Способы заживления ран введением il-18 человека

Способы заживления ран введением il-18 человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Для данной заявки испрашивается приоритет по предшествующей предварительной заявке США No. 60/603012, поданной 20 августа 2004 года, содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение, главным образом, относится к применению IL-18 человека, также известного как фактор, индуцирующий интерферон-γ (IGIF), для лечения ран.

Уровень техники

Причиной для заинтересованности в этом способе является относительная простота направления секретируемых белковых лекарственных средств в область их действия (в жидкости организма или к клеточной мембране). Секретируемые белки и внеклеточные участки трансмембранных белков можно непосредственно вводить в жидкости организма, или их можно направлять в жидкости организма или к мембранам с помощью природных путей. Природным путем секреции белка во внеклеточное пространство является эндоплазматическая сеть у эукариот и внутренняя мембрана у прокариот (Palade, Science, 189, 347 (1975); Milstein, et al., Nature New Biol, 239, 117 (1972); Blobel, et at, J. Cell. Biol, 67, 835 (1975)). С другой стороны, не существует известных природных путей экспорта белка с наружной поверхности клеток в цитозоль (за исключением пиноцитоза, механизма проникновения в клетки токсина змеиного яда). Таким образом, направление белковых лекарственных средств в клетки представляет собой крайне трудную проблему в данной области.

IL-18 представляет собой недавно открытый новый цитокин. Активный IL-18 человека содержит 157 аминокислотных остатков. Он обладает мощной биологической активностью, включая индукцию продукции T-клетками и спленоцитами интерферона-γ, усиление активности NK-клеток в отношении уничтожения клеток и обеспечение дифференцировки наивных CD4⁺ T-клеток в Th1-клетки. Кроме того, IL-18 человека усиливает продукцию GM-CSF и снижает продукцию IL-10. Было показано, что IL-18 обладает более значительной способностью в отношении индукции интерферона-γ, чем IL-12, и обнаружено, что он имеет различные рецепторы и использует различные пути передачи сигналов.

CD4⁺ T-клетки представляют собой центральные регуляторные элементы всех видов иммунного ответа. Они подразделяются на два подкласса: Th1 и Th2. Каждый подкласс определяется по способности секретировать различные цитокины. Интересно, что наиболее сильными индукторами дифференцировки являются сами цитокины. Развитие Th2-клеток из наивных предшественников индуцирует IL-4. До открытия IL-18 полагали, что IL-12 является главным цитокином, индуцирующим Th1. IL-18 также представляет собой стимулирующий Th1 цитокин, и в отношении стимуляции продукции интерферона-γ он является более мощным, чем IL-12.

Th1-клетки секретируют IL-2, интерферон-γ и TNF-β. Интерферон-γ, характерный для Th1 цитокин, действует непосредственно на макрофаги с усилением их микробицидной и фагоцитирующей активности. В результате, активированные макрофаги могут эффективно разрушать внутриклеточные патогены и опухолевые клетки. Th2-клетки продуцируют IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13, которые способствуют развитию B-клеток в продуцирующие антитела клетки. В общем, Th1-клетки, главным образом, ответственны за клеточно-опосредованный иммунитет, в то время как Th2-клетки ответственны за гуморальный иммунитет.

Заживление раны представляет собой высокоорганизованное взаимодействие, вовлекающее несколько типов клеток, компоненты экстрацеллюлярного матрикса и множество растворимых медиаторов, включая факторы роста и цитокины. Заживление раны может запускаться травмой, микроорганизмами или химическими веществами, которые вызвали повреждение ткани. Несмотря на то, что восстановление целостности тканей представляет собой врожденный иммунный ответ, существуют ситуации, при которых процесс заживления раны нарушается. Несколько факторов роста использовали для попытки предотвратить мукозит у пациентов со злокачественной опухолью, подвергавшихся лучевой терапии или химиотерапии, с ограниченным успехом. Peterson, Adv. Stud. Med., 4(4B):S299-S310, (2005). Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Neupogen) оказывал незначительный эффект на заболеваемость и тяжесть мукозита в двух из четырех исследований, в которых участвовали пациенты со злокачественной опухолью, подвергавшиеся лечению. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (Sargramostim) приводил к незначительному снижению тяжести мукозита, вызванного лучевой терапией и химиотерапией, хотя результаты были нестабильными. Было показано, что как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, так и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор обладает эффектом только в отношении профилактики мукозита полости рта. Было показано, что фактор роста кератиноцитов (Palifermin) является наиболее перспективным для профилактики мукозита как предотвращая заболеваемость, так и ограничивая длительность мукозита полости рта. С появлением средств, которые воздействуют на патофизиологию мукозита, клиницисты более не будут нуждаться в изменении режимов лучевой терапии или химиотерапии, а будут адаптировать протоколы для включения в них средства, которое предотвращает заболеваемость мукозитом. Очевидно, что в данной области существует необходимость в разработке новых терапевтических белков для ускорения заживления раны, в частности для лечения ран на коже, хирургических ран, язв на ногах, диабетических язв, мукозита, в частности желудочно-кишечного мукозита и мукозита полости рта, и повреждения легкого.

Раскрытие изобретения

В одном аспекте данное изобретение относится к способу заживления раны у пациента, нуждающегося в этом, включающему стадию введения пациенту терапевтически эффективного количества полипептида IL-18 человека (SEQ ID NO:1). В другом аспекте рана, предназначенная для лечения, выбрана из группы: ран на коже, хирургических ран, язв на ногах, диабетических язв, желудочно-кишечного мукозита, мукозита полости рта и повреждения легкого.

Во втором аспекте данное изобретение относится к способу заживления таких ран у пациента, нуждающегося в этом, включающему стадию введения пациенту фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество полипептида человека IL-18 (SEQ ID NO:1) и носитель.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена аминокислотная последовательность нативного IL-18 человека (SEQ ID NO:1).

На фиг.2 представлена аминокислотная последовательность IL-18 мышей (SEQ ID NO:2).

На фиг.3 представлена аминокислотная последовательность тромбоцитарного фактора роста-β мышей (PDGF-β) (SEQ ID NO:3). Зрелый PDGF-β мышей формируется путем удаления сигнального пептида (-20- -1) и как N-концевого (1-61), так и C-концевого (171-221) пропептидов (подчеркнуто).

На фиг.4 представлена аминокислотная последовательность KGF человека (SEQ ID NO:4).

На фиг.5 представлен эффект местного введения IL-18 мышей (SEQ ID NO:2), кодируемого аденовирусом, на заживление раны у мышей ob/ob. Каждая экспериментальная точка отражает среднее значение для каждой обработанной группы.

На фиг.6 представлен эффект очищенного белка IL-18 мышей (SEQ ID NO:2), доставляемого ежедневно системно посредством внутрибрюшинной инъекции, на заживление раны у мышей ob/ob. Каждая экспериментальная точка отражает среднее значение для каждой обработанной группы.

На фиг.7 представлен эффект ежедневной местной доставки IL-18 человека (SEQ ID NO:1) на заживление раны у мышей ob/ob. Каждая экспериментальная точка отражает среднее значение для каждой обработанной группы.

Описание изобретения

Полипептиды IL-18 человека описаны в EP 0692536A2, EP 0712931A2, EP 0767178A1 и WO 97/2441. Аминокислотная последовательность IL-18 человека указана в SEQ ID NO:1. Полипептиды IL-18 человека являются полипептидами, индуцирующими интерферон-γ. Они играют основную роль в индукции клеточно-опосредованного иммунитета, включая индукцию продукции T-клетками и спленоцитами интерферона-γ, усиление активности NK-клеток в отношении уничтожения клеток и обеспечение дифференцировки наивных CD4⁺ T-клеток в Th1-клетки.

IL-18 может использоваться для заживления ран у пациента, включая, но не ограничиваясь ими: раны на коже, хирургические раны, язвы на ногах, диабетические язвы, пролежневые язвы, мукозит, в частности желудочно-кишечный мукозит и мукозит полости рта, и заживление в легком. Заживление раны связано с регенерацией поврежденных клеток клетками того же типа. Процесс заживления раны включает в себя систематизированную координацию следующих клеточных событий: пролиферации, миграции, дифференцировки и ремоделирования. Цитокины, хемокины, факторы роста и молекулы адгезии функционируют в качестве клеточных медиаторов, которые контролируют конкретные клетки, вовлеченные в эти виды активности. Kampfer, et al, Molec. Med. 6(12): 10160-1027 (2000). Интерлейкин-18 (IL-18), провоспалительный цитокин, может индуцировать фактор некроза опухоли-альфа, интерлейкин 1-бета, и как CC-, так и CXC-хемокины, которые могут участвовать в воспалительной фазе процесса заживления раны. Puren, et al., J. Clin. Invest. 101: 711-721 (1998). Было идентифицировано несколько различных типов клеток, которые синтезируют IL-18, включая кератиноциты и активированные макрофаги, и те и другие из которых участвуют в заживлении раны. В культурах стимулированных Con A мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) in vitro, обработанных IL-18 человека, индуцируется продукция гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (GM-CSF). Ushio, et al, J. Immunol. 156:4274-4279 (1996). Кроме того, было показано, что IL-18 индуцирует продукцию T-клетками и NK-клетками интерферона-гамма (IFN-гамма). Было показано, что гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор ускоряет заживление раны (Arnold, et al., J. Wound Care 54:400-402 (1995)), и его применяют в клинике для лечения пациентов с хроническими язвами на ногах. DaCosta, et al, Wound Rep. Reg. 7:17-25 (1999). Авторы настоящего изобретения показали, что в модели заживления раны с иссечением на мышах IL-18 ускоряет заживление раны. Механизм, посредством которого IL-18 ускоряет заживление раны, может быть следствием провоспалительной природы цитокина или следствием того, что он является индуцирующим агентом для факторов роста, таких как гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор.

Полипептиды по настоящему изобретению могут быть выделены и очищены из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными способами, включая осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионную или катионную обменную хроматографию, хроматографию с фосфоцеллюлозой, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию с гидроксилапатитом, хроматографию с лецитином и высокоэффективную жидкостную хроматографию. Для восстановления активной конформации могут использоваться хорошо известные способы для повторного сворачивания белков, если в процессе внутриклеточного синтеза, выделения и/или очистки происходит денатурация полипептида. Способы очистки и получения активного IL-18 человека указаны в WO 01/098455.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептиды IL-18 человека (SEQ ID NO:1). Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения и могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.д. Вода может использоваться в качестве носителя в случае, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно. В качестве жидких носителей также могут использоваться солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, например, для инъецируемых растворов. Приемлемые фармацевтические эксципиенты включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Композиция, если желательно, также может содержать незначительные количества увлажнителей и эмульгаторов или средств с буферным действием в отношении pH. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с непрерывным высвобождением и т.п. Композиция может быть изготовлена в виде суппозитория с традиционными связующими веществами и носителями, такими как триглицериды. Пероральный состав может включать в себя стандартные носители, такие как маннитол, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, магний карбонат и т.д. фармацевтической степени очистки. Примеры приемлемых фармацевтических носителей описаны E.W. Martin в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество соединения, часто в очищенной форме, совместно с приемлемым количеством носителя, так чтобы обеспечить форму для надлежащего введения пациенту. Состав должен соответствовать способу введения.

В одном варианте осуществления этого изобретения композиция изготовлена в соответствии с общепринятыми процедурами в качестве фармацевтической композиции, пригодной для внутривенного введения человеку. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Если приемлемо, композиция также может включать в себя солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лигнокаин, для уменьшения боли в области инъекции. Как правило, ингредиенты поставляют отдельно друг от друга или их смешивают в единичную дозированную форму, например, в качестве сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата, в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного вещества. В случае если композиция предназначена для введения посредством инфузии, она может быть распределена в сосуде для инфузии, содержащем стерильную воду или физиологический раствор фармацевтической степени очистки. В случае если композицию вводят посредством инъекции, может быть предоставлена ампула стерильной воды для инъекций или физиологического раствора, так чтобы ингредиенты можно было смешивать перед введением.

Таким образом, полипептид может использоваться для производства лекарственного средства. Фармацевтические композиции по этому изобретению могут быть изготовлены в качестве растворов или в качестве лиофилизированных порошков для парентерального ведения. Порошки перед применением могут быть разбавлены добавлением пригодного разбавителя или другого фармацевтически приемлемого носителя. Жидкий состав может представлять собой забуференный изотонический водный раствор. Примерами приемлемых разбавителей являются изотонический физиологический раствор, стандартный 5% раствор декстрозы в воде или забуференный раствор ацетата натрия или аммония. Такой состав является особенно пригодным для парентерального введения, но также может использоваться для перорального введения, или он может находиться в дозирующем ингаляторе или небулайзере для инсуффляции. Может быть желательным добавление в такие фармацевтические композиции эксципиентов, таких как поливинилпирролидон, желатин, гидроксицеллюлоза, гуммиарабик, полиэтиленгликоль, маннит, хлорид натрия или цитрат натрия.

Альтернативно для перорального введения полипептид может быть инкапсулированным, таблетированным или изготовленным в составе эмульсии или сиропа. Для усиления или стабилизации композиции или для упрощения изготовления композиции могут быть добавлены фармацевтически приемлемые твердые или жидкие носители. Твердые носители включают в себя крахмал, лактозу, дигидросульфат кальция, сульфат кальция, стеарат магния или стеариновую кислоту, тальк, пектин, гуммиарабик, агар или желатин. Жидкие носители включают в себя сироп, арахисовое масло, оливковое масло, физиологический раствор и воду. Носитель также может включать в себя вещество для непрерывного высвобождения, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, отдельно или с воском. Количество твердого носителя варьирует, но находится между приблизительно 20 мг и приблизительно 1 г на единичную дозу. Фармацевтические препараты изготавливают в соответствии с общепринятыми способами фармацевтики, включающими в себя измельчение, смешивание, гранулирование и, если применимо, прессование для таблетированных форм; или измельчение, смешивание и заполнение для форм в виде твердых желатиновых капсул. При использовании жидкого носителя препарат будет находиться в форме сиропа, эликсира, эмульсии, или водной, или неводной суспензии. Такой жидкий состав может быть введен непосредственно перорально (п.o.) или он может находиться в мягкой желатиновой капсуле.

Полипептиды IL-18 человека могут быть получены в качестве фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество полипептида в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. В композициях по этому изобретению может использоваться водная суспензия или раствор, содержащий полипептид, создающий физиологический pH, в форме, готовой для инъекции. Композиции для парентерального введения обычно содержат раствор полипептида по этому изобретению или смесь полипептидов, растворенную в фармацевтически приемлемом носителе, таком как водный носитель. Может использоваться множество водных носителей, например, 0,4% физиологический раствор, 0,3% глицин и т.п. Такие растворы являются стерильными и, как правило, не содержат твердых частиц. Такие растворы могут быть стерилизованы общепринятыми хорошо известными способами стерилизации (например, фильтрацией). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые необходимы для приближения к физиологическим условиям, такие как изменяющие pH и буферные средства, и т.д. Концентрация полипептида по этому изобретению в таком фармацевтическом составе может варьировать в широких пределах, т.е. от менее чем приблизительно 0,5%, как правило или по меньшей мере от приблизительно 1% вплоть до 15 или 20% по массе и первоначально ее выбирают на основе объемов жидкостей, вязкостей и т.д., в соответствии с конкретным выбранным способом введения.

Таким образом, может быть получена фармацевтическая композиция по этому изобретению для внутримышечной инъекции с содержанием 1 мл стерильной забуференной воды, и между приблизительно 1 нг и приблизительно 100 мг, например от приблизительно 50 нг до приблизительно 30 мг или от приблизительно 5 мг до приблизительно 25 мг полипептида по этому изобретению. Аналогично фармацевтическая композиция по этому изобретению для внутривенной инфузии может быть изготовлена с содержанием приблизительно 250 мл стерильного раствора Рингера и от приблизительно 1 мг до приблизительно 30 мг или от приблизительно 5 мг до приблизительно 25 мг полипептида по этому изобретению. Существующие в настоящее время способы получения парентерально вводимых композиций хорошо известны или будут понятны специалистам в данной области и более подробно описаны, например, в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Полипептиды по этому изобретению, если изготовлены в фармацевтическом препарате, могут находиться в единичных дозированных формах. Пригодная терапевтически эффективная доза может быть легко определена специалистами в данной области. Такая доза, если целесообразно, может быть повторно введена через соответствующие временные интервалы, подобранные соответствующим образом врачом, в течение периода ответа.

Кроме того, для упрощения идентификации оптимальных диапазонов дозирования необязательно могут использоваться анализы in vitro. Точная доза для использования в составе также будет зависеть от способа введения и тяжести заболевания или нарушения и должна быть определена по усмотрению специалиста и в соответствии с обстоятельствами для каждого пациента. Эффективные дозы могут быть экстраполированы исходя из кривых "доза-эффект", полученных с помощью тестовых систем in vitro или моделей на животных.

Для полипептидов вводимая пациенту доза, как правило, составляет от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг массы тела пациента. Доза, вводимая пациенту, может составлять между 0,1 мг/кг и 20 мг/кг массы тела пациента или альтернативно от 1 мг/кг до 10 мг/кг массы тела пациента. Как правило, полипептиды человека обладают более продолжительным временем полувыведения из организма человека по сравнению с полипептидами других видов, вследствие иммунного ответа на чужеродные полипептиды. Таким образом, часто возможно снижение дозы полипептидов человека и менее частое введение. Кроме того, доза и частота введения полипептидов по этому изобретению могут быть снижены повышением усвоения и проникновения в ткани (например, в головной мозг) полипептидов посредством модификаций, например, таких как липидация.

Это изобретение также относится к фармацевтическому комплекту или набору, содержащему один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по этому изобретению. Необязательно к такому контейнеру(ам) может быть приложена заметка в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, где записка отражает одобрение органом производства, применения или продажи для введения человеку. В другом варианте осуществления этого изобретения может быть предоставлен набор с соответствующим количеством контейнеров, необходимым для осуществления требуемого дозирования для лечения по конкретным показаниям.

В другом варианте осуществления соединение или композиция может быть доставлена в везикуле, в частности в липосоме (см. Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat, et al, в LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTION DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein и Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp.317-327; см., главным образом ibid.).

В еще одном варианте осуществления соединение или композиция может быть доставлена в системе с контролируемым высвобождением. В одном варианте осуществления может использоваться дозатор (см. Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald, et al, Surgery 88:507 (1980); Saudek, et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). В другом варианте осуществления могут использоваться полимерные материалы (см. MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer и Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974); CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen и Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger, et al, J., Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); см. also Levy, et al, Science 228:190 (1985); During, et al, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard, et al, J. Neurosurg. 71:105 (1989)). В еще одном варианте осуществления система с контролируемым высвобождением может быть помещена в непосредственной близости к терапевтической мишени, т.е. к головному мозгу, таким образом, что делает необходимой только часть системной дозы (см., например, Goodson, в MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, supra, vol.2, pp.115-138 (1984)). Другие системы с контролируемым высвобождением описаны в обзоре Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

Полипептиды IL-18 человека (SEQ ID NO:1) могут быть введены приемлемым способом введения внутрь, и при необходимости введение может быть повторено, например, с частотой от одного до трех раз в сутки в течение между 1 сутками и приблизительно 1 неделей до одного раза в неделю или одного раза в две недели. Альтернативно пептид может быть изменен для снижения плотности заряда и, таким образом, для обеспечения пероральной биодоступности. Доза и продолжительность лечения связаны с относительной длительностью нахождения молекулы по настоящему изобретению в кровотоке человека, и они могут быть подобраны специалистом в данной области в зависимости от состояния, от которого лечат, и общего состояния здоровья пациента.

Это изобретение относится к способам лечения, остановки и профилактики посредством введения пациенту-человеку эффективного количества соединения или фармацевтической композиции по этому изобретению, содержащей полипептид IL-18 человека (SEQ ID NO:1). В одном варианте осуществления этого изобретения соединение является по существу очищенным (например, по существу не содержащим веществ, которые ограничивают его эффект или вызывают нежелательные побочные эффекты). Составы и способы введения могут использоваться, если соединение содержит полипептид, как описано выше; дополнительные пригодные составы и способы введения могут быть выбраны среди тех, которые описаны здесь ниже.

Для введения соединения по этому изобретению известны и могут использоваться различные системы для доставки, например инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать соединение, рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu, et al, J. Biol. Chern. 262:4429-4432 (1987)), конструкция нуклеиновой кислоты, как часть ретровирусного или другого вектора и т.д. Способы введения включают в себя, но не ограничиваются ими, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и пероральный способы. Соединения или композиции могут быть введены любым пригодным способом, например посредством инфузии или болюсной инъекции, посредством всасывания через эпителиальные или кожно-слизистые слои (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и тонкого кишечника и т.д.) и могут быть введены совместно с другими биологически активными веществами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, может быть желательным введение фармацевтических соединений или композиций по этому изобретению в центральную нервную систему приемлемым способом, включая внутрижелудочковую и внутриоболочечную инъекцию; внутрижелудочковая инъекция может быть упрощена с помощью внутрижелудочкового катетера, например, соединенного с резервуаром, таким как резервуар Оммайя. Также может использоваться легочное введение, например, с использованием ингалятора или небулайзера и состава со средством для получения аэрозоля.

В одном варианте осуществления этого изобретения может быть желательным введение фармацевтических соединений или композиций по этому изобретению местно в область, которую необходимо лечить. Такое введение может быть достигнуто, например, но не ограничиваясь этим, местной инфузией в процессе хирургической операции, местным нанесением, например, совместно с перевязкой раны после операции, инъекцией, посредством катетера, посредством суппозитория, или посредством имплантата, где указанный имплантат представляет собой пористый, непористый или гелеобразный материал, включая сюда мембраны, такие как силастиковые мембраны, или волокна. При введении белка целесообразно использовать материалы, которые не абсорбируют белок.

Способ введения полипептида по этому изобретению может представлять собой любой пригодный способ, которым вещество доставляется хозяину. Полипептиды и фармацевтические композиции по этому изобретению особенно пригодны для парентерального введения, т.е., подкожного, внутримышечного, внутривенного или интраназального, или для местного введения, если используются для заживления ран на коже. Для лечения мукозита полипептиды могут быть доставлены пациенту посредством парентерального введения.

Настоящее изобретение может быть осуществлено в других конкретных формах без отклонения от его сущности или основных свойств, и, таким образом, следует ссылаться на прилагаемую формулу изобретения в большей степени, чем на предшествующее описание или последующие примеры, как определяющую объем этого изобретения.

Словарь терминов

Следующие ниже определения предоставлены для упрощения понимания определенных терминов, часто используемых выше.

Как используется здесь, термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, совместно с которым вводят лекарственное средство.

Термин "выделенный" означает измененный "руками человека" по сравнению с его природным состоянием, т.е., если он встречается в природе, то он изменен или удален из естественного окружения, или и то и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, в природе встречающийся в живом организме, не является "выделенным", но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от по меньшей мере одного из сосуществующих с ним клеточных материалов в его природном состоянии, является "выделенным", в смысле используемого здесь термина. Более того, полинуклеотид или полипептид, которые вводят в организм посредством трансформации, генетической манипуляции или любым другим рекомбинантным способом, является "выделенным" даже если он все еще находится в указанном организме, где организм может быть живым или неживым.

Как используется здесь, термин "мукозит" означает разрушение эпителиального слоя или органа, например, в кишечнике, мочевом пузыре, в полости рта, в результате облучения или химиотерапии.

Как используется здесь, термин, "фармацевтический" включает в себя применение этого изобретения в ветеринарии. Термин "терапевтически эффективное количество" относится к такому количеству терапевтического средства, которое является пригодным для облегчения выбранного состояния.

Как используется здесь, термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или приведенный в списке Фармакопеи США или другой общепринятой фармакопеи для применения у животных и, более конкретно, у человека. "Полипептид" относится к любому полипептиду, содержащему две или более аминокислоты, соединенные друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. к стерическим изомерам пептидов. "Полипептид" относится как к коротким цепям, обычно называемым пептидами, олигопептидами или олигомерами, так и к более длинным цепям, обычно называемым белками. Полипептиды могут содержать аминокислоты, отличные от тех 20 аминокислот, которые кодируются генами. "Полипептиды" включают в себя аминокислотные последовательности, модифицированные либо в природных процессах, таких как посттрансляционный процессинг, либо способами химической модификации, которые хорошо известны в данной области. Такие модификации хорошо описаны в основных учебниках и более подробно в монографиях, а также в многотомной исследовательской литературе. Модификации могут быть осуществлены в любом участке полипептида, включая остов пептида, боковые цепи аминокислот и N- или C-концы. Следует понимать, что один и тот же тип модификации может быть представлен в той же или другой степени в нескольких участках данного полипептида. Также данный полипептид может содержать множество типов модификаций. Полипептиды могут быть разветвленными как результат убиквитинилирования, и они могут быть циклическими с ветвлением или без него. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут образовываться вследствие посттрансляционных природных процессов или могут быть получены синтетическими способами. Модификации включают в себя ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, биотинилирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение группы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, поперечное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование якоря GPI, гидроксилирование, иодинирование, метилирование, миристоилирование, оксидирование, протеолитическую обработку, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатацию, опосредуемое транспортной РНК добавление к белкам аминокислот, такое как аргинилирование, и убиквитинилирование (см., например, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, в POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al, Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990; Rattan, et al, Ann. NY Acad. Set, 663: 48-62 (1992)).

Ковалентное присоединение биологически активных соединений к растворимым в воде полимерам является одним из способов изменения и контроля биологического распада, фармакокинетики и, часто, токсичности этих соединений (Duncan, R. и Kopecek, J. (1984) Adv. Polym. Sci. 57:53-101). Для достижения этих эффектов используется множество растворимых в воде полимеров, таких как полисиаловая кислота, декстран, поли(N-(2-гидроксипропил)метакриламид) (PHPMA), поли(N-винилпирролидон) (PVP), поливиниловый спирт (PVA), сополимер этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(N-акрилоилморфолин) (PAcM) и полиэтиленгликоль (PEG) (Powell, G.M. (1980) Polyethylene glycol. R.L. Davidson (Ed.) HANDBOOK OF WATER SOLUBLE GUMS AND RESINS. McGraw-Hill, New York, chapter 18). PEG обладает идеальным набором свойств: очень низкой токсичностью (Pang, S.N. J. (1993) J. Am. Coll. Toxicol. 12: 429-456), превосходной растворимостью в водном растворе (Powell, supra), низкой иммуногенностью и антигенностью (Dreborg, S. and Akerblom, E.B. (1990) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sy st. 6: 315-365). Конъюгированные с PEG или "пэгилированные" белковые лекарственные средства, содержащие в белке единичные или множественные цепи полиэтиленгликоля, описаны в научной литературе (Clark, R., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:21969-21977; Hershfield, M.S. (1997) Biochemistry and immunology of poly(ethylene glycol)-modified adenosine deaminase (PEG-ADA). J.M. Harris and S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, DC, p.l45-154; Olson, K., et al. (1997) Preparation and characterization of poly(ethylene glycosylated human growth hormone antagonist. J. M. Harris and S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, DC, p 170-181).

Как используется здесь, термин "заживление раны" означает процессы репарации тканей, вовлеченные в заживление раны, включая, но не ограничиваясь ими, закрытие раны.

Все публикации и ссылки, включая, но не ограничиваясь ими, патенты и патентные заявки, цитированные в этом описании, включены в качестве ссылок в полном объеме, как если бы каждая отдельная публикация или ссылка была конкретно и отдельно указана как включенная в качестве ссылки, являясь указанными полностью. Любая патентная заявка, по которой в данной заявке испрашивается приоритет, также полностью включена в качестве ссылки таким же образом, как описано выше для публикаций и ссылок.

Пример 1: Модель заживления раны с иссечением

У диабетических мышей, таких как мыши линии ob/ob, показано замедленное заживление ран. Stallmeyer, et al, Diabetologia 44: 471-479 (2001). Мыши ob/ob являются природной линией мышей, которые обладают делецией в гене ob/ob, который кодирует лептин. Лептин связывается с рецептором цитокинов класса I obRb, и активирует внутриклеточный каскад передачи сигнала, который приводит к снижению аппетита. Вследствие того что мыши ob/ob не могут продуцировать лептин, они страдают ожирением, в два раза превышая по массе нормальных мышей C57/B16. Мыши с ожирением также обладают другими метаболическими дефектами, включая сниженный термогенез, гиперфагию, сниженную фертильность и ингибирование гормона роста. Ring, et al., Endocrinol. 141(1): 446-449 (2000). Выраженное замедление заживления ран у мышей ob/ob является характерным для их диабетического фенотипа.

Модели с нарушенным заживлением ран позволяют изучать эффекты конкретных цитокинов, таких как IL-18, и факторов роста, таких как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), на заживление раны. Было показано, что местное применение PDGF-β усиливает заживление раны у мышей диабетической линии db/db. Greenlaugh, et al, Am. J. Pathol. 136: 1235-1246 (1990). Линия db/db фенотипически сходна с линией ob/ob, но мыши db/db лишены рецептора лептина. Было показано, что в ранах у мышей db/db происходит значительное замедление инфильтрации клеток, формирования грануляционной ткани и замедление заживления ран. Тромбоцитарный фактор роста (PDGF-β) представляет собой митоген, а также хемоаттрактант для гладкомышечных клеток и фибробластов, и он вызывает быструю реэпителизацию ран у мышей db/db. Несмотря на то, что интерлейкин-18 (IL-18) прежде не использовали в качестве терапевтического средства в модели заживления ран, исследования показали повышенный уровень экспрессии, но не белковой продукции, IL-18 в ранах мышей ob/ob. Kampfer, et al, J. Invest. Derm. 113(3): 369-74 (1999). Вследствие того что IL-18 представляет собой провоспалительный цитокин (Kampfer, et al., Eur. Cytokine Netw. 11:626-33 (2000)), он может участ