Вольтамперометрическая система для анализа биологических анализируемых веществ

Вольтамперометрическая система для анализа биологических анализируемых веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Количественное определение анализируемых веществ в биологических текучих средах является полезным при диагностике и лечении физиологических аномалий. Например, определение уровня глюкозы в биологических текучих средах, таких как кровь, является важным для индивидуумов, страдающих диабетом, которые должны часто проверять свой уровень глюкозы в крови для подбора своей диеты и/или лекарственных средств.

Для таких целей используются электрохимические способы. Электрохимический биосенсор может использовать фермент, специфичный к анализируемому веществу, такой как глюкоза оксидаза или глюкоза дегидрогеназа, для катализа окисления глюкозы в образце цельной крови. Во время каталитического окисления под действием фермента окислительно-восстановительный центр фермента принимает электроны от анализируемого вещества.

Этот окислительно-восстановительный центр может представлять собой флавин-адениновый динуклеотид (FAD) глюкозы оксидазы или кофактор фермента, такой как пирролохинолин хинон (PQQ), для глюкозы дегидрогеназы. Электроны, приобретенные ферментом, могут затем перемещаться к электроду с помощью медиатора, который преобразуется в восстановленную форму во время окисления фермента. Наконец, восстановленная форма медиатора, такая как частицы ферроцианида окислительно-восстановительной пары феррицианид/ферроцианид, окисляется на электроде, с генерированием измеряемого тока.

Этот процесс может быть представлен следующими уравнениями:

где E_Ox и E_Red представляют собой окисленную и восстановленную форму окислительно-восстановительного центра фермента, соответственно, в то время как Med_Ox и Med_Red представляют собой окисленную и восстановленную формы медиатора, соответственно. Продукт ферментативной реакции может представлять собой глюконовую кислоту или глюконолактон.

Один из электрохимических способов, который используется для количественного определения анализируемых веществ в биологических текучих средах, представляет собой кулонометрию. Например, Heller et al. описывают кулонометрический способ для измерений глюкозы в цельной крови в патенте США №6120676. При кулонометрии концентрация анализируемого вещества (глюкозы) количественно определяется посредством избыточного окисления анализируемого вещества в малом объеме и интегрирования тока по времени окисления с получением электрического заряда, представляющего концентрацию анализируемого вещества. Другими словами, кулонометрия улавливает общее количество глюкозы в тест-полоске.

Важный аспект кулонометрии заключается в том, что ближе к концу кривой интегрирования, для заряда как функции времени, скорость, с которой изменяется заряд, становится относительно постоянной с осуществлением стационарных условий. Эта стационарная часть кулонометрической кривой образует относительно плоскую область плато на кривой, таким образом, давая возможность для точного определения соответствующего тока. Однако кулонометрический способ требует полного преобразования всего объема анализируемого вещества. В результате этот способ отнимает много времени и не обеспечивает быстрых результатов, которых требуют пользователи электрохимических устройств, таких как продукты для отслеживания глюкозы. Другая проблема при кулонометрии заключается в том, что для обеспечения точных результатов должен контролироваться малый объем ячейки сенсора, что может быть сложным для устройства, производимого массово.

Другой электрохимический способ, который используется для количественного определения анализируемых веществ в биологических текучих средах, представляет собой амперометрию. При амперометрии ток измеряется в конце периода при постоянном потенциале (напряжении) между рабочим электродом и электродом сравнения тест-полоски. Ток используют для количественного определения анализируемого вещества в биологическом образце. Амперометрия измеряет скорость, при которой электрохимически окисляются или восстанавливаются активные частицы и, таким образом, анализируемое вещество. Множество вариаций амперометрического способа для биосенсоров описывается, например, в патентах США №№5620579; 5653863; 6153069 и 6413411. Амперометрический способ измеряет концентрацию анализируемого вещества в образце вблизи поверхности электрода посредством измерения тока, который является пропорциональным скорости диффузии и объемной концентрации анализируемого вещества.

Недостаток амперометрического способа представляет собой нестационарную природу тока после приложения потенциала. Скорость изменения тока по отношению ко времени сначала является очень высокой и становится ниже по ходу анализа благодаря изменению природы базового процесса диффузии. До тех пор, пока скорость потребления восстановленного медиатора на поверхности электрода не сравняется со скоростью диффузии, стационарный ток не может быть получен. Таким образом, измерение тока в течение нестационарного периода времени может быть связано с большей неточностью, чем измерение, проделываемое в стационарный период времени.

Один из важных аспектов измерения анализируемых веществ в образцах цельной крови представляет собой влияние гематокрита. Гематокрит представляет собой объем эритроцитов (RBC), выраженный как процент объема RBC в образце цельной крови. Значение гематокрита для образцов цельной крови находится в пределах примерно от 20 до 60% и, как правило, составляет примерно 40%.

Реагентные биосенсоры включают в себя любую систему, которая может детектировать глюкозу в образце крови посредством электрохимической реакции. Примеры реагентных биосенсоров включают в себя биосенсоры Ascensia AUTODISC^® и Elite^®, доступные от Bayer HealthCare, LLC of Elkhart, Indiana; биосенсоры Precision^®, доступные от Abbott in Abbott Park, Illinois; биосенсоры Accucheck^®, доступные от Roche in Indianapolis, Indiana; и биосенсоры OneTouch Ultra^®, доступные от Lifescan in Milpitas, California.

Типичные электрохимические тест-полоски содержат рабочий электрод, противоэлектрод (электрод сравнения) и необязательный третий электрод. Потенциал сравнения может обеспечиваться в системе посредством противоэлектрода, если он конфигурируется соответствующим образом, или посредством необязательного третьего электрода. Слой реагента с ферментом, такой как глюкоза оксидаза или глюкоза дегидрогеназа, и медиатором, таким как феррицианид или рутений гексаамин, отпечатывается или осаждается на рабочий электрод или на рабочий электрод и противоэлектрод с полимером в качестве связующего вещества.

Примеры полимеров, используемых в качестве связующего вещества для реагентов, включают в себя CMC (карбоксил-метилцеллюлозу) и PEO (полиэтиленоксид). Добавление различных типов и молекулярных масс полимеров в слой реагентов может способствовать фильтрованию эритроцитов, предотвращая покрытие ими поверхности электрода.

Предпочтительно тест-полоска изготавливается посредством печати электродов на изолирующей подложке с использованием множества технологий, таких как те, которые описаны в патентах США №№6531040; 5798031 и 5120420. Реагент может отпечатываться на рабочем электроде и противоэлектроде вместе со смесью фермента, окисляющего глюкозу, такого как глюкоза оксидаза, медиатора, такого как феррицианид, гидрофильного полимера, такого как полиэтиленоксид (PEO), и соответствующего буфера, такого как цитратный буфер.

Альтернативно, другой химический состав реагентов может либо отпечатываться, либо наноситься с помощью микроосаждения, отдельно, на рабочий электрод и на противоэлектрод с использованием способа, описанного во временной заявке на патент США, зарегистрированной 24 октября 2003 года, серийный №60/513817, с реагентом на рабочем электроде, содержащим фермент, медиатор, полимер, и с реагентом на противоэлектроде, содержащим растворимые окислительно-восстановительные частицы, которые могут быть такими же, как медиатор, или другими, и полимером. В одном из вариантов осуществления полимер, используемый при микроосаждении, представляет собой карбоксил-метилцеллюлозу.

Примеры соответствующих настольных электрохимических инструментов, которые могут использоваться для считывания реагентных биосенсоров по настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваясь этим, BAS 100B Analyzer, доступный от BAS Instruments in West Lafayette, Indiana; CH Instrument Analyzer, доступный от CH Instruments in Austin, Texas; Cypress Electrochemical Workstation, доступный от Systems in Lawrence, Kansas; и EG&G Electrochemical Instrument, доступный от Princeton Research Instruments in Princeton, New Jersey. Примеры переносных инструментов включают в себя измерители Ascensia Breeze^® и Elite^® от Bayer Corporation.

Биосенсор для глюкозы может иметь фермент и медиатор, осажденные на электродах. Способность этого сенсора к измерению глюкозы изменяется, когда RBC блокируют диффузию соответствующих реагентов в образце крови. Поскольку амперометрический ток является прямопропорциональным диффузии восстановленной формы медиатора, гематокрит будет иметь значительное воздействие на точность измерений глюкозы. В зависимости от уровня гематокрита в образце цельной крови, RBC вызывают смещение экспериментальных данных по глюкозе.

Различные способы и методики предлагаются в попытке уменьшить влияние гематокрита цельной крови на результаты измерений глюкозы. Например, Ohara et al. в патенте США №6475372 описывают способ использования отношения токов от прямого и обратного импульса потенциала для компенсации влияния гематокрита при электрохимических измерениях глюкозы. McAleer et al. в патентах США №№5708247 и 5951836 описывают препарат реагента, использующий частицы окиси кремния для отфильтровывания RBC с поверхности электрода, таким образом, уменьшая влияние гематокрита. Carter et al. в патенте США №5628890 описывают способ использования большого расстояния между электродами в сочетании со слоями сетки для отделения образца крови от влияния гематокрита.

Эти обычные методики для уменьшения смещения, приписываемого влиянию гематокрита, включают в себя (a) совместное осаждение полимера для сведения к минимуму влияния гематокрита, (b) добавление различных видов коллоидной окиси кремния для усиления фильтрующего влияния слоя полимера, (c) компенсационные коэффициенты на основе отношения токов от прямого и обратного импульса потенциала и (d) автокомпенсацию посредством использования имеющегося сопротивления раствора образцов цельной крови. Хотя эти способы могут быть полезными, обычные сенсоры на глюкозу продолжают демонстрировать значительное аналитическое смещение, приписываемое влиянию гематокрита. Таким образом, было бы желательным создание систем для количественного определения анализируемых веществ в биологических текучих средах, в частности содержания глюкозы в цельной крови, которые уменьшают смещение от влияния гематокрита.

Сущность изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает способ определения концентрации анализируемого вещества в образце, который включает в себя приложение ациклического сканирования к образцу и определение концентрации анализируемого вещества в образце.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает ручное измерительное устройство анализируемых веществ для определения концентрации анализируемого вещества в образце. Измерительное устройство анализируемых веществ содержит измерительное устройство с ациклическим сканированием, адаптированное для приема тест-полоски. Измерительное устройство с ациклическим сканированием содержит, по меньшей мере, два контакта устройства в электрическом соединении с дисплеем через электрическую схему. Тест-полоска содержит, по меньшей мере, первый и второй контакты тест-полоски в электрическом соединении с рабочим электродом и противоэлектродом через проводники, где первый слой реагента находится, по меньшей мере, на одном из электродов, и первый слой содержит оксидоредуктазу и, по меньшей мере, один вид частиц из окислительно-восстановительной пары. Предусматриваются измерительные устройства как с ациклическим, так и с линейным сканированием.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ определения концентрации анализируемых веществ в образце, который включает в себя приложение вольтамперометрического прямого линейного сканирования к образцу, измерение полученных токов, применение к измеренным токам обработки данных и определение концентрации анализируемого вещества в образце.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает ручное измерительное устройство для определения концентрации анализируемого вещества в образце, где устройство адаптируется для приема тест-полоски. Устройство содержит контакты, - по меньшей мере, один дисплей и электронную схему, устанавливающую электрическое сообщение между контактами и дисплеем. Электронная схема содержит электрическое зарядное устройство и процессор в электрическом соединении, процессор в электрическом соединении со средой для хранения данных, считываемой компьютером, содержащей считываемый компьютером программный код. Считываемый компьютером программный код, когда исполняется процессором, заставляет процессор осуществлять обработку данных с помощью половинного интеграла, дифференциальную обработку данных, и/или обработку данных с помощью половинной производной, и/или вольтамперометрическое сканирование.

Для обеспечения четкого и согласованного понимания описания и формулы изобретения ниже приводятся следующие определения.

Термин "медиатор" определяется как вещество, которое может окисляться или восстанавливаться и которое может переносить один или более электронов. Медиатор представляет собой реагент при электрохимическом анализе и не является анализируемым веществом, представляющим интерес, но обеспечивает опосредованное измерение анализируемого вещества. В упрощенной системе медиатор подвергается окислительно-восстановительной реакции в ответ на окисление или восстановление анализируемого вещества. Затем окисленный или восстановленный медиатор подвергается обратной реакции окисления-восстановления на рабочем электроде и регенерируется до его исходного окислительного числа.

Термин "окислительно-восстановительная реакция" определяется как химическая реакция между двумя частицами, включающая в себя перенос, по меньшей мере, одного электрона от частиц первого вида к частицам второго вида. Таким образом, окислительно-восстановительная реакция включает в себя окисление и восстановление. Окислительный полуэлемент реакции включает в себя потерю, по меньшей мере, одного электрона частицами первого вида, в то время как восстановительный полуэлемент включает в себя добавление, по меньшей мере, одного электрона к частицам второго вида. Ионный заряд частиц, которые окисляются, делается более положительным на величину, равную количеству перенесенных электронов. Подобным же образом, ионный заряд частиц, которые восстанавливаются, делается менее положительным на величину, равную количеству перенесенных электронов.

Термин "окислительно-восстановительная пара" определяется как две объединенные частицы химического вещества, имеющие различные окислительные числа. Восстановление частиц, имеющих более высокое окислительное число, производит частицы, имеющие более низкое окислительное число. Альтернативно, окисление частиц, имеющих более низкое окислительное число, дает частицы, имеющие более высокое окислительное число.

Термин "окислительное число" определяется как формальный ионный заряд химических частиц, таких как атом. Более высокое окислительное число, такое как (III), является более положительным, а более низкое окислительное число, такое как (II), является менее положительным.

Термин "обратимая окислительно-восстановительная пара" определяется как пара окислительно-восстановительных частиц, где различие между прямым и обратным сканированием половинного интеграла составляет, самое большее, 30 мВ, на половинной высоте перехода si_ss. Например, на фиг.3B показаны прямое и обратное сканирования с вычислением половинного интеграла для окислительно-восстановительной пары феррицианид/ферроцианид, в дополнение к высоте перехода si_ss. На линии, где линия перехода si_ss на половинной высоте пересекает линии прямого и обратного сканирования, различие между линиями равно 29 мВ, устанавливая обратимость окислительно-восстановительной пары феррицианид/ферроцианид при показанной скорости сканирования.

Термин "квазиобратимая окислительно-восстановительная пара" определяется как окислительно-восстановительная пара, где для окислительно-восстановительной пары различие между прямым и обратным сканированием с вычислением половинного интеграла является большим чем 30 мВ, на половинной высоте перехода si_ss.

Термин "стационарный" определяется как ситуация, когда изменение электрохимического тока по отношению к напряжению является относительно постоянным, например, в пределах ±10 или ±5%.

Термин "точка поворота" определяется как точка при циклическом или ациклическом сканировании, когда прекращается прямое сканирование и начинается обратное сканирование.

Термин "линейное сканирование" определяется как сканирование, где напряжение изменяется только в одном "прямом" направлении, при фиксированной скорости сканирования, например, от -0,5 В до +0,5 В, с получением диапазона сканирования 1,0 В. Линейное сканирование может апроксимироваться рядом ступенчатых изменений потенциала. Если эти ступенчатые изменения происходят близко друг к другу по времени, они соответствуют непрерывному линейному сканированию. Таким образом, приложение изменения потенциала, апроксимирующего линейное изменение, может рассматриваться как линейное сканирование.

Термин "циклическое сканирование" определяется как сочетание линейного прямого сканирования и линейного обратного сканирования, где диапазон сканирования включает в себя пики окисления и восстановления окислительно-восстановительной пары. Например, изменение потенциала циклическим образом от -0,5 В до +0,5 В и назад до -0,5 В представляет собой пример ациклического сканирования для окислительно-восстановительной пары феррицианид/ферроцианид, как используется в сенсоре на глюкозу, где в диапазоне сканирования содержатся пики как окисления, так и восстановления.

Термин "ациклическое сканирование" определяется в одном из аспектов как сканирование, содержащее большее количество одного из прямого или обратного пиков тока, чем другого пика тока. Например, сканирование, содержащее прямое и обратное линейные сканирования, где прямое сканирование начинается при напряжении, ином, чем то, при котором останавливается обратное сканирование, например сканирование от -0,5 В до +0,5 В и назад до +0,25 В, представляет собой пример ациклического сканирования. В другом примере ациклическое сканирование может начинаться и заканчиваться по существу при одинаковом напряжении, когда сканирование начинается, самое большее, за ±20, ±10 или ±5 мВ от формального потенциала Е°' окислительно-восстановительной пары. В другом аспекте ациклическое сканирование определяется как сканирование, включающее в себя прямое и обратное линейные сканирования, которые по существу исключают окислительные и восстановительные пики окислительно-восстановительной пары. Например, сканирование может начинаться, обращаться и заканчиваться в пределах стационарной области окислительно-восстановительной пары, таким образом, исключая окислительные и восстановительные пики пары.

Термины "быстрое сканирование" и "высокая скорость сканирования" определяются как сканирование, когда напряжение изменяется со скоростью, по меньшей мере, 176 мВ/с. Предпочтительно высокие скорости сканирования представляют собой скорости, более высокие чем 200, 500, 1000 или 2000 мВ/с.

Термины "медленное сканирование" и "низкая скорость сканирования" определяются как сканирование, где напряжение изменяется со скоростью, самое большее, 175 мВ/с. Предпочтительные низкие скорости сканирования представляют собой скорости, меньшие чем 150, 100, 50 или 10 мВ/с.

Термин "ручное устройство" определяется как устройство, которое может удерживаться в руке человека и является переносным. Пример ручного устройства представляет собой измерительное устройство, соответствующее Ascensia^® Elite Blood Glucose Monitoring System, доступному от Bayer HealthCare, LLC, Elkhart, IN.

Термин "на" определяется как "выше" и относится к описываемой ориентации. Например, если первый элемент осаждается поверх, по меньшей мере, части второго элемента, о первом элементе говорится, что он "осаждается на" втором. В другом примере, если первый элемент присутствует выше, по меньшей мере, части второго элемента, о первом элементе говорится, что он находится "на" втором. Использование термина "на" не исключает присутствия веществ между верхним и нижним элементами, которые описываются. Например, первый элемент может иметь покрытие на своей верхней поверхности, и еще второй элемент, по меньшей мере, поверх части первого элемента, и его верхнее покрытие может описываться как "на" первом элементе. Таким образом, использование термина "на" может означать или не означать, что два соотносимые элемента находятся в физическом контакте друг с другом.

Краткое описание чертежей

Фигуры 1A-1B изображают вид сбоку и с торца рабочего электрода и противоэлектрода типичной тест-полоски.

Фигуры 2A-2B представляют собой виды снаружи тест-полоски на фигурах 1A-1B.

Фиг.2C представляет собой схематическое представление устройства для измерения.

Фиг.3A представляет собой график, показывающий циклическую вольтамперограмму от сенсорной системы.

Фиг.3B представляет собой график половинного интеграла, соответствующего циклической вольтамперограмме на фиг.3A.

Фиг.3C показывает ациклическое сканирование, где обратное сканирование завершается перед началом пика обратного тока.

Фиг.3D представляет собой половинный интеграл ациклических данных.

Фиг.3E сравнивает циклическое сканирование с ациклическим сканированием, где прямое сканирование ациклического сканирования начинается вблизи формального потенциала E°' для окислительно-восстановительной пары.

Фиг.3F сравнивает половинные интегралы токов фиг.3E.

Фиг.3G показывает циклическое сканирование вместе с ациклическим сканированием, наложенным в стационарной области.

Фиг.3H сравнивает значения половинного интеграла тока и измеренного тока для ациклического сканирования фиг.3G.

Фиг.4A изображает циклическую вольтамперограмму, половинный интеграл и половинную производную 16 мМ ферроцианида в образце цельной крови с 20% гематокритом.

Фиг.4B представляет собой увеличение обработки данных с вычислением половинной производной для кривой на фиг.4A.

Фиг.4C-4E изображают кривые обработки данных с вычислением половинной производной от прямых частей линейного сканирования циклических вольтамперограмм на фигурах 7A, 7B и 7C, ниже.

Фиг.4F изображает половинные производные токов на фигурах 4C-4E.

Фиг.4G изображает сравнение вычисленных уровней глюкозы от непреобразованного прямого сканирования вольтамперограммы (LS), половинного интеграла данных вольтамперограммы (si) и половинной производной данных вольтамперограммы (sd).

Фиг.5 представляет собой набор циклических вольтамперограмм, показывающих влияние изменения концентраций глюкозы в водных растворах.

Фиг.6 показывает половинные интегралы токов вольтамперограмм на фиг.5.

Фиг.7A-7C представляют собой циклические вольтамперограммы, иллюстрирующие влияние изменений процента гематокрита и концентрации глюкозы в цельной крови.

Фиг.7D-7F представляют собой ациклические вольтамперограммы, иллюстрирующие влияние изменений процента гематокрита и концентрации глюкозы в цельной крови.

Фиг.8A-8C показывают половинные интегралы токов на фигурах 7A-7C.

Фиг.8D-8F показывают половинные интегралы токов на фигурах 7D-7F.

Фиг.9A-9C представляют собой циклические вольтамперограммы, иллюстрирующие влияние изменения скорости сканирования на влияние гематокрита.

Фиг.10A-10C показывают половинные интегралы токов, соответствующие циклическим сканированиям на фигурах 9A-9C.

Фиг.11A-11C показывают корреляцию между линиями половинного интеграла тока фигур 10A-10C на основе экспериментальных результатов фигур 9A-9C и эталонную концентрацию глюкозы в каждом образце.

Фиг.12 показывает пик половинного интеграла тока и стационарное значение половинного интеграла тока, которые могут использоваться для определения индекса гематокрита.

Фиг.13A показывает корреляцию индекса гематокрита с содержанием гематокрита цельной крови.

Фиг.13B показывает крутизну калибровочных линий ток/глюкоза (мкА/мг/дл) как функцию % гематокрита, полученную из фиг.11A.

Фиг.14 иллюстрирует влияние корректировки содержания глюкозы (мг/дл) на гематокрит с использованием индекса гематокрита.

Фиг.15A-15C показывают графики производных токов для прямых сканирований на фигурах 7A-7C как функции напряжения.

Фиг.16A представляет собой график тока при 0,3 вольта как функцию % глюкозы, при 20, 40 и 60% гематокрита.

Фиг.16B представляет собой график % гематокрита как функции отношения отрицательных и положительных пиков, иллюстрируемых на фиг.15.

Фиг.16C представляет собой график крутизны кривых на фиг.16A как функции % гематокрита.

Фиг.16D показывает влияние корректировки содержания глюкозы на гематокрит с использованием производных токов.

Фиг.17A-17B показывают графики доза - отклик для значений измеренного тока и половинного интеграла тока, соответственно, для ациклического сканирования.

Фиг.17C сравнивает точность значений концентрации глюкозы, полученных от ациклического сканирования, с циклическим сканированием, имеющим низкую скорость сканирования.

Подробное описание

Электрохимическая аналитическая система определяет концентрацию анализируемых веществ в биологических текучих средах, например концентрацию глюкозы в цельной крови. Система содержит устройства, которые могут прикладывать вольтамперометрические линейные, циклические или ациклические сканирования к тест-полоске, содержащей биологический образец. Вольтамперометрические сканирования измеряют значения тока (ток) от тест-полоски, в то время как потенциал (напряжение), приложенный к полоске, изменяется линейно со временем. Устройства могут сравнивать полученные данные по току и напряжению для определения концентрации анализируемого вещества в образце, в то же время корректируя результаты на изменения содержания гематокрита конкретного образца крови. Устройства также могут применять одну или несколько обработок данных, включая обработки на основе половинных интегралов, производных и половинных производных, для сравнения и корректировки вольтамперометрических данных.

Системы, как правило, описываются в контексте определения концентрации глюкозы в образце цельной крови. Однако системы имеют другие применения, где анализируемые вещества, такие как холестерин, триглицериды, лактат, пируват, алкоголь, билирубин - мочевая кислота, NAD(P)H и моноокись углерода, находятся в биологических текучих средах, включая плазму, мочу, слюну и интерстициальную текучую среду.

Обзор системы

Системы для определения концентрации анализируемого вещества могут содержать тест-полоску для удерживания образца и измерительное устройство для осуществления одной или более методик сканирования и одной или более методик обработки данных. В одном из аспектов настоящее изобретение может представлять собой набор, содержащий одну или более тест-полосок и ручное электронное устройство для осуществления методики сканирования и обработки данных, с получением на выходе концентрации анализируемого вещества.

Тест-полоска может содержать рабочий электрод, противоэлектрод и необязательно может содержать опорный электрод или третий электрод. В одном из аспектов рабочий электрод и противоэлектрод могут иметь покрытие в виде одного слоя реагента, нанесенного посредством совместного печатания/совместного осаждения, например, как в сенсоре Ascensia^® AUTODISC. В другом аспекте каждый электрод может иметь покрытие в виде слоя реагента, оптимизированного для электрода, на котором он находится. Слой реагента на рабочем электроде содержит фермент, который окисляет глюкозу в образце крови, и медиатор, такой как окислительно-восстановительное соединение, которое повторно окисляет фермент после того, как он восстанавливается посредством окисления глюкозы. Восстановленный медиатор, который переносит электроны от ферментативной реакции окисления глюкозы к электроду, повторно окисляется на поверхности рабочего электрода.

Это повторное окисление приводит к прохождению электронов через электроды и проводники тест-полоски. Проводники тест-полоски находятся в электрическом соединении с измерительным устройством, которое прикладывает разность напряжения между электродами. Устройство может регистрировать ток, проходящий через сенсор, как меру содержания глюкозы в образце крови.

Образец цельной крови наносится на тест-полоску, и глюкоза в крови взаимодействует с ферментом в слое реагента или вблизи него. Скорость диффузии восстановленного медиатора из образца к рабочему электроду может ограничивать ток, проходящий между рабочим электродом и электродом сравнения.

Методики сканирования

В отличие от обычной амперометрии и кулонометрии, где прикладывают постоянные напряжения, в то время как ток измеряется как функция времени, вольтамперометрическое сканирование включает в себя приложение к электродам потенциала (напряжения), изменяющегося с фиксированной скоростью (В/с), и измерение тока как функции приложенного потенциала. Вольтамперометрическое сканирование может осуществляться в линейном, циклическом или ациклическом режиме. Циклическое вольтамперометрическое сканирование обычно упоминается как "циклическая вольтамперометрия".

Во время линейного сканирования измеряется ток на рабочем электроде, в то время как потенциал на рабочем электроде изменяется со временем линейно, с постоянной скоростью. Диапазон сканирования, например от -0,5 В до +0,5 В, может перекрывать восстановленные и окисленные состояния окислительно-восстановительной пары, так что происходит переход из одного состояния до другого. Ток, измеряемый на рабочем электроде, может рассматриваться как имеющий три компонента: равновесный ток, диффузионный ток и поверхностный ток. Поверхностный ток, который может возникать от любых частиц, адсорбированных на электроде, как правило, является малым и им можно пренебречь. Равновесный и диффузионный токи представляют собой главные компоненты, представленные в полученной вольтамперограмме.

Вольтамперограмма с линейным сканированием (график тока как функции напряжения) может характеризоваться с помощью графика, который начинается при равновесном токе, достигает пикового тока и затухает до более низкого уровня тока во время сканирования. После начального пика тока измеренный ток затухает и достигает стационарной области, где окисление восстановленного медиатора на поверхности электрода достигает максимальной скорости, ограниченной диффузией. Таким образом, стационарный ток в этой области сканирования, плато, обозначает диффузионно-ограниченный ток, проходящий через электроды, который может использоваться как мера содержания глюкозы образца крови.

После завершения прямого сканирования, для циклического или ациклического сканирования, линейное сканирование с обратным потенциалом прикладывается по существу при такой же скорости сканирования, как и прямое сканирование. Циклические, а в некоторых случаях и ациклические, сканирования могут исследовать переход окислительно-восстановительных частиц из восстановленного состояния в окисленное состояние (и наоборот) по отношению к приложенному потенциалу или по отношению к скорости диффузии окислительно-восстановительных частиц к поверхности электрода.

По сравнению с линейным сканированием циклические и ациклические сканирования могут обеспечивать лучшее представление стационарной (ограниченной диффузией) части сканирования. Преимущество циклических и ациклических сканирований может быть особенно преимущественным для количественного определения стационарных токов от квазиобратимых окислительно-восстановительных пар при высоких скоростях сканирования. Дополнительную информацию о линейной и циклической сканирующей вольтамперометрии можно найти в "Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications" by A.J. Bard and L.R. Faulkner, 1980.

Ациклические методики сканирования могут иметь множество преимуществ по сравнению с циклическими методиками сканирования, включая более короткое время сканирования и значительное уменьшение количества медиатора, электрохимически преобразуемого в измеряемое состояние. Таким образом, если медиатор восстанавливается в ответ на анализируемое вещество и электрохимически окисляется во время измерения, прекращение обратного сканирования до того, как окисленный медиатор электрохимически восстанавливается, уменьшает количество восстановленного медиатора в образце, нечувствительного к анализируемому веществу. Уменьшение времени сканирования может сделать возможным более короткое время анализа, представляющее собой значительный выигрыш для пользователя.

Фиг.3A представляет данные циклического сканирования при 25 мВ/с для окислительно-восстановительной пары феррицианид/ферроцианид как циклическую вольтамперограмму. Вольтамперограмма характеризуется пиком прямого сканирования во время сканирования при положительном напряжении от -0,3 В до +0,6 В, указывающим на окисление ферроцианида, и пиком обратного сканирования во время сканирования при отрицательном напряжении от +0,6 В назад до -0,3 В, указывающим на восстановление феррицианида. Пики прямого и обратного сканирования располагаются вокруг формального потенциала E°' (-0,05 мВ) окислительно-восстановительной пары ферроцианид/феррицианид в центре, если сравнивать с электродом сравнения. В этом аспекте потенциал электрода сравнения по существу определяется потенциалом восстановления феррицианида, главных окислительно-восстановительных частиц, присутствующих на электроде сравнения. Фиг.3B представляет данные половинного интеграла вольтамперограммы, чтобы показать влияние этого способа обработки данных на исходные данные. Фиг.3C показывает сравнимое ациклическое сканирование, где обратное сканирование прекращается перед началом пика обратного тока. Фиг.3D представляет собой половинный интеграл ациклического сканирования.

Процесс сканирования приводит к все большим токам вблизи рабочего электрода, когда потенциал возрастает по сравнению с формальным потенциалом E°'. В то же время окисление на поверхности электрода генерирует обедненную область и, таким образом, градиент концентрации вблизи электрода. Этот градиент концентрации создает движущую силу для диффузии дополнительного медиатора к электроду. В сочетании эти силы создают начальный прямой пик на вольтамперограмме, когда медиатор, восстановленный с помощью анализируемого вещества или оксидоредуктазы, проходит до рабочего электрода и повторно окисляется. Когда сканирование продолжается, ток затухает и достигает стационарной области от ~0,3 до ~0,6 В на фиг.3A. Ток, измеренный в стационарной области, может коррелировать с концентрацией восстановленного медиатора и, таким образом, с содержанием глюкозы в образце крови.

Хотя потенциалы, где начинаются прямые и обратные сканирования (диапазон сканирования), могут выбираться таким образом, чтобы они включали в себя восстановленные и окисленные состояния окислительно-восстановительной пары, диапазон сканирования может быть уменьшен для сокращения времени анализа. Однако диапазон сканирования предпочтительно включает в себя стационарную область для окислительно-восстановительной пары. На