Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса блютанга методом полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации

Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест-система для выявления генома вируса блютанга методом полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики и специфической профилактики.

Блютанг (катаральная лихорадка овец) - инфекционная вирусная болезнь овец, коз, крупного рогатого скота (КРС), передающаяся кровососущими насекомыми рода Culicoides, протекающая эпизоотически. У КРС болезнь протекает как латентные инфекции, особенно в эпизоотических зонах, и только у 5% инфицированных животных болезнь клинически выражена. Поэтому для выявления латентной формы болезни нужно иметь экспресс-метод обнаружения вируса у клинически здоровых животных.

В настоящее время для диагностики вирусных и бактериальных болезней используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Известен способ обнаружения вируса блютанга с помощью ПЦР, который включает три отдельные процедуры. На первой стадии РНК вируса блютанга экстрагируют из крови с использованием вызывающего диссоциацию агента, второй процедурой является денатурирование вирусной РНК и обратная транскрипция с целью синтеза кДНК, которая амплифицируется при постановке ПЦР, при этом в качестве мишени использован ген NS1, третьей процедурой - анализ ПЦР-продукта методом гель-электрофореза [1].

МЭБ (Международное эпизоотическое бюро) регламентирует правила постановки ПЦР при выявлении генома вируса блютанга. Эти правила предусматривают для денатурации двухцепочечной РНК применение в реакции метилгидроксид ртути, который, встраиваясь между ними, разрывает водородную связь.

Вторым недостатком данных способов является то, что перед постановкой реакции требуется предварительное выделение форменных элементов из крови, что достаточно трудоемко и требует специальных навыков.

Целью изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров и более общедоступного, безопасного и быстрого способа и соответствующей тест-системы для обнаружения РНК вируса блютанга методом ПЦР в формате электрофоретической детекции продуктов амплификации.

Поставленная цель достигается тем, что для постановки ПЦР подобраны и синтезированы две пары олигонуклеотидных праймеров:

5'-gttaaaaatctatagagatg-3'

5'-gtaagtgtaatctaagaga-3'

5'-acaactgatgctgcgaatga-3'

5'-aacccacacccgtgctaagtgg-3'

Праймеры комплементарны консервативной области генома NS1 вируса блютанга с предварительным циклом денатурации 94°С 3 мин, с последующими 30 циклами амплификации при температуре денатурации 94°С 10 с, отжига 55°С 20 с, элонгации при 72°С 15 с, с завершающим циклом элонгации 72°С в течение 1 мин, затем проводят оценку результатов реакции без предварительной рестрикции полученного продукта. Способ выявления РНК вируса катаральной лихорадки овец в образцах крови, пробах органов латентно инфицированных, больных и павших животных и/или в инфицированной культуре клеток включает предварительную денатурацию вирусной РНК при 88°С в течение 5 мин с последующей ее инкубацией в охлажденном при -40°С - -70°С песке в течение 1 мин. Синтез кДНК проводится при 42°С в течение 20 мин.

Тест-система состоит из трех отдельных наборов с пластиковыми флаконами и пробирками.

Набор 1 - для выделения нуклеиновых кислот, содержащий нуклеосорбент с отмывочным буфером на основе гуанидинтиоционата, буфер для реакции, отрицательный контроль.

Набор 2 - для постановки ПЦР, включающий пластиковые пробирки, содержащие олигонуклеотидные праймеры, термостабильный фермент Taq-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции, положительный контроль.

Набор 3 - для проведения электрофореза, содержащий агарозу, буфер для электрофореза.

Первый набор позволяет быстро и качественно выделить РНК вируса блютанга без предварительной подготовки суспензии из органов и выделения форменных элементов из крови.

При постановке ПЦР во втором наборе производится денатурация сегментированной двухцепочечной РНК предварительным прогревом ее до 88°С с последующей инкубацией в охлажденном при -40°С - -70°С песке и одновременной гибридизацией праймеров, что заменяет использование метилгидроксида ртути. В процессе амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивается в миллионы раз, что позволяет визуально учитывать результаты анализа при проведении электрофоретического разделения продуктов амплификации в агарозном геле (третий набор).

Оценку результатов реакции проводят без предварительной рестрикции полученного продукта. Результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 800 пар оснований.

Техническим результатом изобретения является общедоступность, безопасность, чувствительность, а также сокращение времени проведения диагностической работы с пробами органов и крови от больных и латентно инфицированных животных.

Сущность изобретения заключается в том, что выявление вируса блютанга проводят методом полимеразной цепной реакции, предусматривающим амплификацию кДНК вируса, перенос продукта амплификации на гель и оценку результатов амплификации. Синтезируется фрагмент, который в геле агарозы соответствует размеру 800 п.о. Для определения размера фрагмента вносится маркер молекулярного веса.

Существенным отличием заявляемого способа является следующее:

1. Анализ можно проводить из стабилизированной крови, при этом не требуется предварительного выделения из нее форменных элементов, как это делалось в известном способе. Таким образом, значительно сокращается время постановки реакции.

2. При постановке реакции не используется метилгидроксид ртути, а проводится денатурация сегментированной двухцепочечной РНК предварительным прогревом ее до 88°С с одновременной гибридизацией праймеров путем инкубации в охлажденном при -40°С - -70°С песке для предотвращения соединения цепей РНК

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Тест-система укомплектована пластиковыми флаконами и пробирками.

Пример 1. Набор 1 для выявления нуклеиновых кислоты используют для работы с пробами органов, культуральным вируссодержащим материалом и кровью.

Исследуемый материал (кровь, смывы, мазки, 10% суспензия органов) в объеме 25-100 микролитров (далее мкл) вносят в 1,5 см³ пробирку и добавляют лизирующий буфер на основе гуанидинтиоцианата и 20 мкл нуклеосорбента. В течение 5 мин пробы инкубируют при 65°С. Пробирки центрифугируют при 5000 об/мин и удаляют надосадочную жидкость. В пробирки вносят 200 мкл отмывочного буфера, встряхивают пробирки и центрифугируют при 5000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. В пробирки вносят 500 мкл 70%-ного спирта. Пробирки встряхивают и центрифугируют при 12000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Пробирки инкубируют 5 мин при 56°С и вносят в пробирки 50 мкл бидистиллированной воды, тем самым эллюируя нуклеиновые кислоты с нуклеосорбента в воду. 5-10 мкл этого раствора используют для дальнейшего синтеза комплементарной ДНК.

Пример 2. Амплификация участка РНК (фрагмент гена NS1) вируса блютанга с применением набора 2 для проведения ПЦР и синтетическими олигонуклеотидами

Тест-система апробирована на различных серотипах вируса блютанга. В качестве отрицательных контролей использованы родственные орбивирусы - штаммы вируса АЧЛ, ЭГБО и Ибараки.

Подготавливают и подписывают пробирки объемом 0,5 см³ для N-количества образцов, в число которых входят анализируемые пробы. В каждую пробирку добавляют 3,0 мкл праймеров.

В пробирки вносят 5,0 мкл исследуемой РНК. Проводят предварительный отжиг праймеров, прогревая смесь на амплификаторе с температурным режимом:

денатурация 88°С - 5 мин 1 цикл

Затем пробирки немедленно помещают в ледяную баню (-70°С) на 2 мин.

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на N-количество образцов, состоящую из буфера для ревертазы, 2,5 mM каждого dNTP, 10 mM каждого праймера, 2 ед. ревертазы. Реакционную смесь быстро добавляют в охлажденные пробирки и пробы вносят в амплификатор со следующим температурным режимом:

синтез кДНК 42°С - 30 мин 1 цикл

Затем пробирки инкубируют в охлажденном песке (-40 - -70°С) на 2 мин.

Инкубационная смесь для ПЦР с конечным объемом 25 мкл содержит:

буфер для Taq-полимеразы с 15 mM MgCl₂, 2,5 mM каждого dNTP, 10 mM каждого праймера, 5 ед. Taq-полимеразы. Реакционную смесь быстро добавляют в охлажденные пробирки.

Температурный режим проведения ПЦР показан в таблице 1.

Таблица 1
Процесс	Температура	Время	Циклов
Денатурация	94°С	3 мин	1
Денатурация	94°С	10 с	30
Отжиг	55°С	20 с
Элонгация	72°С	15 с
Элонгация	72°С	1 мин	1

Проведение второго раунда ПЦР:

Проводят с аналогичной ПЦР-смесью в том же режиме.

Пример 3. Определение размера продуктов ПЦР с использованием набора 3 для проведения электрофореза

Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-борном буфере.

10 мкл продукта ПЦР смешивают с 2 мкл буфера для нанесения образца и вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 мин). Результат электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Результат считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента 800 пар оснований.

С применением тест-системы и указанных праймеров выявлялись все исследуемые образцы вируса блютанга. Отрицательные контроли не амплифицировались.

Пример 4. Определение чувствительности и специфичности ПЦР на основе синтетических праймеров, синтезированных на район гена NS1

Определение чувствительности разработанного метода ПЦР показало, что с помощью подобранных праймеров можно выявить наличие возбудителя, когда титр инфекционности не превышает значений 5,5-6,0 lg ТЦД 50/мл (табл.2).

Таблица 2
Результаты проведения ПЦР с праймерами, комплементарными гену NS1 вируса блютанга
№	Наименование препаратов	Титр вирусаТЦД50/мл	Шифр	Ожидаемый результат
1	вирус блютанга штамм 608 (тип 4), 22.02.2002, лиоф. высуш.	5,5	12	+
2	вирус блютанга штамм 636 (тип 9), 01.03.2002, лиоф. высуш.	4,5	2	+
3	вирус блютанга штамм 617 (тип 14), 01.03.2002, лиоф. высуш.	6,0	13	+
4	вирус блютанга штамм 874 (тип 2), 01.03.2002, культура клеток	6,0	4	+
5	вирус блютанга штамм «Ильичевский» (не типирован), 01.03.2002, культура клеток	5,0	14	+
6	вирус блютанга штамм «Нахичевань» (не типирован), 04.07.1971, культура клеток	-	6	+
7	вирус АЧЛ серотип 2, 23.04.2001, лиоф. высуш.	5,25	7	-
8	вирус АЧЛ серотип 3, 10.04.2001, лиоф. высуш.	5,0	8	-
9	вирус АЧЛ серотип 4, 16.11.2000, лиоф, высуш.	4,75	9	-
10	вирус АЧЛ серотип 6, 16.11.2000, лиоф, высуш.	5,25	10	-
11	вирус ЭГБО штамм «Нью-Джерси», 22.02.1987, лиоф. высуш.	6,0	11	-
12	вирус Ибараки штамм Са саки, 05.06.1991, лиоф. высуш.	6,0	1	-
13	Проба головного мозга интактной мыши	-	3	-
14	Проба головного мозга здоровой овцы	-	5	-

Тест-система и синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность и чувствительность. Установлено, что тест-система не амплифицирует РНК других бактерий и вирусов.

Пример 5. Выявление РНК вируса блютанга с применением предлагаемой тест-системы и синтетических олигонуклеотидов в пробах биологического материала, полученного от больных животных

При исследовании более 1000 полевых образцов крови и органов, поступавших из различных регионов страны с подозрением на вирус блютанга, были специфично обнаружены все инфицированные пробы.

Каждая проба после проведения ПЦР была секвинирована и тем самым были

подтверждены результаты.

Таким образом, предлагаемые тест-система и способ позволяют достичь высокого уровня общедоступности, безопасности, чувствительности с помощью двух пар праймеров, провести идентификацию возбудителя в течение 4-6 часов.

С помощью разработанных способа и тест-системы можно выявить наличие вируса не только у больных и павших животных, но и при персистенции вакцинного вируса или у животных в латентной стадии заболевания.

Источники информации

1. Billinis С., Koumbati M., Spyrou V., Nomikou К., Mangana О., Panagiotidis С.А. & Papadopoulos О. (2001). Bluetongue virus diagnosis of clinical cases by a duplex reverse transcription-PCR: a comparison with conventional methods. J. Virol. Methods, 98, 77-89.

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высококонсервативной области генома NS1 вируса блютанга, используемые для выявления РНК вируса блютанга, имеющие следующий нуклеотидный состав:5'-gttaaaaatctatagagatg-3',5'-gtaagtgtaatctaagaga-3',5'-acaactgatgctgcgaatga-3',5'-aacccacacccgtgctaagtgg-3'.

2. Способ выявления РНК вируса катаральной лихорадки овец, включающий выделение РНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров, амплификацию РНК вируса, оценку проведения реакции гель-электрофорезом в агарозе, отличающийся тем, что проводят предварительную денатурацию вирусной РНК при 88°С в течение 5 мин с последующей ее инкубацией в охлажденном при (-40)÷(-70)°С песке, синтез кДНК проводят при 42°С в течение 30 мин, а для постановки ПНР подобраны и синтезированы две пары олигонуклеотидных праймеров по п.1, с предварительным циклом денатурации 94°С 3 мин, с последующими 30 циклами амплификации при температуре денатурации 94°C 10 с, отжига 55°С 20 с, элонгации при 72°С 15 с, с завершающим циклом элонгации 72°С в течение 1 мин, затем проводят оценку результатов реакции без предварительной рестрикции полученного продукта, при этом результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 800 пар оснований.

3. Тест-система для выявления РНК вируса катаральной лихорадки овец, включающая пластиковые флаконы и пробирки, термостабильный фермент Taq-полимеразу, ПЦР-смесь для постановки реакции, положительный и отрицательный контроли, отличающаяся тем, что содержит три набора: 1. набор для выявления нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеосорбент с отмывочным буфером на основе гуанидинтиоционата, буфер для реакции, отрицательный контроль; 2. набор для проведения ПЦР, включающий пластиковые пробирки, содержащие синтетические праймеры по п.1; 3. набор для проведения электрофореза, содержащий агарозу, буфер для электрофореза.