Пептид, обладающий свойствами амилина (варианты), и его применение (варианты)

Пептид, обладающий свойствами амилина (варианты), и его применение (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США №60/543,275, поданной 11 февраля 2004, и по предварительной заявке США №60/550,447, поданной 3 марта 2004, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новым соединениям и способам их получения и применения. Эти соединения могут быть использованы для лечения или профилактики состояний, таких как метаболические нарушения, сосудистые нарушения, нарушения функции почек и/или нарушения работы желудочно-кишечного тракта. Состояние, которое можно привести в качестве примера, представляет собой состояние, при котором важно уменьшить потребление пищи или калорий, например ожирение, диабет II типа, пищевого расстройства, метаболический синдром и синдром инсулинорезистентности.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К настоящему времени была проведена большая работа по амилину, кальцитонину и пептиду, генетически родственному кальцитонину (CGRP), для понимания их структуры и функции. В таблице 1 суммированы некоторые биологические эффекты CGRP, кальцитонина и амилина, опубликованные Wimalawansa, S.J. (1997) Critical Reviews in Neurobiology, 11; 167-239.

Таблица 1:
Биологический эффект	CGRP	Кальцитонин	Амилин
Вазодилятация	++++	+/-	++
Хронотропный	++	-	++
Инотропный	++	-	++
Ингибирование резобции костей	+	++++	++
Стимуляция костеобразования	-	-	+
Кальций - снижающий эффект	-	+++	++
Эффект, подобный эффекту фактора роста	+	-	+
Нейрорегенерация	++	+/-	-
Терморегуляция	+	-	+
Воспаление	++	+/-	-
Защита слизистой желудка	++	-	-
Воздействие на β-клетки	+	+/-	++
Скелетная мускулатура	+	-	+
Метаболизм глюкозы	+	-	+
Анорексический эффект	+	++	++
Анальгезирующий эффект	-	++	+

Сообщалось, что амилин регулирует опорожнение желудка и подавляет секрецию глюкагона и усвоение пищи, таким образом регулируя скорость появления глюкозы в кровотоке. По-видимому, он дополняет действия инсулина, который регулирует скорость исчезновения глюкозы из кровотока и ее поглощения периферическими тканями. Эти действия подтверждаются экспериментальными данными у грызунов и людей, указывающими на то, что амилин дополняет эффекты инсулина в регуляции глюкозы после приема пищи, по меньшей мере, с помощью трех независимых механизмов, каждый из которых влияет на скорость появления глюкозы. Во-первых, амилин подавляет секрецию глюкагона после приема пищи. По сравнению со здоровыми взрослыми пациентами у пациентов с диабетом 1 типа амилин не циркулирует, а у пациентов с диабетом 2 типа концентрации амилина после приема пищи снижены. Кроме того, инфузионное введение специфических моноклональных антител к амилину, которые связывают циркулирующий амилин, снова приводит к значительному повышению концентраций глюкагона по сравнению с контролем. Оба этих результата указывают на физиологическую роль эндогенного амилина в регуляции секреции глюкагона после приема пищи. Во-вторых, амилин замедляет моторику желудочно-кишечного тракта и опорожнение желудка. Наконец, было показано, что внутригипоталамические инъекции амилина крыс снижают питание у крыс и изменяют метаболизм нейротрансмиттеров в гипоталамусе. В некоторых исследованиях поглощение пищи значительно снижалось вплоть до восьми часов после внутригипоталамической инъекции амилина крыс и CGRP крыс. В испытаниях на людях было показано, что аналог амилина, прамлинтид, снижает массу тела или увеличение массы тела. Амилин может быть эффективен при лечении метаболических состояний, таких как диабет и ожирение. Амилин также может быть использован при лечении боли, заболеваний костей, гастрита, для модуляции липидов, в частности триглицеридов, или для воздействия на состав тканей тела, например, предпочтительной потери жировой ткани и сохранения нежировой ткани.

Гормон кальцитонин (СТ) был назван по его секреции в ответ на индуцированную гиперкальциемию и его быстрому гипокальциемическому эффекту. Он продуцируется и секретируется из нейроэндокринных клеток щитовидной железы, которые в связи с этим были названы С-клетками. Хорошо изученным действием СТ(1-32) является его воздействие на остеокласты. In vitro эффекты СТ включают в себя быструю потерю поврежденных краев и сниженное высвобождение лизосомальных ферментов. В конечном итоге, ингибирование функции остеокластов под действием СТ в результате приводит к снижению резорбции кости. Однако ни постоянное снижение СТ в сыворотке в случае тиреоидэктомии, ни повышенный уровень СТ в сыворотке, обнаруженный при медуллярном раке щитовидной железы, по-видимому, не связаны с изменениями содержания кальция в сыворотке крови или костной массе. Таким образом, наиболее вероятно, что основной функцией СТ(1-32) является борьба с острой гиперкальциемией в экстремальных ситуациях и/или защита скелета в периоды «кальциевого стресса», таких как рост, беременность и лактация. (Обзор в Becker, JCEM, 89 (4): 1512-1525 (2004) и Sexton, Current Medicinal Chemistry 6: 1067-1093 (1999)). Согласно этому, в недавних сведениях, полученных при изучении гена кальцитонина мышей «knockout», который удаляет и кальцитонин, и CGRP-I пептиды, сообщается, что у этих мышей были нормальные уровни значений, связанных с базальным кальцием, но повышенный кальциемический ответ (Kurihara H, et al, Hypertens Res. 2003 Feb; 26 Suppl:S 105-8).

CT оказывает воздействие на уровни кальция в плазме и ингибирует функции остеокластов и широко используется при лечении остеопороза. Терапевтически CT лосося, по-видимому, увеличивает плотность кости и снижает частоту возникновения переломов с минимальными побочными эффектами. CT также успешно использовался на протяжении 25 лет в качестве лекарственного средства при болезни костей Педжета, которая представляет собой хроническое заболевание скелета, результатом которого является увеличение и деформация костей в одном или нескольких участках скелета. Также широко используется анальгетический эффект CT при болях в костях, испытываемых при остеопорозе, хотя механизм этого эффекта до конца не понят.

Пептид, генетически родственный кальцитонину (CGRP), представляет собой нейропептид, рецепторы которого распространены повсеместно в организме, в том числе в нервной системе и сердечно-сосудистой системе. Этот пептид, по-видимому, модулирует чувствительную нейрональную передачу и является одним из наиболее сильных эндогенных вазодилятационных пептидов, открытых к настоящему времени. Описанные биологические эффекты CGRP включают в себя: модуляцию вещества Р при воспалении, модуляцию активности никотиновых рецепторов в нейромышечном синапсе, стимуляцию секреции ферментов поджелудочной железы, снижение секреции желудочного сока, периферическую вазодилятацию, учащение пульса, нейромодуляцию, регуляцию метаболизма кальция, остеогенную стимуляцию, секрецию инсулина, повышение температуры тела и снижение потребления пищи. (Wimalawansa, Amylin, calcitonin gene-related peptide, calcitonin and ADM: a peptide superfamily. Crit Rev Neurobiol. 1997; 11 (2-3): 167-239). Важной ролью CGRP является регуляция притока крови к различным органам вследствие его сильного сосудорасширяющего действия, что доказывается снижением среднего артериального давления после внутривенного введения CGRP. Сосудорасширяющие действия также подтверждаются недавним исследованием гомозиготных мышей «knockout CGRP», в котором продемонстрирована повышенная резистентность периферических сосудов и высокое кровяное давление, вызванное повышенной активностью периферической симпатической нервной системы (Kurihara H, et al, Targeted disruption of ADM and alphaCGRP genes reveals their distinct biological roles. Hypertens Res. 2003 Feb; 26 SuppliS 105-8). Таким образом, CGRP, по-видимому, вызывает сосудорасширяющие эффекты, гипотензивные эффекты и повышение частоты сердечных сокращений наряду с другими действиями.

Длительная инфузия CGRP пациентам с застойной сердечной недостаточностью показала длительный благоприятный эффект на гемодинамические функции без побочных эффектов, предполагая применение при сердечной недостаточности. Другие показания для применения CGRP включают в себя почечную недостаточность, острую и хроническую ишемию коронарных артерий, лечение сердечной аритмии, других заболеваний периферических сосудов, таких как феномен Рейно, субарахноидальная геморрагия, гипертензия и легочная гипертензия. Преэкламптическая токсемия беременных и преждевременные роды также теоретически поддаются лечению. (Wimalawansa, 1997). Последние терапевтические применения включают в себя применение антагонистов CGRP для лечения головных болей при мигрени.

Существует много полезных свойств каждого пептида, которые могут быть использованы отдельно или в комбинации для лечения или профилактики различных состояний. Было бы полезным создать новые и эффективные пептиды, обладающие многими функциями, придающими улучшенные характеристики, которыми не обладают существующие пептиды. Например, в исследованиях потребления пищи было показано, что амилин имеет быстрое начало, в течение 30 минут, но его эффект уменьшается через 60 минут. Наоборот, было показано, что кальцитонин лосося имеет замедленное действие, с максимальными уровнями, сохраняющимися в течение 240 минут. Новые соединения, которые могут имитировать эффекты амилина и/или кальцитонина и обладают быстрым проявлением активности, подобно амилину, с замедленной активностью кальцитонина, могут повысить активность и эффективность каждого отдельно взятого соединения. Более того, комбинация некоторых физико-химических характеристик амилина, кальцитонина и/или CGRP в одно средство может облегчить воздействие в различных точках при дисфункциональном метаболическом цикле. Эти новые соединения объединяют желательные функции или свойства для превосходного лекарственного средства, что в результате дает соединения, имеющие, по меньшей мере, одно желаемое свойство, например, более высокую эффективность, большую активность, большую биодоступность, меньше побочных эффектов, несложное производство, стабильность и/или растворимость.

Все соединения, которые упоминаются здесь, включены в качестве ссылки в настоящую заявку, как будто полностью изложенные здесь.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится, по меньшей мере частично, к новым пептидам семейства амилина или к соединению. В основном аспекте, эти новые соединения (также называемые соединениями по данному изобретению) имеют по меньшей мере один петлевой фрагмент амилина или кальцитонина и их аналогов; а-спиральный участок по меньшей мере части α-спирального участка кальцитонина или его аналогов или α-спиральный участок, имеющий часть α-спирального участка амилина и α-спирального участка кальцитонина или их соответствующих аналогов; и С-концевой хвост амилина или кальцитонина или их аналогов, при условии, что С-концевой хвост кальцитонина или аналога кальцитонина не является пролином (Pro), гидроксипролином (Hyp), гомосерином (Hse) или производными Hse.

Используемый здесь «аналог» относится к пептиду, последовательность которого происходит из последовательности основного эталонного пептида, например амилина и кальцитонина, и включает в себя вставки, замены, удлиняющие сегменты и/или делеции эталонной аминокислотной последовательности, предпочтительно имеющей по меньшей мере 50 или 55% идентичность аминокислотной последовательности с основным пептидом, более предпочтительно имеющей по меньшей мере 70%, 80%, 90% или 95% идентичность аминокислоты с основным пептидом. В одном варианте осуществления такие аналоги могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены (в том числе неприродные аминокислоты и L и D формы). Аналоги включают в себя соединения с агонистической и соединения с антагонистической активностью. Аналоги в соответствии с данным здесь определением также включают в себя производные.

«Производное» определено здесь как эталонный пептид или аналоги, описанные выше, имеющее химическую модификацию одной или нескольких боковых групп аминокислот, α-углеродных атомов, концевых аминогрупп или группы концевой карбоновой кислоты. Химическая модификация включает в себя, но не только, добавление химически функциональных групп, образование новых связей и удаление химически функциональных групп. Модификации боковых групп аминокислот включают в себя, без ограничения, ацилирование ε-аминогрупп лизина, N-алкилирование аргинина, гистидина или лизина, алкилирование карбоксильной группы глутаминовой или аспарагиновой кислоты, и дезаминирование глутамина или аспарагина. Модификации концевой аминогруппы включают в себя без ограничения дезамино, N-низший алкил, N-ди-низший алкил и N-ацил модификации. Модификации концевой аминогруппы включают в себя, без ограничения, дезамино, N-низший алкил, N-ди-низший алкил и N-ацил модификации, такие как алкилацилы, разветвленные алкилацилы, алкиларил-ацилы. Модификации концевой карбоксигруппы включают в себя, без ограничения, амид, низший алкиламид, диалкиламид, ариламид, алкилариламид и низший алкиловый эфир модификации. Низший алкил представляет собой С1-С4 алкил. Кроме того, одна или несколько боковых групп или концевых групп могут быть защищены защитными группами, известными специалисту в области химического синтеза, α-углерод аминокислоты может быть моно- или диметилированным.

В некоторых вариантах осуществления новые соединения имеют петлевой фрагмент амилина или аналога амилина, по меньшей мере часть α-спирального участка кальцитонина или аналога кальцитонина, и С-концевой хвост амилина или аналога амилина. В других вариантах осуществления новые соединения имеют петлевой фрагмент кальцитонина или аналога кальцитонина, по меньшей мере, часть α-спирального участка кальцитонина или аналога кальцитонина, и С-концевой хвост амилина или аналога амилина. В других вариантах осуществления новые соединения имеют петлевой фрагмент амилина или аналога амилина, по меньшей мере, часть α-спирального участка амилина или аналога амилина и, по меньшей мере, часть α-спирального участка кальцитонина или аналога кальцитонана и С-концевой хвост амилина или аналога амилина. В других вариантах осуществления новые соединения имеют петлевой фрагмент кальцитонина или аналога кальцитонина, по меньшей мере часть α-спирального участка амилина или аналога амилина и по меньшей мере часть α-спирального участка кальцитонина или аналога кальцитонина и С-концевой хвост амилина или аналога амилина. В других вариантах осуществления новые соединения имеют петлевой фрагмент амилина или аналога амилина, часть α-спирального участка или кальцитонина, или аналога кальцитонина, или, по меньшей мере часть α-участка амилина, или аналога амилина и, по меньшей мере, часть α-спирального участка кальцитонина или аналога кальцитонина и С-концевой хвост кальцитонина или аналога кальцитонина.

В некоторых вариантах осуществления петлевой фрагмент новых соединений может дополнительно содержать не более одной, двух, трех или четырех модификаций, включая замены, вставки или делении петли амилина или кальцитонина и их аналогов. Дополнительно предполагается, что новые соединения могут иметь дополнительные модификации N-концевого участка петли, содержащей N-кэп участок, который может обладать гидрофобными или гидрофильными свойствами, такой как ацетил, изокапроил, 3,6-диоксиоктановая кислота или 1-амино-4,7,10-триокса-13-тридеканаминсукциниминовая кислота. Модификации могут дополнительно включать одну, две, три или более дополнительных аминокислот. В этой области возможно слишком много модификаций для упоминания, но понятных специалисту в данной области на основании примеров, приведенных в настоящей заявке далее.

В основном, в отношении аминокислотной последовательности термин «модификация» включает в себя замены, вставки, элонгации, делеции и получение производных отдельных или в комбинации. Новые соединения по данному изобретению могут содержать одну или несколько модификаций «второстепенного» аминокислотного остатка. В контексте данного изобретения «второстепенный» аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен, т.е. удален или замещен, в новой аминокислотной последовательности без прекращения или существенного снижения агонистической активности аналогичного полипептида.

Замены включают в себя консервативные аминокислотные замены. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, в которой аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим похожую боковую цепь, или физико-химические свойства (например, электростатические, водородные связи, изостерические, гидрофобные особенности). Аминокислоты могут быть природными или неприродными. Семейства аминокислотных остатков, имеющих похожие боковые цепи, хорошо известны в данной области. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагировая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, метионин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, триптофан), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Замены также могут включать в себя неконсервативные замены.

Соединения по данному изобретению также могут быть получены с помощью химических изменений, таких как амидирование, гликозилирование, ацилирование, сульфатирование, фосфорилирование, ацетилирование и циклизация. Такие химические изменения могут быть получены с помощью химических или биохимических методик, а также способами in-vivo или с помощью любых комбинаций этих способов. Производные соединений по данному изобретению также могут включать в себя конъюгацию с одним или несколькими полимерами или низкомолекулярными заместителями. Один тип полимерной конъюгации представляет собой связывание или присоединение полимеров полиэтиленгликоля («ПЭГ»), полиаминокислот (например, поли-his, поли-arg, поли-lys и т.д) и/или цепей жирных кислот различной длины к N- или С-концу или аминокислотному остатку боковых цепей аналога AFP-6. Низкомолекулярные заместители включают в себя короткие алкилы и изогнутые алкилы (например, разветвленные, циклические, конденсированные, адамантил) и ароматические группы. Кроме того, основные остатки, такие как R и К, могут быть замещены на гомоR и гомоК, цитриллин или орнитин для улучшения метаболической стабильности пептида. Соединения по данному изобретению также включают в себя кислотные, а также амидные формы пептидов.

В некоторых вариантах осуществления α-спиральный участок новых соединений содержит по меньшей мере четыре следующих друг за другом аминокислоты α-спирального участка кальцитонина или аналога кальцитонина. В другом варианте осуществления α-спиральный участок содежит, по меньшей мере, 5, 6, 7 или 8 смежных аминокислот α- спирального участка кальцитонина или аналога кальцитонина. В других вариантах осуществления α спиральный участок содержит, по меньшей мере, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более следующих друг за другом аминокислот α-спирального участка кальцитонина или аналога кальцитонина. В некоторых вариантах осуществления, в тех случаях, когда количество следующих друг за другом аминокислот составляет меньше 8, считается, что α спиральный участок дополнительно содержит по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 или более следующих друг за другом аминокислот α-участка амилина или аналога амилина. В некоторых вариантах осуществления предусматривается, что чем меньше аминокислот кальцитонина или аналога кальцитонина, тем больше аминокислот амилина или аналога амилина может быть обнаружено в α-спиральном участке новых соединений. Количество аминокислот, входящих в состав α-участка, может быть примерно от 10 до 23 аминокислот. Соответственно α- спиральный участок может быть длиной 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 аминокислоты. Кроме того, аминокислоты должны обеспечивать примерно от трех до шести α спиральных витков. Кроме того, подразумевается, что α-спиральный участок новых соединений может дополнительно содержать не более одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми или 10 модификаций, в том числе замен, вставок или делеций α-спирального участка кальцитонина и/или амилина и их аналогов.

В некоторых вариантах осуществления С-концевой хвост новых соединений содержит по меньшей мере последние шесть, пять или четыре аминокислоты либо амилина, либо кальцитонина и их аналогов. В некоторых вариантах осуществления С-концевой хвост новых соединений содержит по меньшей мере часть С-конца, имеющего виток β-спирали. В некоторых вариантах осуществления виток β спирали введен в комбинацию аминокислот Gly-Ser. Соответственно новые соединения могут иметь С-конец, содержащий часть С-концевого хвоста амилина или кальцитонина (и их аналогов), имеющий Gly-Ser или начинающийся с Gly-Ser.

В некоторых вариантах осуществления С-концевой хвост новых соединений дополнительно может содержать не более одной, двух или трех модификаций, в том числе замен, вставок или делеций петли амилина или кальцитонина и их аналогов. Также предполагается, что новые соединения могут иметь дополнительные модификации С-концевой части С-концевого хвоста, которые могут включать в себя L-октилглицин, 4ABU (4-аминомасляную кислоту), 9Anc (9 аминононановую кислоту), 3,6-диоксиоктановую кислоту или 1-амино-4,7,10-триокса-13-тридеканаминсукциниминовую кислоту. Модификации дополнительно могут включать в себя одну, две, три или более дополнительных аминокислот. Типы модификаций, рассматриваемых в данной области, будут понятны специалисту в данной области исходя из примеров, приведенных далее в настоящей заявке.

В одном аспекте петлевой фрагмент определен как участок, находящийся на N-конце, содержащий по меньшей мере от 5 до 8 аминокислот, где первая и последняя аминокислоты способны образовывать связь, например, остатки в положениях 2-7 амилина или остатки в положениях 1-7 кальцитонина и соответствующие им участки соответствующих аналогов. В другом аспекте α-спиральный участок определен как внутренняя часть амилина или кальцитонина, фланкированная петлевым фрагментом, и С-концевой хвост, который структурно образует α-спираль, например, остатки в положениях 8-23 амилина или остатки в положениях 8-27 кальцитонина и соответствующие им участки соответствующих аналогов. Еще в одном аспекте, С-концевой хвост определен как участок после α-спирали, например, остатки в положениях 33-37 амилина или более длинный, например, остатки в положениях 27-37 или остатки в положениях с 27 или 28 по 32 кальцитонина. Включенные в соединения по данному изобретению представляют собой как амидные, так и кислотные формы описанных соединений.

Амилин и кальцитонин, определенные здесь, включают в себя все природные и видовые варианты. Примеры амилина и кальцитонина включают в себя, но не только:

амилин человека (hАмилин) KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO: 1)

амилин крыс (rАмилин) KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO: 2)

кальцитонин лосося (sCT) CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP(SEQ ID NO: 3)

кальцитонин человека (hCT) CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO: 4).

Под «аминокислотой» и «аминокислотным остатком» подразумевают природные аминокислоты, неприродные аминокислоты и модифицированные аминокислоты. Не утверждая обратное, любая ссылка на аминокислоту в общем виде или на конкретное название включает в себя ссылку как на D, так и на L стереоизомеры, если их структура допускает такие стереоизомерные формы. Природные аминокислоты включают в себя аланин (Ala), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспарагиновую кислоту (Asp), цистеин (Cys), глутамин (Gin), глутаминовую кислоту (Glu), глицин (Gly), гистидин (His), изолейцин (Ile), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), пролин (Pro), серин (Ser), треонин (Thr), триптофан (Trp), тирозин (Tyr) и валин (Val). Неприродные аминокислоты включают в себя, но не только, гомолизин, гомоаргинин, гомосерин азетидинкарбоновую кислоту, 2-аминоадипиновую кислоту, 3-аминоадипиновую кислоту, бета-аланин, аминопропионовую кислоту, 2-аминомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, 6-аминокапроновую кислоту, 2-аминогептановую кислоту, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминоизомасляную кислоту, 2-аминопимелиновую кислоту, третичный бутилглицин, 2,4-диаминоизомасляную кислоту, десмозин, 2,2'-диаминопимелиновую кислоту, 2,3-диаминопропионовую кислоту, N-этилглицин, N-этиласпарагин, гомопролин, гидроксилизин, алло-гидроксилизин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин, изодесмозин, алло-изолейцин, N-метилаланин, N-метилглицин, N-метилизолейцин, N-метилпентилглицин, N-метилвалин, нафталанин, норвалин, норлейцин, орнитин, пентилглицин, пипеколиновую кислоту и тиопролин. Дополнительные неприродные аминокислоты включают в себя модифицированные аминокислотные остатки, которые химически блокированы, обратимо или необратимо, или химически модифицированы по N-концевой аминогруппе или их боковым цепям, как, например, N-метилированные D и L аминокислоты или остатки, где фунциональные группы боковых цепей химически модифицированы в другую функциональную группу. Например, модифицированные аминокислоты включают в себя метионин сульфоксид; метионин сульфон; (сложный бета-метиловый эфир) аспарагиновой кислоты, модифицированные аминокислоты аспарагиновой кислоты; N-этилглицин, модифицированную аминокислоту глицин; или аланин карбоксамид, модифицированную аминокислоту аланина. Дополнительные остатки, которые могут быть включены, описаны в публикации Sandberg et al., J. Med. Chem. 41: 2481-91, 1998.

В общем аспекте соединения данного изобретения содержат, по меньшей мере, петлевой фрагмент, α-спиральный участок и С-концевой хвост. Петлевой фрагмент содержит аминокислотную последовательность, включающую в себя формулу Х-Хаа1 последовательность-Y, где Х и Y способны образовать связь и представляют собой независимо выбранные остатки, имеющие боковые цепи, которые химически связаны друг с другом с образованием внутримолекулярной связи, такой как дисульфидные связи; амидная связь; алкиловые кислоты и алкиламины, которые могут образовывать циклические лактамы; алкилальдегиды или алкилгалиды и алкиламины, которые могут быть конденсированы и восстановлены с образованием алкиламинового или иминового мостика; или боковые цепи, которые могут быть соединены с образованием алкильной, алкенильной, алкинильной, эфирной или тиоэфирной связи. Алкильные цепи могут включать в себя низшие алкильные группы, имеющие примерно от 1 примерно до 6 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления внутримолекулярная связь может представлять собой дисульфидную, амидную, иминную, аминную и алкенную связь. В некоторых вариантах осуществления, Х и Y независимо выбраны из Ser, Asp, Glu, Lys, Orn или Cys. В некоторых вариантах осуществления, Х и Y представляют собой Cys и Cys. В других вариантах осуществления, Х и Y представляют собой Ser и Ser. В других вариантах осуществления Х и Y представляют собой Asp и Lys или Lys и Asp.

Последовательность Xaa1 включает в себя аминокислотную последовательность 3, 4, 5 или 6 аминокислот между Х и Y. В некоторых вариантах осуществления последовательность Xaa1 включает в себя аминокислотную последовательность, имеющую участок с одним или несколькими замещенными или незамещенными остатками, содержащими гидроксил, после Y, например, участок с гидроксилсодержащим остатком может иметь, по меньшей мере, 2 из 3 аминокислот, смежных с Y, которые представляют собой либо Ser, либо Thr. Другие аминокислоты в последовательности Xaa1 могут представлять собой любую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления последовательность Xaa1 представляет собой 3 аминокислоты. В других вариантах осуществления последовательность Xaa1 представляет собой 4 аминокислоты. В других вариантах осуществления последовательность Xaa1 представляет собой 5 аминокислот. Еще в других вариантах осуществления последовательность Xaa1 представляет собой 6 аминокислот. Соответственно Xaa1 может быть представлена в виде Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7 (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления, Хаа2, Хаа3 и/или Хаа4 могут отсутствовать. В некоторых вариантах осуществления Хаа5, Хаа6 и Хаа7 включают в себя участок с гидроксилсодержащим остатком. По существу, по меньшей мере две из трех аминокислот могут представлять собой Ser, hSer, Thr, аллоТhr, d-Thr или другие их неприродные аналоги. Хаа2 может представлять собой любую аминокислоту или отсутствовать, Хаа3 может представлять собой любую аминокислоту или отсутствовать, Хаа4 может представлять собой любую аминокислоту или отсутствовать, Хаа5 может представлять собой любую аминокислоту, если Хаа6 представляет собой Ser или Thr, a Хаа7 представляет собой Ser или Thr, Хаа6 может представлять собой любую аминокислоту, если Хаа5 представляет собой Ser или Thr, a Хаа7 представляет собой Ser или Thr, Хаа7 может представлять собой любую аминокислоту, если Хаа5 представляет собой Ser или Thr, а Хаа6 представляет собой Ser или Thr. Соответственно в определенном варианте осуществления Xaa1 может быть представлен в виде: Хаа2 отсутствует, Хаа3 предствляет собой Ala, Gly, Ser, Asp или отсутствует, Хаа4 представляет собой Asn, Ala, Asp, Gly или отсутствует; Хаа5 представляет собой Ala, Leu, Thr или Ser; Хаа6 представляет собой Ala, Ser или Thr; a Хаа7 представляет собой Ala, Ser, Val, Hse, (S)-2-амино-3-гидрокси-метилбутановую кислоту (Ahb), (2S, 3R)-2-амино-3-гидрокси-метилпентановую кислоту (Ahp), D-Thr, Thr или их производные. В других вариантах осуществления Xaa1 может быть представлен в виде: Хаа2 отсутствует, Хаа3 представляет собой Ser, Gly или отсутствует, Хаа4 представляет собой Asn или Asp, Хаа5 представляет собой Ala, Ser, Thr или Leu, Хаа6 представляет собой Ala, Thr или Ser, a Хаа7 представляет собой Ser, D-Thr, аллоТhr или Thr. В некоторых вариантах осуществления, петлевой фрагмент включает в себя вышеуказанные описания Xaa1, где Хаа3 представляет собой Ala, где Хаа3 представляет собой Ser, или где Хаа3 представляет собой Gly. Альтернативно или дополнительно петлевой фрагмент включает в себя описанные выше обозначения Xaa1, где Хаа4 представляет собой Ala, где Хаа4 представляет собой Asn, где Хаа4 представляет собой Asp, или где Хаа4 представляет собой Gly. Альтернативно или дополнительно петлевой фрагмент включает в себя описанные выше обозначения Xaa1, где Хаа5 представляет собой Ala, где Хаа5 представляет собой Thr, или где Хаа5 представляет собой Leu. Альтернативно или дополнительно, петлевой фрагмент включает в себя описанные выше обозначения Xaa1, где Хаа6 представляет собой Ser или где Хаа6 представляет собой Ala. Альтернативно или дополнительно петлевой фрагмент включает в себя описанные выше обозначения Xaa1, где Хаа7 представляет собой Thr, или где Хаа7 представляет собой D-Thr. Дополнительно предполагается, что не более одной, двух или трех модификаций, таких как замены, вставки, делеции и/или получение производных, могут быть сделаны в отношении петлевого фрагмента.

Следует отметить, что по всей заявке альтернативы написаны в группах Маркуша, например, каждое положение аминокислоты, которое содержит больше одной возможной аминокислоты. В частности, предполагается, что каждый член группы Маркуша следует рассматривать отдельно, тем самым включая другой вариант осуществления изобретения, и группу Маркуша не следует принимать за одну единицу.

Примеры петлевого участка по данному изобретению включают в себя, но не только, C-N-T-A-T-C (SEQ ID NO: 6); С-А-Т-А-Т-С (SEQ ID NO: 7); C-D-T-A-T-C (SEQ ID NO: 8); C-G-T-A-T-C (SEQ ID NO: 9); C-N-A-A-T-C (SEQ ID NO: 10); C-N-T-S-T-C (SEQ ID NO: 11); C-N-T-A-dThr-C (SEQ ID NO: 12); C-N-T-A-T(OPO3H2)-С (SEQ ID NO: 13); C-N-T-A-S-C (SEQ ID NO: 14); C-N-T-A-A-C (SEQ ID NO: 15); C-N-T-A-V-C (SEQ ID NO: 16); C-N-T-A-Hse-C (SEQ ID NO: 17); C-N-T-A-Ahb-C (SEQ ID NO: 18); C-N-T-A-Ahp-C (SEQ ID NO: 19); C-S-N-L-S-T-C (SEQ ID NO: 20); C-G-N-L-S-T-C (SEQ ID NO: 21); C-A-N-L-S-T-C (SEQ ID NO: 22); C-S-A-L-S-T-C (SEQ ID NO: 23); C-S-N-A-S-T-C (SEQ ID NO: 24); C-S-N-L-A-T-C (SEQ ID NO: 25); и C-S-N-L-S-A-C (SEQ ID NO: 26). Как отмечалось ранее, дополнительно предполагается, что не более одной, двух или трех модификаций, таких как замены, вставки, делеции и/или получение производных, может быть сделано в отношении петлевого участка.

Петлевой участок новых соединений дополнительно может включать в себя модификации или добавочные аминокислоты на N-конце. Такие модификации включают в себя добавление таких соединений, как Lys, Ala, Phe, lie, Ser, октилглицин, изокап, Fmoc-3,6-диоксиоктановая кислота, Fmoc-1-амино-4,7,10-триокса-13-тридеканаминсукциниминовая кислота, ацетил и/или группы для растворимости, доставки, передачи сигнала. Примеры модифицированных петель включают в себя добавление Lys к последовательности Xaa1, или добавление Ilе к последовательности Xaa1. Например, модифицированный петлевой фрагмент может представлять собой K-C-N-T-A-T-C (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах осуществления добавления и/или модификации на N-конце петлевого фрагмента могут изменять петлевой фрагмент. Например, петлевой фрагмент по данному изобретению может быть модифицирован следующим образом: цикло(2,7) 1-7 hАмилин, цикло (2Asp 7Lys) 1-7 hАмилин, N-изокапроил 1-7 hАмилин, N-3,6 диоксаоктаноил 1-7 hАмилин, L-Октилглицин 1-7 hАмилин, Ацетил (2Agy, 7Agy) 1-7 hАмилин, где Agy представляет собой аллилглицин, Ацетил (1Ala) 1-7 hАмилин, (lThr 3Asp) 1-7 hАмилин, Изокап (7Ala) 5-7 sCT, ацетил (2Agy, 7Agy) 1-7 sCT и цикло (1,7) (1Asp 7Lys) 1-7 sCT. Следовательно, беря в пример Isocap (7Ala) 5-7 sCT, отдельные варианты осуществления данного изобретения включают в себя модификацию на N-концевом участке петлевого фрагмента данного изобретения, так, что аминокислоты с Хаа2 по Хаа5 отсутствуют.

По всей заявке аминокислотные последовательности могут быть названы аминокислотами в положении от а до положения b, примыкающими к эталонному пептиду. В настоящей заявке эталонным пептидом является амилин и кальцитонин, последовательности которых приведены в SEQ ID NOS:1-4, например, в предыдущем абзаце, 1-7 hАмилин относится к аминокислотной последовательности от положения 1 до положения 7, включительно, амилина человека (SEQ ID NO: 1). Модификации в отношении эталонного пептида могут быть показаны как: положение модификации вместе с модификацией. Например (2Asp 7Lys) 1-7 hАмилин представляет аминокислотную последовательность в положениях 1-7 амилина человека с изменением Cys на Asp в положении 2 и изменением а Суs на Lys в положении 7.

α-спиральный участок нового соединения может быть длиной примерно от 8 до 23 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления α-петлевой участок содержит примерно от 3 до 6 витков спирали. В некоторых вариантах осуществления α-спиральный участок содержит 3, 4, 5 или 6 витков спирали. В других вариантах осуществления α- спиральный участок представляет собой жесткую структуру, эквивалентную примерно 3, 4, 5 или 6 виткам спирали. Примером идеальной спирали является LLQQLQKLLQKLKQY (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления α-спираль представляет собой амфипатическую структуру. Соответственно могут быть выбраны свойства желаемых аминокислот, которые бы обеспечил данный тип структуры.

Было обнаружено, что α-спиральный участок кальцитонина, комбинация α-спирального участка амилина и кальцитонина или их частей, и/или некоторых элементов CGRP целесообразны в α-спиральном участке новых соединений. Предполагается, что, как и в случае петлевого фрагмента, α-спиральный участок может быть из любого амилина или кальцитонина или их аналогов. Соответственно в некоторых вариантах осуществления α-спиральный участок представляет собой, по меньшей мере, часть α-спирального участка кальцитонина или аналога кальцитонина. В других вариантах осуществления α-спиральный участок представляет собой по меньшей мере часть α-спирального участка кальцитонина или аналога кальцитонина и, по меньшей мере, часть α- спирали амилина или аналога амилина. В других вариантах осуществления α-спиральный участок новых соединений содержит элементы CGRP. Также предполагается, что новые соединения могут иметь не более одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти дополнительных модификаций, таких как замены, вставки, делеции и/или получение производных.

В некоторых вариантах осуществления α-спир