврата хлороформа раствор непосредственно сгущают и сушат при температуре менее 70°С. Экстракт готов.

Пример 8: берут 1 кг цельных растений Piper Laetispicum C.DC., измельчают в порошок, добавляют необходимое количество этилацетата, после чего растения замачивают при нормальной температуре в течение 24 часов. Образовавшийся объем доводят до 10 л путем добавления этилацетата, после чего производят фильтрацию первичного экстрактивного раствора. После возврата этилацетата в раствор добавляют этанол, после чего раствор этанола очищают посредством пропускания через фильтрующую колонну из макропористой смолы, D860021 (Фармацевтическая акционерная компания «Лукан», Лтд., провинция Шаньдун). Затем производят поочередную промывку соответственно 40- и 90%-ным этанолом, при этом жидкость, образовавшуюся после промывки 90%-ным этанолом, собирают и подвергают сгущению и сушке при температуре менее 70°С, в результате чего получают очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC.

Пример 9: берут 1 кг корней Piper Laetispicum C.DC., нарезают кусочками, добавляют 2 л 0,5%-ной аммиачной воды, после чего растения настаивают в течение 24 часов. После чего три раза производят экстрагирование раствора с добавлением этилового эфира. Общий объем полученного экстрактивного раствора возвращают в этиловый спирт, после чего раствор подвергают сгущению и сушке при температуре менее 70°С, в результате чего получают очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC.

Пример 10 (контрольный): берут 1 кг корней и корневищ Piper Laetispicum C.DC., измельчают в крупный порошок, после чего два раза осуществляют обратную перегонку (ректификация, фракционирование) раствора на водяной бане с добавлением 60%-ного этанола. Собранную жидкость отфильтровывают и концентрируют до 14% от первоначального объема. Затем добавляют 30%-ный раствор этанола, так, чтобы жидкость имела чистую непрозрачную окраску, после чего раствор очищают путем пропускания через фильтрующую колонну из макропористой смолы. После этого производят поочередную промывку при помощи 40-, 55- и 80%-ного раствора этанола. Раствор, собранный при промывке 80%-ным этанолом, подвергают сгущению и сушке при температуре менее 70°С, в результате чего получают очищенный экстракт Piper Laetispicum C.DC. (в соответствии с Примером реализации изобретения 1 Заявки на патент КНР, №03115911.7).

Пример 11: берут 1 кг цельных растений Piper Laetispicum C.DC., после чего способом сверхкритической флюидной экстракции получают экстракт. Конкретное описание процесса приготовления экстракта приведено ниже.

Лекарственное сырье Piper Laetispicum C.DC. измельчают в крупный порошок и помещают в экстрактор. Каждую из разделительных емкостей экстрактора подогревают до установленной температуры, после чего давление повышают до предварительно установленных параметров, и начинают процесс динамического экстрагирования. Каждая новая порция сырья составляет 200 г, условия экстрагирования: давление - 30 МПа, температура - 40°С, время экстрагирования - 2 часа, расход CO₂ - 20 м²/ч. В разделительных емкостях при помощи редукционного клапана давление с повышенных показателей снижается до нормальных, в результате полученный экстрактивный раствор и будет являться экстрактом Piper Laetispicum C.DC.

Таблица 1Получение экстракта Piper Laetispicum C.DC.
Номер примера	Лекарственное сырье	Способ предварительной обработки	Органический растворитель	Способ экстракции	Способ очистки
1-1	Корень, корневище	Нарезка	Этанол	Перколяция	Макропористая смола
1-2	Корень, корневище	Нарезка	Этанол	Горячая перколяция	Макропористая смола
2	Стебель, листья	Измельчение в порошок	Этанол	Перколяция	Способ экстрагирования спиртом и осаждения водой
3	Цельное растение	Нарезка	Раствор уксусной кислоты	Замачивание (настаивание)	Способ экстрагирования кислотой и осаждения щелочью
4	Корень, корневище	Нарезка	Этанол	Горячая перколяция	Колонка с силикагелем
5	Корень, стебель	Измельчение в порошок	Этаноловый эфир	Замачивание (настаивание)	Колонка с полиамидной смолой
6	Корень, корневище	Нарезка	Раствор уксусной кислоты	Перколяция	Ионный обмен
7	Корень, стебель	Измельчение в порошок	Хлороформ	Перколяция	-
8	Цельное растение	Измельчение в порошок	Этилацетат	Перколяция	Макропористая смола
9	Корень	Нарезка	Щелочной раствор	Замачивание (настаивание)	Экстрагирование при помощи органического растворителя
10*	Корень, корневище	Измельчение в порошок	Этанол	Ректификация (фракционирование)	Макропористая смола
11	Целое растение	Измельчение в порошок	Способ сверхкритической флюидной экстракции
*Экстракт Piper Laetispicum C.DC., изготавливаемый при помощи ректификационного метода для проведения сравнения

Пример реализации изобретения 2

Применение экстракта Piper Laetispicum C.DC. для приготовления лекарственных средств

В качестве лекарственного сырья использовали экстракт Piper Laetispicum C.DC., полученный в Примере реализации изобретения 1. На основе стандартных производственных методов в области фармакологии могут быть изготовлены различные формы лекарственного средства - желатиновые капсулы, таблетки, гранулы, порошок, микрокапсулы, капельные капсулы, инъекции, микстуры (жидкость для орального применения), порошковые инъекции, препараты пролонгированного действия, препараты направленного действия и т.д. Методы производства данных видов препаратов представляют собой стандартные современные технологические методы. В данном же примере описывается только изготовление желатиновых капсул, гранул и таблеток, лекарственным сырьем для которых является пример 1-1 экстракта Piper Laetispicum C.DC., описанный в предыдущем примере.

2.1 Желатиновые капсулы

Состав:

экстракт Piper Laetispicum C.DC. - 10 г,

кукурузный крахмал - 80 г,

стеарат магния - 8 г,

антиоксидант - 2 г.

Способ приготовления

Смешать экстракт Piper Laetispicum C.DC. с кукурузным крахмалом, стеаратом магния и антиоксидантом, просеять, равномерно наполнить заранее подготовленные пустые желатиновые капсулы (1000 шт.), запаять. Капсулы готовы. Вес наполнения каждой капсулы составляет 100 мг, из которых 10 мг приходится на очищенный экстракт.

2.2 Гранулы

Состав:

экстракт Piper Laetispicum C.DC. - 20 г,

растворимый крахмал - 380 г,

бритишгум (декстрин) - 200 г.

Способ приготовления

Смешать экстракт Piper Laetispicum C.DC. с растворимым крахмалом и бритишгумом, после чего спрессовать полученную массу в большие пластинки (таблетки), затем сформировать гранулы и просеять. Просушить и расфасовать в пакеты (1000 шт.). Гранулы готовы.

2.3 Таблетки

Состав:

экстракт Piper Laetispicum C.DC. - 30 г,

крахмал - 100 г,

бритишгум (декстрин) - 30 г,

сахароза - 20 г,

молотый тальк - 12 г,

стеарат магния - 5 г,

антиоксидант - 3 г.

Способ приготовления

Перед тем, как экстракт Piper Laetispicum C.DC. высохнет, добавить в него крахмал, бритишгум, сахарозу и сформировать гранулы. После просушки добавить молотый тальк, стеарат магния и антиоксидант, равномерно перемешать, сформировать таблетки (1000 шт.), покрыть оболочкой. Таблетки готовы.

Пример реализации изобретения 3

Ингибирующее действие на обратное поглощение серотонина, норадреналина и дофамина in vitro

Исследования показали, что в основе главного биологического механизма инактивации норадреналина и его выхода из синаптической щели лежит вторичное поглощение данного вещества симпатическими нервами. Такие вещества, как кокаин, некоторые химические соединения бензамида, а также андидепрессанты в состоянии ингибировать процесс вторичного поглощения (обратного поглощения). Одним из основных механизмов антидепрессантных средств является обеспечение понижающей реакции рецепторов адреналина. Биологический механизм воздействия серотонина на нервные функции во многом сходен с биологическим механизмом воздействия дофамина. В клинических условиях целый ряд эффективных антидепрессантных средств помогает успешно блокировать обратное поглощение серотонина, и/или норадреналина, и/или дофамина. В ходе описанного ниже эксперимента проверялось, оказывает ли данное химическое соединение ингибирование повторного поглощения синаптосомами головного мозга у крыс, а также определялась ценность данного химического соединения как антидепрессантного средства или других ингибиторов (обратного) поглощения медиаторами моноаминов.

В первую очередь, согласно методу Уиттекера и др. (Whittaker, VP, Barker, LA: The subcellular fractionation of brain tissue with special reference to the preparation of synaptosomes and their component organelles, Methods of Neurochemistry 1972 2: Edited by R Fried. New York, Marcel Dekker) получали синаптосомы мозга крысы, а именно: крысе отрезали голову, после чего быстро извлекали головной мозг и помещали его в предварительно охлажденный физиологический раствор (раствор хлорида натрия), удаляли мягкую оболочку мозга и кровеносные сосуды. Извлекали паллиум (плащ головного мозга) и помещали его в холодный раствор. Затем при помощи ультразвукового дезинтегратора осуществляли гомогенизацию и центрифугирование клеток. В результате получали заготовку очищенных синаптосом мозга крыс.

В соответствии с методом, изложенным в «Экспериментальных методах современной медицины» (Главная редакция: Ван Цянь, Издательство: «Пекин Женыминь Вейшен», 1997), а также в «Экспериментальной методологии современной фармакологии» (Главная редакция: Чжан Цзюнь-тянь, Объединенное издательство Пекинского научно-медицинского университета и Китайского Пекинского научно-медицинского университета: «Пекин Женыминь Вейшен», 1997) в пробирку сначала добавляли буферный раствор Tris-Krebs, затем добавляли суспензию из синаптических частиц, затем - 10 мкл экстракта Piper Laetispicum C.DC. (пример 1-1). Полученную суспензию равномерно перемешивали для получения однородного раствора и подогревали на водяной бане при температуре 37°С. После этого при температуре 4°С добавляли 10 мкл субстрата (³H-5HT, ³H-NA либо ³H-DA, конечная концентрация реакции составляет 300 нМ), перемешивали до получения однородной массы и подогревали в течение 5 минут при температуре 37°С. Затем в каждую пробирку добавляли предварительно охлажденный буферный раствор Tris-Krebs для завершения реакции и быстро пропускали через стекловолокнистую мембрану фильтра при помощи множественного коллектора клеток. Затем пробирки и фильтр ополаскивали аналогичным раствором такого же объема, снимали мембрану фильтра, высушивали ее, после чего помещали в сцинтиллятор, добавляли толуол-сцинтилляционную жидкость и рассчитывали показатели при помощи β-жидкостного сцинтилляционного счетчика. Полученные показатели приведены в табл.3.

Таблица 3Ингибирующее действие экстракта Piper Laetispicum C.DC. на поглощение серотонина, и/или норадреналина, и/или дофамина в синаптосомах мозга крыс
Пример 1-1 (конечная концентрация реакции)	Контрольный препарат позитивного воздействия	Ингибирующее действие на обратное поглощение моноаминов (СРМ)
Серотонин	Норадреналин	Дофамин
	0°С	1114	1519	1265
	37°С	1362	1671	1606
	Флуоксетин (0,1 мМ)	1101
	Дезипрамин (0,1 мМ)		1499
	Паргилин (0,1 мМ)			1197
0,064 мкг/мл		1341	1674	1587
0,32 мкг/мл		1329	1580	1326
1,6 мкг/мл		1261	1490	1201
8 мкг/мл		1191	1159	1003
40 мкг/мл		927	1144	956
200 мкг/мл		692	975	735
1000 мкг/мл		465	680	487

Исходя из результатов, приведенных в табл.3, можно провести сравнение показателей обратного поглощения (значение СРМ) трех видов моноаминов при нормальной температуре тела (37°С) (в таких условиях поглощение моноаминов представляет собой стандартное активное поглощение). Экстракт Piper Laetispicum C.DC., описанный в данном изобретении, при значении концентрации, равном 0,064 мкг/мл, оказывает активное ингибирующее воздействие на поглощение трех видов моноаминов (значение СРМ ниже стандартных показателей). При значении концентрации 40 мкг/мл экстракт полностью ингибирует функцию поглощения серотонина в синаптосомах мозга. Сила действия в данном случае приравнивается к действию 0,1 мМ флуоксетина. Если же показатель концентрации возрастает до 200~1000 мкг/мл, значение СРМ будет ниже аналогичного показателя при температуре 0°С. При этом очевидно, что неспецифическая диффузия синаптосом в отношении 5-НТ также ингибируется, IC₅₀ составляет 4,2 мкг/мл (конечная концентрация реакции). Ингибирующее действие препарата на поглощение NA является еще более мощным: при показателе концентрации всего 1,6 мкг/мл препарат позволяет практически полностью ингибировать функцию поглощения NA в синаптосомах мозга, по силе действия препарат идентичен действию 0,1 мМ дезипрамина. Аналогично, если концентрация повышается до показателя более 200 мкг/мл, неспецифическая диффузия синаптосом мозга в отношении NA полностью подавляется, при этом IC₅₀ составляет 0,34 мкг/мл (конечная концентрация реакции). Степень ингибирующего действия испытуемого фармакологического препарата А в отношении DA находится в пределах 5-НТ и NA, IС₅₀ в данном случае составляет 0,34 мкг/мл (конечная концентрация реакции).

Таким образом, очевидно, что экстракт Piper Laetispicum C.DC. оказывает явное ингибирующее действие на (обратное поглощение) поглощение серотонина, норадреналина и дофамина в синаптосомах мозга крыс, а потому может применяться при изготовлении лекарственных средств, биологически активных добавок и пищевых добавок, используемых для лечения и/или профилактики (психиатрических) заболеваний, связанных с обменом медиаторов серотонина, норадреналина и дофамина, и других моноаминов.

Пример реализации изобретения 4

Ингибирующее действие на поглощение 5-НТР на модели судорожных движений головой, вызываемые у мышей 5-гидрокситриптофаном

5-гидрокситриптофан (5-НТР) является предшественником серотонина (5-НТ). Ингибитор моноаминоксидазы паргилин подавляет обмен 5-гидрокситриптофана, при повторном же введении антидепрессанта у мышей может наблюдаться характерная симптоматика - судорожные движения головой.

Мышей произвольно делили на группы, животным каждой группы перорально вводили лекарственный препарат в соответствии с дозами, представленными в табл.4. Испытуемый препарат А представлял собой пример 1-1 экстракта Piper Laetispicum C.DC., полученного в ходе опыта, описанного в Примере реализации изобретения 1. Препарат вводился один раз в день на протяжении 7 сут. При этом для осуществления сравнения контрольной группе крыс вводили физиологический раствор. Через час после последнего введения испытуемого препарата мышам всех четырех групп подкожно вводили паргилин гидрохлорид, затем спустя 90 минут мышам всех четырех групп в хвостовую вену производили инъекцию 5-НТР, после чего наблюдалась и регистрировалась реакция животных на введение лекарственных препаратов. Результаты эксперимента приведены в табл.4.

Таблица 4Результаты испытаний по усилению действия 5-гидрокситриптофана (5-НТР) путем желудочного введения мышам лекарственного препарата (n=10, Ridit анализ)
Лекарственные средства	Доза, мг/кг/сут	Степень реакции по возникновению судорожных движений головы
	0	I	II	III	IV
СК-	-	6	4	0	0	0
А	20	0	3	1	2	4
А	10	0	3	3	2	2
А	5	2	5	3	0	0
СК-: физиологический раствор

Соотношение стандартной контрольной и высокой дозировки A:R=2,05 Р<0,05

Соотношение стандартной контрольной и высокой дозировки A:R=1,06

Оценочный стандарт: U>1,96, Р<0,05; U>2,58, P<0,011

Как видно из табл.4, через 15 минут после введения 5-НТР у мышей начинались проявляться судорожные движения головы различной степени. При этом наиболее очевидная симптоматика развивалась в группе животных, где дозировка лекарственного препарата составляла 20 мг/кг, в этом случае наблюдалось самое большое количество животных с положительной реакцией, самая же легкая симптоматика - в нейтральной контрольной группе. В течение 2 часов после введения лекарственных препаратов животные нейтральной контрольной группы приходили в свое нормальное состояние, в остальных трех группах, где животным вводили различные дозы испытуемого препарата, по-прежнему наблюдались судорожные движения головы различной степени. Таким образом, очевидно, что экстракт Piper Laetispicum C.DC. способствует усилению действия 5-НТР по стимулированию возникновения судорожных движений головы у мышей, а следовательно, in vivo доказано ингибирующее действие данного препарата на поглощения 5-НТ.

Пример реализации изобретения 5

Повышение токсичности йохимбина у мышей

В связи с тем, что йохимбин является антагонистом альфа 2-адренорецепторов, он может взаимодействовать с адренорецепторами, тем самым предотвращая взаимодействие с адренорецепторами норадреналина NA. В случае если антидепрессанты, подавляющие обратное поглощение норадреналина NA или подавляющие потерю его активности, будут использоваться совместно с йохимбином, это может привести к повышению концентрации норадреналина и стать причиной гибели животного в результате отравления. Таким образом, цель данного эксперимента - доказать in vivo, что экстракт Piper Laetispicum C.DC. представляет собой ингибитор обратного поглощения.

Мышей произвольно делили на группы, животным каждой из них перорально вводили лекарственный препарат в соответствии с дозами, представленными в табл.5. Испытуемый препарат А представлял собой пример 1-1 экстракта Piper Laetispicum C.DC., полученного в ходе опыта, описанного в Примере реализации изобретения 1. Препарат вводится один раз в день на протяжении 7 сут. При этом для осуществления сравнения контрольной группе крыс вводили физиологический раствор. Через час после последнего введения испытуемого препарата мышам всех четырех групп подкожно вводили йохимбин гидрохлорид, после чего наблюдали и регистрировали уровень смертности животных во всех четырех группах спустя 1, 2, 4, 5 и 24 часа после введения йохимбина. Результаты эксперимента приведены в табл.5.

Таблица 5Результаты испытаний по усилению токсичности йохимбина посредством желудочного введения мышам лекарственного препарата (n=10)
Лекарственные средства	Доза, мг/кг/сут	Уровень смертности животных
	1 ч	2 ч	4 ч	5 ч	24 ч
СК-	-	0	0	0	0	0
А	20	2	0	0	0	0
А	10	1	0	0	0	0
А	5	0	0	0	0	0
А	2,5	0	0	0	0	0
СК-: физиологический раствор

Спустя 20 минут после введения йохимбина во всех группах, практически у всех животных наблюдалось общее повышение возбудимости центральной нервной системы, что выражалось раздражительностью, мышечным тремором и другими симптомами. У отдельных особей животных наблюдалось кровотечение изо рта и носа. Наиболее выраженная реакция наблюдалась у животных из группы ADP, где дозировка составила 20 мг/кг/сут. Как видно из табл.5, смертельные случаи имели место спустя 1 час после введения лекарства в группах, где дозировка составила 20 мг/кг и 10 мг/кг. Данный опыт доказывает, что экстракт Piper Laetispicum C.DC. в состоянии усиливать токсическое воздействие йохимбина, а следовательно, in vivo подтверждается ингибирующее действие данного препарата на поглощение