Способ получения тартрата эпоксиагроклавина-i и хиноцитрининов

Способ получения тартрата эпоксиагроклавина-i и хиноцитрининов

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и касается способа получения тартрата эпоксиагроклавина-I и хиноцитрининов.

Эпоксиагроклавин-I - 6,8 диметил-8,9-эпоксиэрголин - это клавиновый эргоалкалоид, имеющий необычную стереохимию 5R-, 10S- конфигурации эрголинового ядра. Ранее проведенные исследования фармакологической активности эпоксиагроклавина-I показали, что соединение обладает нейротропной активностью, оказывает умеренное гипотензивное действие, замедляет частоту сердечных сокращений, снижает реактивность сосудистой системы на норадреналин (Козловский А.Г. Исследование алкалоидов сапрофитных грибов: биосинтез, структура, свойства, химико-микробиологический синтез. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. Приложение. Пущино, ИБФМ РАН. 1987. С.35-40).

Выявленные эффекты свидетельствовали о том, что исследуемое соединение обладает полезными терапевтическими свойствами и представляет интерес с целью более широкого фармакологического исследования и возможного внедрения его в практическую медицину. Кроме того, эпоксиагроклавин-I является удобным объектом для получения производных эрголиновых алкалоидов. Наличие эпоксигруппы в положении 8,9 в структуре эпоксиагроклавина-I в качестве реакционного центра представляет исключительный интерес для получения практически любых производных, биологическую активность которых можно варьировать, меняя характер заместителей в кольце D эрголина.

При нагревании эпоксиагроклавина-I в водном растворе соляной кислоты найдены продукты присоединения HCl по эпоксигруппе 8-Cl, 9-ОН-агроклавин-I и 8-ОН, 9-Cl - агроклавин - I. При нагревании растворов эпоксиагроклавина-I в этиловом спирте в присутствии катализатора происходит образование продуктов присоединения этилового спирта по эпоксигруппе. Образование гликоля-8,9-диоксиагроклавина-I водным раствором H₂SO₄. При взаимодействии эпоксиагроклавина-I с уксусной кислотой образуются оксиацетаты и диацетат агроклавина-I.

Эпоксиагроклавин-I продуцируется ограниченным числом штаммов пенициллов. Впервые эпоксиагроклавин-I был выделен из гриба Penicillium corylophilum ИБФМ F-152, позднее переопределенного в Р. kapusciskii (=P. janczewskii) (Козловский А.Г., Соловьева Т.О., Сахаровский В.Г., Аданин В.М. Эргоалкалоиды агроклавин-I и эпоксиагроклавин-I - метаболиты Penicillium corylophilum. Прикладная биохимия и микробиология. 1982. Т.18. №4. С.525-541). На данное изобретение было выдано авт.св. SU955693, С12Р 17/00, 1984.04.23.

Штамм гриба Penicillium corylophilum ИБФМ F-152 выращивают глубинным способом при t=24°C при перемешивании в колбах объемом 750 мл со 150 мл среды состава, (г/л):

Маннит	50,0
Янтарная кислота	5,40
MgSO4·7H2O	0,30
KH2PO4	1,00
25%-ный NH4OH	До рН 5,4

Длительность культивирования 14-16 сут (5-7 сут - выращивание посевного материала, 9 сут - основная ферментация).

Эпоксиагроклавин-I выделяют экстракцией фильтрата культуральной жидкости хлороформом при щелочных значениях рН с последующим разделением методом колоночной хроматографии и высаживанием из хлороформа гексаном. Из 1 л культуральной жидкости после выделения и очистки с помощью колоночной хроматографии получают 90 мг эпоксиагроклавина-I.

Недостатком способа является высокая себестоимость среды, длительность выделения и очистки эпоксиагроклавина-I из культуральной жидкости, занимающая более суток, и нестабильность соединения при длительном хранении, так как эпоксиагроклавин-I легко окисляется.

В литературе имеются сведения о синтезе эпоксиагроклавина-I штаммов Penicillium fellutanum BKM FW-1073 (=P. sizovae), выделенного из почв Сирии в 1969 г. (Козловский А.Г., Веприцкая И.Г., Гаязова Н.Б. Алкалоидообразование у гриба Penicillium sizovae. Прикладная биохимия и микробиология. 1986. Т.XXII. Вып.2. С.205-210). Штамм выращивали глубинным способом при t=24°C в течение 17 сут (4 сут - выращивание посевного материала, 13 сут - основная ферментация) на среде состава, г/л:

Маннит	50,0
Янтарная кислота	5,4
MgSO4·7Н2О	0,3,
KH 2 PO 4	1,0,
25%-ный NH4OH	До рН 5,4

Концентрация эпоксиагроклавина-I в культуральной жидкости составляет 75 мг/л по данным УФ-спектроскопии после препаративной ТСХ на силикагеле.

Недостатком является низкая концентрация эпоксиагроклавина-I в культуральной жидкости, не описано выделение целевого продукта.

Описано получение эпоксиагроклавина-I с помощью гриба Penicillium citrinum BKM FW-800 (Козловский А.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М., Антипова Т.В., Озерская С.М., Кочкина Г.А., Грефе У. Гриб Penicillium citrinum Thorn 1910 BKM FW-800, выделенный из вечномерзлотных древних отложений, как продуцент эргоалкалоидов агроклавина-I и эпоксиагроклавина-I. Микробиология. 2003. Т.72. №6. С.816-821). Штамм культивируют на среде состава (г/л): маннит - 50, янтарная кислота - 5,4, MgSO₄·7H₂O - 0,3, KH₂PO₄ - 1,0, 25%-ный NH₄OH - до рН 5,4 при t=24°С в течение 27 сут (14 сут - выращивание посевного материала, 12 сут - основная ферментация). Фильтрат культуральной жидкости подкисляют 2%-ной винной кислотой до рН 3,5-4,0 и трижды экстрагируют хлороформом.

Затем водную фазу подщелачивают концентрированным аммиаком до рН 8,0-9,0 и также экстрагируют хлороформом. Щелочной экстракт используют для выделения эпоксиагроклавина-I с помощью метода колоночной хроматографии на силикагеле (Silicagel 60, 0,040-0,063 мм, "Merck", Германия), вес сорбента - 60 г, диаметр колонки 20 мм, элюент - система растворителей хлороформ: метанол: NH₄OH в соотношении 90:10:0,1. Объем фракций 5 мл. Из 1 л культуральной жидкости получают 30,4 мг эпоксиагроклавина-I.

Недостатком способа является высокая себестоимость среды, длительность выделения, занимающая более суток, низкая концентрация в культуральной жидкости и нестабильность соединения при длительном хранении.

Хиноцитринины А (транс-изомер) и Б (цис-изомер) - это вторичные метаболиты, относящиеся к хинолиновым алкалоидам. Они эффективны против грамположительных, грамотрицательных бактерий, дрожжей и грибов. Причем антибактериальная и антифунгальная активность хиноцитринина А и Б была одинакова. Хиноцитринины также обладают цитотоксичностью для опухолевых клеток. Причем хиноцитринин А более эффективен по сравнению с хиноцитринином Б. Так, ингибирующая концентрация (LC₅₀ мкг/мл) для клеток фибробластов мышей линии L-929 составила 33,1; 18,6, для клеток лейкемии человека линии К-562 - 19,5; 7,8 и HeLa>50; >50 для хиноцитринина А и Б соответственно.

Известен способ получения хиноцитрининов с помощью гриба Penicillium citrmum BKM FW-800 (Kozlovsky, A.G., Zhelifonova, V.P., Antipova T.V., Adanin, V.M., Ozerskaya, S.M., Kochkina, G.A., Schlegel, В., Dahse, H.M., Gollmick, F.A., and Grafe, U., Qumocitrinines A and B, new quinoline alkaloids from Penicillium citrmum VKM FW-800, a permafrost fungus. J.Antibiotics. 2003. V.56. №5. P.488-491). Продуцент выращивают глубинным способом в колбах объемом 750 мл со 150 мл среды состава, (г/л): маннит - 50, янтарная кислота - 5,4, MgSO₄·7Н₂О - 0,3, KH₂PO₄ - 1,0, 25%-ный NH₄OH - до рН 5,2 при t=24°C.

Культивирование проводят 11-13 сут. Хиноцитринины выделяют из культуральной жидкости. Для этого фильтрат культуральной жидкости подкисляют 2%-винной кислотой до рН 3~4 и трижды экстрагируют хлороформом. Дальнейшую очистку проводят с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (Silicagel 60, 0,063-0,1 мм, "Merck", Германия). Элюирование вначале проводят в системе растворителей хлороформ: метанол: NH₄OH в соотношении 90:10:0,1, а затем в соотношении 80:20:0,2.

Недостатком способа является высокая себестоимость среды, длительность очистки хиноцитрининов, занимающая более суток. Не указано содержание хиноцитрининов в культуральной жидкости.

Наиболее близким к предлагаемому по совокупности существенных признаков является способ получения хиноцитрининов и эргоалкалоидов, в том числе и эпоксиагроклавина-I, с помощью Penicillium citrmum BKM FW-800 (Козловский А.Г., Желифонова В.П., Антипова В.П. Гриб Penicillium citrmum, выделенный из вечномерзлотных отложений, как продуцент эргоалкалоидов и новых хинолиновых алкалоидов хиноцитрининов. Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т.41. №5. С.568-572).

Согласно этому способу штамм культивируют в колбах объемом 750 мл со 150 мл среды состава (г/л);

Маннит	50,0
Янтарная кислота	5,4
MgSO4-7H2O	0,3
KH2PO4	1,0
ZnSO4·7H2O	0,0044
25%-ный NH4ОH	До рН 5,4

при t=24°C в течение 27 сут (14 сут - выращивание посевного материала, 13 сут - основная ферментация).

Хиноцитринины выделяют из фильтрата культуральной жидкости при кислых значениях рН, а эпоксиагроклавин-I при щелочных значениях рН.

Содержание эргоалкалоидов и хиноцитрининов определяют УФ-спектрофотометрически после препаративной ТСХ. В культуральной жидкости концентрация эпоксиагроклавина-I - 72 мг/л, хиноцитрининов - 38 мг/л. Выделение целевых продуктов из культуральной жидкости не описано.

Недостатком этого способа является высокая себестоимость среды, низкая концентрация эпоксиагроклавина-I в культуральной жидкости и нестабильность эпоксиагроклавина-I при длительном хранении.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка нового микробиологического способа получения эпоксиагроклавина-I и хиноцитрининов.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в увеличении содержания эпоксиагроклавина-I в культуральной жидкости, в упрощении методов очистки эпоксиагроклавина-I и хиноцитрининов, снижении себестоимости среды, увеличении срока хранения эпоксиагроклавана-I за счет получения более стабильной соли - тартрата эпоксиагроклавана-I.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что гриб Penicillium citrinum BKM F-4043 D (ранее - Penicillium citrmum BKM FW-800) культивируют на минеральной среде следующего состава, г/л:

Сахароза	50,00-100,00
Мочевина	2,14-4,28
KH2PO4	1,00-2,00
MgSO4×7H2O	0,30-0,60
ZnSO4×7H2O	0,0044-0,0088
Вода дистиллированная	До 1 л

Эпоксиагроклавин-I выделяют из культуральной жидкости с использованием экстракции хлороформом при кислых и щелочных значениях рН. Полученные хлороформные экстракты обезвоживают и концентрируют в вакууме.

Содержание эпоксиагроклавина-I в культуральной жидкости определяют методом УФ-спектроскопии, для этого навеску щелочного экстракта растворяют в метаноле и измеряют оптическую плотность при λ=282 нм на спектрофотометре (Козловский А.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М., Антипова Т.В., Озерская С.М., Кочкина Г.А., Грефе У. Гриб Penicillium citrinum Thorn 1910 BKM FW-800, выделенный из вечномерзлотных древних отложений, как продуцент эргоалкалоидов агроклавина-1 и эпоксиагроклавина-I. Микробиология. 2003. Т.72. №6. С.816-821).

Для получения тартрата эпоксиагроклавина-I щелочной экстракт растворяют в минимальном количестве ацетона (раствор 1). Готовят насыщенный раствор винной кислоты в метаноле (раствор 2). Количество винной кислоты рассчитывают, исходя из данных по количественному определению эпоксиагроклавина-I в экстракте культуральной жидкости (методом УФ-спектроскопии). На 1 моль эпоксиагроклавина-I требуется 1 моль винной кислоты. В раствор 1 добавляют постепенно при перемешивании раствор 2. Практически сразу выпадает светло-коричневый осадок. Маточник отделяют декантированием. Осадок промывают ацетоном. Промывной ацетон декантируют. Образовавшийся рассыпчатый светло - коричневый осадок является тартратом эпоксиагроклавина-I.

Полученный кислый экстракт используют для выделения хиноцитрининов. Для определения содержания хиноцитрининов навеску кислого экстракта растворяют в метаноле. На пластинке Silufol отмечают линию на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки и точку на расстоянии 1 см от боковой линии, полученный метанольный раствор наносят микропипеткой по длине линии. В точку наносят стандартный раствор хиноцитрининов. Пластинку с нанесенными пробами помещают в хроматографическую камеру с системой растворителей и хроматографируют. Пластинку подсушивают в воздухе, отмечают под УФ-светом поглощающую зону, соответствующую хиноцитрининам, на основании сравнения с Rf стандартного образца. Зону вырезают и элюируют системой растворителей (80:20:0.2). Пробу упаривают на ротационном испарителе, растворяют в метаноле и измеряют оптическую плотность при λ=314 нм на спектрофотометре (Козловский А.Г., Желифонова В.П., Антипова В.П. Гриб Penicillium citrmum, выделенный из вечномерзлотных отложений, как продуцент эргоалкалоидов и новых хинолиновых алкалоидов хиноцитрининов. Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т.41. №5. С.568-572).

По предлагаемому способу полученный при концентрировании хлороформного экстракта осадок, содержащий хиноцитринины, может быть очищен от примесей методом колоночной хроматографии особым способом ("подушка"). Используют колонку с соотношением высоты и диаметра, равным 1:1,8-2,0, и системы растворителей.

Используют, в частности, силикагель 60 для колоночной хроматографии, 0,040-0,063 мм, "Merck", Германия.

Так, например, одну треть чистого силикагеля распределяют ровным слоем по всему диаметру колонки. Хлороформный экстракт растворяют в 5 мл хлороформа, смешивают с второй третью силикагеля и упаривают на роторном испарителе. Пробу, адсорбированную на силикагеле (желтого цвета), распределяют ровным слоем по диаметру колонки. Поверх него насыпают оставшуюся часть чистого силикагеля (получается три слоя).

Элюирование начинают с хлороформа. Объем фракции - 600 мл. Следующий элюент - система: хлороформ: метанол (9:1, об./об.), первые две фракции объемом 100 мл, остальные 5 фракций по 50 мл. На завершающем этапе система элюирования хлороформ-метанол (1:1, об./об.), 50 мл.

Время элюирования составляет 2 ч, что на порядок быстрее, чем при применении известного метода колоночной хроматографии, занимающего обычно не менее суток.

Состав фракций контролируют методом ТСХ на пластинах силуфол УФ-254 в системе хлороформ: метанол: 25% аммиак (80:20:0,2) со стандартами хиноцитрининов. Фракции, содержащие хиноцитринины, упаривают в вакууме на ротационном испарителе. Дальнейшую очистку проводят высаживанием хиноцитрининов из ацетона гексаном.

Такой способ выделения в десятки раз сокращает длительность очистки хиноцитрининов по сравнению с известным методом колоночной хроматографии.

В ранних работах по поиску алкалоидов у мицелиальных грибов в составе питательных сред было предложено использовать два источника углерода и энергии - углевод и кислоту цикла Кребса, в частности янтарную кислоту (Abe M., Yamatodami S., Jamano Т., Kozu J., Jamada S. Production of alkaloids and related substances by fungi. Examination of filamentous fungi for their ability of producing ergot alkaloids. J. Agr. Chem. Soc. Japan. 1967. V.41. №2. P.67-73). У большинства изученных грибов родов Claviceps, Penicillium такое сочетание было благоприятно для биосинтеза вторичных метаболитов, в том числе и для биосинтеза эпоксиагроклавина-I и хиноцитрининов (Козловский А.Г., Желифонова В.П., Антипова В.П. Гриб Penicillium citrinum, выделенный из вечномерзлотных отложений, как продуцент эргоалкалоидов и новых хинолиновых алкалоидов хиноцитрининов. Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т.41. №5. С.568-572). Однако требования грибов-продуцентов к оптимальному источнику углерода и энергии для биосинтеза алкалоидов определяются физиолого-биохимическими особенностями каждого конкретного штамма.

Было исследовано влияние различных сочетаний углеводов и кислоты цикла Кребса на биосинтез эпоксиагроклавина-I и агроклавина-I у продуцентов Р.kapuscinski и Р.sizovae (Козловский А.Г., Соловьева Т.Ф., Влияние условий культивирования на биосинтез алкалоидов Penicillium kapuskinskii. Микробиология. 1986. Т.55. №1. С.34-40. 1986; Козловский А.Г., Веприцкая И.Г. Влияние источников углерода на биосинтез эргоалкалоидов и активность ферментов углеродного обмена у Penicillium sizovae. Микробиология. 1987. Т.56. Вып.4. С.587-592). У гриба Р.kapuscinski в качестве источника углевода использовали маннит, сахарозу, сорбит, ксилозу, мальтозу, ксилозу, лактозу, глюкозу, а у Р.sizovae - маннит, сорбит и глюкозу. У обоих продуцентов максимальное накопление алкалоидов происходило на среде с маннитом. Однако оптимальный источник органической кислоты для биосинтеза алкалоидов был различен.

У Р.kapuscinski максимальное накопление алкалоидов наблюдалось на средах с янтарной и яблочной кислотами, у Р.sizovae - с α-кетоглутаровой кислотой. Рост на данных средах характеризуется диауксией, связанной с переходом с одного источника углерода на другой, что нередко сопровождается падением концентрации алкалоидов.

В предлагаемой среде используется только углевод - сахароза и отсутствует кислота ЦТК. Мочевина используется как источник азота. Грибами мочевина обычно разлагается на аммиак и углекислый газ (J.С.Slaughter. Nitrogen metabolism. Physiology of industrial fungi. Ed. Berry D.R., Oxford: Blackwell scientific publications, 1988. P.58-76). Рост на такой среде не носит диауксийный характер.

Гриб Penicillium citrinum BKM FW-800, выделенный из древних, датируемых возрастом 1,8-3,0 млн лет, многолетнемерзлых отложений Арктики, в настоящее время хранится во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН под номером BKM F-4043 D.

Культуру поддерживают методом лиофилизации.

Идентификацию штамма проводили по макро- и микроморфологическим признакам у 7-суточной культуры, выращенной на трех различных питательных средах при разных температурах.

В процессе идентификации штамма Р.citrinum BKM FW-800 было показано смещение его температурного оптимума роста по сравнению с известными типовым и референтными штаммами. В остальном микроморфология изучаемой культуры была типична для вида Р.citrinum Thorn 1910. Макроморфология колоний на различных средах соответствовала описанию вида (Козловский А.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М., Антипова Т.В., Озерская С.М., Кочкина Г.А., Грефе У. Гриб Penicillium citrinum Thorn 1910 BKM FW-800, выделенный из вечномерзлотных древних отложений, как продуцент эргоалкалоидов агроклавина-1 и эпоксиагроклавина-I. Микробиология. 2003. Т. 72. №6. С.816-821).

Культурально-морфологические признаки гриба Penicillium citrinum BKM F-4043 D.

Штамм образует воздушный мицелий и дает конидиальное спороношение. Конидиеносцы отходят от субстрата или воздушных гиф, 50-200×2,2-3 мкм, иногда несущие одну или несколько веточек 25-35 мкм, гладкие. Метулы по 3-4 в верхушечной мутовке, 12-20×2,2-3 мкм. Стеригмы 6-10 в пучке, 8-11×2-2,8 мкм. Конидии шаровидные и полушаровидные, более или менее гладкие, но иногда зернистые 2,2-3,0 мкм в диаметре.

Колонии на сусло-агаре на 14 сут роста достигают 25-30 мм в диаметре. Колонии ограниченно растущие, типично радиально-бороздчатые, бархатистые, с голубовато-зеленой конидиеносной зоной. Экссудат обильный, в виде капелек соломенного цвета. Имеется грибной запах.

Вид Penicillium citrinum относят к подроду Furcatum секции Furcatum. Этот вид занимает неизменное положение в таксономии пенициллов вопреки наличию некоторых объективных критериев. Представители данного вида широко распространены в почвах и известны как контаминанты пищевых продуктов и кормов, а также как активные биодеструкторы различных полимеров. Некоторые штаммы вида Р.citrinum известны как продуценты микотоксина O-гетероциклической природы - цитринина. У других обнаружены клавиновые эргоалкалоиды - пироклавин, цивидиклавин, ханоклавин-I, изоханоклавин-I, костаклавин и эпикостаклавин.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний.

Пример 1. Гриб Penicillium citrinum BKM F-4043 D выращивают в колбах объемом 750 мл со 150 мл среды состава (г/л):

Сахароза	50,00
Мочевина	2,14
KH2PO4	1,00
MgSO4×7H2O	0,30
ZnSO4×7H2O	0,0044
Вода дистиллированная	До 1 л

Колбы с засеянной средой помещают на качалку (220 об/мин) и выращивают 7 сут при 24±1°С. По окончании ферментации культуральную жидкость фильтруют.Фильтрат культуральной жидкости подкисляют 2% винной кислоты до рН 3,0-3,5 и экстрагируют хлороформом в соотношении 1:1 (об./об.) 2-3 раза. Затем фильтрат подщелачивают 25% аммиаком до рН 8-9 и экстрагируют хлороформом аналогичным образом. Кислый и щелочной экстракты обезвоживают сульфатом натрия и концентрируют в вакууме на ротационном испарителе при температуре не более 40°С. Содержание в полученном экстракте культуральной жидкости эпоксиагроклавина-I - 70 мг/л, а хиноцитрининов - 3 мг/л (метод УФ-спектроскопии).

Для получения тартрата эпоксиагроклавина-I щелочной экстракт растворяют в минимальном количестве ацетона (раствор 1). Готовят насыщенный раствор винной кислоты в метаноле (раствор 2). Количество винной кислоты рассчитывают, исходя из данных по количественному определению эпоксиагроклавина-I в экстракте культуральной жидкости. На 1 моль эпоксиагроклавина-I требуется 1 моль винной кислоты. В раствор 1 добавляют постепенно при перемешивании раствор 2. Практически сразу выпадает светло-коричневый осадок. Маточник отделяют декантированием. Осадок промывают ацетоном. Промывной ацетон декантируют.

Образовавшийся рассыпчатый светло-коричневый осадок является тартратом эпоксиагроклавина-I.

Для выделения хиноцитрининов, кислый экстракт очищают от примесей методом колоночной хроматографии особым способом ("подушка"). Используют колонку с соотношением высоты и диаметра, равным 1:1,8-2,0, силикагель 60 для колоночной хроматографии, 0,040-0,063 мм, "Merck", Германия и системы растворителей. Одну треть чистого силикагеля распределяют ровным слоем по всему диаметру колонки. Хлороформный экстракт растворяют в 5 мл хлороформа, смешивают с второй третью силикагеля и упаривают на роторном испарителе. Пробу, адсорбированную на силикагеле (желтого цвета), распределяют ровным слоем по диаметру колонки. Поверх него насыпают оставшуюся часть чистого силикагеля (получается три слоя). Элюирование начинают с хлороформа. Объем фракции - 600 мл. Следующий элюент - система: хлороформ: метанол (9:1, об./об.), первые две фракции объемом 100 мл, остальные 5 фракций по 50 мл. На завершающем этапе система элюирования хлороформ-метанол (1:1, об./об.), 50 мл. Время элюирования составляет 2 ч. Состав фракций контролируют методом ТСХ на пластинах силуфол УФ-254 в системе хлороформ: метанол: 25% аммиак (80:20:0,2) со стандартами хиноцитрининов. Фракции, содержащие хиноцитринины в качестве основного вещества, упаривают в вакууме на ротационном испарителе.

Из 1 л культуральной жидкости после выделения и очистки получают 110 мг тартрата эпоксиагроклавина-I и 3 мг хиноцитрининов.

Пример 2. Гриб Penicillium citrinum BKM F-4043 D выращивают, как описано в Примере 1, но продолжительность культивирования составляет 5 сут.

Полученную культуру используют для инокуляции колб основной ферментации в количестве 10% от объема среды. Для основной ферментации используют среду следующего состава (г/л):

Сахароза	75,00
Мочевина	2,14
KH2PO4	1,00
MgSO4·7H2O	0,30
ZnSO4·7H2O	0,0044
Вода дистиллированная	До 1 л

Колбы с засеянной средой помещают на качалку (220 об/мин) при 24°С. Продолжительность культивирования Р. citrinum BKM F-4043 D составляет 12 сут. Содержание в экстракте культуральной жидкости эпоксиагроклавина-I - 170 мг/л, а хиноцитрининов - 14 мг/л.

Выделение, очистку хиноцитрининов и получение тартрата эпоксиагроклавина-I проводят, как описано в примере 1.

Из 1 л культуральной жидкости получают 270 мг тартрата эпоксиагроклавина-I и 14 мг хиноцитрининов.

Пример 3. Способ осуществляют, как указано в Примере 2, но для основной ферментации используют среду следующего состава (г/л):

Сахароза	100,0
Мочевина	4,28
KH2PO4	2,00
MgSO4·7H2O	0,60
ZnSO4·7H2O	0,0088
Вода дистиллированная	До 1 л

Способ и продолжительность культивирования Р. citrinum BKM F-4043 D осуществляют, как в примере 2. Содержание в экстракте культуральной жидкости эпоксиагроклавина-I - 170 мг/л, а хиноцитрининов - 14 мг/л. Выделение, очистку хиноцитрининов и получение тартрата эпоксиагроклавина-I проводят, как описано в примере 1.

Из 1 л культуральной жидкости получают 348 мг тартрата эпоксиагроклавина-I и 8 мг хиноцитрининов.

Предложенный состав среды ранее не использовался для продуцентов вторичных метаболитов грибов рода Penicillium.

Показано, что культивирование продуцента на данной среде позволяет повысить содержание эпоксиагроклавина-I до 220 мг/л, что более чем в 2 раза превышает содержание эпоксиагроклавина-I в культуральной жидкости в известном способе (Козловский А.Г., Желифонова В.П., Аданин В.М., Антипова Т.В., Озерская С.М., Кочкина Г.А., Грефе У. Гриб Penicillium citrinum Thorn 1910 BKM FW-800, выделенный из вечномерзлотных древних отложений, как продуцент эргоалкалоидов агроклавина-1 и эпоксиагроклавина-I. Микробиология. 2003. Т.72. №6. С.816-821).

Заранее нельзя было предположить, что на предлагаемой среде столь значительно увеличится содержание эпоксиагроклавина-I в культуральной жидкости.

Преимуществом данного способа является исключение стадии очистки эпоксиагроклавина-I методом колоночной хроматографии, так как выделение осуществляется непосредственно из щелочного экстракта культуральной жидкости.

Это в десятки раз ускоряет время получения готового препарата. Кроме того, получение эпоксиагроклавина-I в виде соли винной кислоты позволяет увеличить срок его хранения в несколько раз.

Ранее не было описано получение тартрата эпоксиагроклавина-I.

Таким образом, разработан способ, обеспечивающий содержание эпоксиагроклавина-I в культуральной жидкости в 2-3 раза выше по сравнению с известными методами и позволяющий получать тартат эпоксиагроклавина-I, являющийся стабильным при хранении, непосредственно из щелочного экстракта культуральной жидкости.

Упрощена стадия выделения хиноцитрининов.

Способ получения тартрата эпоксиагроклавина-I и хиноцитрининов, характеризующийся тем, что культивируют гриб Penicillium citrinum BKM F-4043 D в минеральной среде следующего состава, г/л:

сахароза	50,0-100,0
мочевина	2,14-4,28
KH2PO4	1,00-2,00
MgSO4·7H2O	0,30-0,60
ZnSO4·7H2O	0,0044-0,0088
вода дистиллированная	до 1 л,

отделяют биомассу, выделяют целевые продукты из культуральной жидкости, при этом выделение эпоксиагроклавина-I проводят непосредственно из щелочного экстракта культуральной жидкости экстракцией хлороформом при кислых и щелочных значениях рН с последующим обезвоживанием и концентрированием, затем полученный щелочной экстракт растворяют в ацетоне, в этот раствор для получения тартрата эпоксиагроклавина-I добавляют постепенно при перемешивании раствор винной кислоты в метаноле, выделение хиноцитрининов проводят из кислого экстракта культуральной жидкости колоночной хроматографией, которую осуществляют на колонке с силикагелем при соотношении высоты и диаметра колонки, равном 1:1,8-2,0, причем в колонке 3 слоя, первый и третий из которых содержит чистый силикагель, средний слой - силикагель с адсорбированными на нем веществами кислого экстракта культуральной жидкости, элюцию хиноцитрининов проводят сначала хлороформом, затем смесью хлороформ : метанол 9:1.