Продукт, освежающий дыхание, дезинфицирующий полость рта и содержащий экстракт коры магнолии и поверхностно-активное вещество

Изобретение относится к косметической промышленности, в частности к составам для ухода за полостью рта. Состав для ухода за полостью рта, освежающий дыхание, содержащий средство доставки в полость рта и противомикробное средство, включающее экстракт коры магнолии и анионное поверхостно-активное вещество (варианты). Вышеописанный состав (варианты) обладает повышенным эффектом подавления роста биологической пленки в полости рта и освежения дыхания за счет синергического сочетания компонентов. 7 н. и 17 з.п. ф-лы, 15 табл.

Реферат

Настоящая заявка представляет собой частичное продолжение заявки США с серийным номером №10/606,671, поданной 25 июня 2003 года и заявляющей приоритет на предварительную заявку с серийным номером №60/319,346, поданной 25 июня 2002 года.

Настоящее изобретение в основном касается кондитерских составов, более конкретно, оно касается кондитерских составов, содержащих экстракт коры магнолии, а также способов получения указанных составов

На продукты, освежающие дыхание и уничтожающие бактерии в полости рта, существует значительный потребительский спрос. Продукт для ухода за полостью рта, обладающий эффектом освежения дыхания и бактерицидным эффектом, представляет собой удобный способ доставки в целях дезинфекции полости рта и освежения дыхания. Освежение дыхания, безусловно, представляет собой очень важную часть будничной жизни.

Для того чтобы поддерживать необходимую гигиену полости рта, на протяжении всего дня следует неоднократно проводить дезинфекцию полости рта, а также освежение дыхания. Однако проведение дезинфекции полости рта или освежения дыхания может быть трудным или неудобным, это зависит от характера требуемого освежения, а также от той ситуации, в которой этот процесс может происходить. Общеизвестными способами ухода за полостью рта, пригодными для условий частных жилищ, являются: чистка зубной щеткой, использование зубных нитей (флоссов), очистка языка или полоскание горла с применением разнообразных приспособлений и составов. Однако такие приспособления и составы менее удобны вне дома, где «удобства» ванной и туалета могут быть недостаточны, недоступны или негигиеничны.

Зубной налет представляет собой микробные отложения, образующиеся на зубах при коротком времени их чистки щеткой. Исследователи описывают этот налет как мягкую, плотную массу, которая в основном содержит разнообразные бактерии, а также определенное количество остатков клеток, образующихся за короткое время, в течение которого воздерживаются от чистки зубов щеткой. При полоскании водой зубной налет не удаляется. Позже исследователи признали, что этот налет представляет собой биологическую пленку. Зубной налет описывают как разнотипное сообщество микроорганизмов, находящихся на поверхности зубов в виде биологической пленки. Эта биологическая пленка встроена во внеклеточную матрицу полимеров, создаваемую как поверхностью зуба, так и микроорганизмами. Обычно признается, что уменьшению зубного налета способствуют чистка зубов, свежесть дыхания, а также лечебные жевательные резинки. Однако биологическая пленка зубного налета очень стойка к воздействию противомикробных средств.

Противомикробные средства, показавшие свою способность уменьшать зубной налет, включают в себя хлоргексидин, цетилпиримидинхлорид (СРС), триклозан и дельмопинол. Все они представляют собой лекарственные и синтетические средства. Было также обнаружено, что наряду с другими эфирными маслами в носителе на основе спирта налет уменьшают эфирные масла типа тимола, эвкалиптового масла, метилсалицилата и ментола. Несмотря на то что тимол наиболее эффективен в уменьшении налета, он имеет неприятный вкус. Обычно полезное действие этих масел вызвано присутствием спирта, увеличивающего растворимость указанных масел, а также проницаемость их сквозь пленку налета. Несмотря на то что высокие концентрации спирта пригодны для гигиены полости рта (например, в виде средств для очистки полости рта), при их применении в оральных составах (типа жевательных резинок, съедобных пленок и кондитерских изделий и т.п.) может оставаться горькое послевкусие.

Активнодействующий агент или комбинация активнодействующих агентов, полезное действие которых может заключаться или в удалении налета, предотвращении или замедлении его образования, или в противовоспалительном действии, помогающем поддерживать лечебное действие жевательных резинок, будут способствовать действию указанных жевательных резинок, а также освежению дыхания. Известно о включении в состав для ухода за полостью рта активнодействующих агентов, это делается для того, чтобы обеспечить полезные для полости рта действия, включая освежение дыхания и бактерицидные свойства. Такие системы имеют преимущества, обеспечивая быстрый, эффективный и удобный способ доставки.

В соответствии с настоящим изобретением неожиданно было обнаружено, что экстракт коры магнолии в сочетании с определенными поверхностно-активными агентами обладает синергическим действием, подавляя рост бактерий, вызывающих образование зубного налета. При сочетании экстракта коры магнолии с отобранными поверхностно-активными агентами демонстрируется усиление активности против роста налета как при избытке экстракта коры магнолии, так и при избытке поверхностно-активного вещества.

Настоящее изобретение касается также состава для ухода за полостью рта, содержащего экстракт коры магнолии в сочетании с поверхностно-активным агентом, предназначенного для бактерицидного действия и обладающего свойствами освежать дыхание. Более конкретно, настоящее изобретение касается таких средств для ухода за полостью рта, как зубная паста или зубной порошок, жевательная резинка, а также содержащих эффективное количество экстракта коры магнолии и поверхностно-активного агента кондитерских изделий, таблеток, аэрозоля для полости рта или съедобных пленок; при потреблении указанных зубной пасты или зубного порошка, жевательной резинки, кондитерских изделий, аэрозоля для полости рта или съедобных пленок заявляемый состав эффективно инактивирует или уничтожает микробы в полости рта, а также освежает дыхание. В состав для ухода за полостью рта дополнительно в целях синергического увеличения эффективности действия экстракта коры магнолии вводят поверхностно-активный агент.

В одном аспекте настоящего изобретения состав для ухода за полостью рта, предназначенный для освежения дыхания потребителя, включает средство доставки в полость рта, а также эффективное количество противомикробного средства, включающего синергическое соотношение экстракта коры магнолии и поверхностно-активный агент, причем указанное синергическое соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1 часть экстракта коры магнолии на 1 часть поверхностно-активного агента.

Пригодные поверхностно-активные агенты включают (но ими не ограничены): стандартные ПАВ, мыла, смачивающие средства, а также эмульгаторы. Некоторые примеры ПАВ включают (но ими не ограничены): соли калия, аммония или натрия, соли натрия включают анионактивные ПАВ, типа алкилсульфатов, включая натрий лаурилсульфат, натрий лауретсульфат и т.п. Другие соли натрия включают натрий лауроилсаркосинат, натрий брасслат и им подобные. Подходящие соли аммония включают аммоний лаурилсульфат, аммоний лауретсульфат, аммоний лауроилсаркосинат, аммоний брасслат, аммоний кокамидопропилбетаин и им подобные. Другие пригодные поверхностно-активные средства включают эмульгаторы, которые могут представлять собой жирные кислоты (например, стеариновую кислоту, пальмитиновую кислоту, олеиновую кислоту и линолевую кислоту), их соли, глицеролмоностеарат, глицеролтриацетат, лецитин, моно- и триглицериды, а также ацетилированные моноглицериды. Как это будет описано ниже, некоторые подходящие поверхностно-активные средства также демонстрируют индивидуальные бактерицидные (уничтожающие микроорганизмы) свойства.

В другом аспекте настоящего изобретения указанный продукт для ухода за полостью рта представляет собой жевательную резинку или любую ее модификацию, включая (но ими не ограничиваются): вздувающиеся жевательные резинки, большие таблетки, а также жевательные резинки в виде шариков или брусков. Жевательные резинки могут представлять собой жевательную резинку с покрытием или без него, они также могут иметь разнообразный вкус, форму и размер. Состав жевательной резинки, предназначенный для освежения дыхания потребителя, включает в себя водорастворимую часть, по меньшей мере один ароматизатор, часть основы жевательной резинки, а также эффективное количество противомикробного средства, содержащего синергическое соотношение экстракта коры магнолии и поверхностно-активного агента, причем указанное синергическое соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1 часть экстракта коры магнолии на 1 часть поверхностно-активного агента.

В еще одном аспекте настоящего изобретения указанный продукт для ухода за полостью рта представляет собой кондитерский состав, включая (но ими не ограничиваясь): твердые леденцы, жевательные леденцы, леденцы с начинкой, а также прессованные таблетки. Такой кондитерский состав, предназначенный для освежения дыхания потребителя, включает в себя по меньшей мере один сахар или полиспирт, полученный при восстановлении карбонильной группы моносахарида в гидроксильную группу, а также эффективное количество противомикробного средства, содержащего синергическое соотношение экстракта коры магнолии и поверхностно-активного агента, причем указанное синергическое соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1 часть экстракта коры магнолии на 1 часть поверхностно-активного агента.

В еще одном аспекте настоящего изобретения указанный продукт для ухода за полостью рта представляет собой съедобный пленкообразный состав, в которой входит эффективное количество пленкообразующего вещества, а также эффективное количество противомикробного средства, содержащего синергическое соотношение экстракта коры магнолии и поверхностно-активного агента, причем указанное синергическое соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1 часть экстракта коры магнолии на 1 часть поверхностно-активного агента.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ дезинфекции полости рта, включающий помещение в полость рта состава для ухода за указанной полостью, причем этот состав содержит эффективное количество противомикробного средства, содержащего синергическое соотношение экстракта коры магнолии и поверхностно-активного агента, и указанное синергическое соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1 часть экстракта коры магнолии на 1 часть поверхностно-активного агента.

Подробное описание настоящего изобретения

Известно, что жевательные резинки, леденцы и тонкие пленки используют в качестве носителей для доставки в полость рта компонентов, обеспечивающих такие полезные свойства в полости рта, как освежение дыхания и бактерицидное действие. Преимущество таких систем состоит в том, что потребитель обеспечивается удобным и недорогим способом поддержания гигиены полости рта и свежего дыхания на протяжении всего дня.

Настоящее изобретение включает экстракт коры магнолии в качестве активного компонента для освежения дыхания и бактерицидного действия в полости рта. Известно, что экстракт коры магнолии обладает бактерицидными свойствами, а также противогрибковым действием. Двумя компонентами экстракта коры магнолии, обладающими противомикробной активностью, являются магнолол и гонокиол.

Используемый в настоящем изобретении экстракт коры магнолии может быть получен от O'Laughlin Industries Co., LTD, Guang Zhou Masson Pharmaceutical Co., Honsea Sunshine Bioscience and Technology Co. Экстракт коры магнолии получают в виде порошка. Указанный экстракт растворяют вместе с ароматизатором, и в целях растворения при приготовлении продукта для ухода за полостью рта его можно нагреть.

Несмотря на то что в растворе уничтожить бактерии сравнительно легко, биологическая пленка в виде зубного налета представляет собой сложную среду, обеспечивающую защиту от окружающей угрозы как отдельным бактериям, так и их разнообразным видам (A.Sharma, S.Inagaki, W.Sigurdson, H.K.Kuramitsu, 2005, Synergy between Tannerella forsythia and Fusobacterium nucleatum in biofilm formation, Oral Microbiology and Immunology, 20: 39-42). Поэтому по сравнению с простым тестом по уничтожению микроорганизмов показать реальную эффективность противомикробного средства в отношении зубного налета, закончившего начальный рост, намного труднее. Диффузия в биологическую пленку ограничена, а бактерии внутри объема этой пленки защищены от воздействия противомикробного средства внеклеточным веществом типа глюкана и полисахаридов декстрана. Поэтому, вероятно, легче предотвратить образование налета, чем удалить его по окончании начального роста.

В соответствии с настоящим изобретением противомикробное действие экстракта коры магнолии усиливается благодаря его комбинации с поверхностно-активным средством. Несмотря на то что не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено какой-либо определенной теорией, предполагается, что сочетание поверхностно-активного вещества с эффективным количеством экстракта коры магнолии способно обеспечить такой состав для ухода за полостью рта, который способствует уменьшению биологической пленки налета на зубах, а также в других зонах полости рта типа языка. Предполагается, что комбинация экстракта коры магнолии с подходящим поверхностно-активным средством может предотвратить прикрепление бактерий к пелликуле. Состав такого типа для ухода за полостью рта может замедлить или предотвратить увеличение налета. Далее, состав для ухода за полостью рта по настоящему изобретению, объединенный с ферментами, дополнительными поверхностно-активными средствами, абразивами, а также их комбинациями, может быть эффективен в удалении уже существующего зубного налета.

Предпочтительным поверхностно-активным агентом является такое средство, которое увеличивает растворимость экстракта коры магнолии и которое можно использовать в качестве пищевой добавки. Пригодные поверхностно-активные агенты включают (но ими не ограничены): стандартные ПАВ, мыла, смачивающие средства, а также эмульгаторы. Некоторые примеры ПАВ включают (но ими не ограничены): соли калия, аммония или натрия. Соли натрия включают анионактивные ПАВ типа алкилсульфатов, включая натрий лаурилсульфат, натрий лауретсульфат и т.п. Другие соли натрия включают натрий лауроилсаркосинат, натрий брасслат и им подобные. Подходящие соли аммония включают аммоний лаурилсульфат, аммоний лауретсульфат, аммоний лауроилсаркосинат, аммоний брасслат, аммоний кокамидопропилбетаин и им подобные. Другие пригодные поверхностно-активные средства включают эмульгаторы, которые могут представлять собой жирные кислоты (например, стеариновую кислоту, пальмитиновую кислоту, олеиновую кислоту и линолевую кислоту), их соли, глицеролмоностеарат, глицеролтриацетат, лецитин, моно- и триглицериды, а также ацетилированные моноглицериды. Как это будет описано ниже, некоторые подходящие поверхностно-активные средства также демонстрируют индивидуальные бактерицидные (уничтожающие микробов)свойства.

Состав для ухода за полостью рта может включать в себя дополнительные ингредиенты, освежающие дыхание, или ингредиенты, осуществляющие гигиену полости рта, указанными ингредиентами могут быть противомикробные средства. Помимо этого, указанные дополнительные ингредиенты, освежающие дыхание и осуществляющие гигиену полости рта, содержат приемлемые с пищевой точки зрения соли цинка или меди, охлаждающие агенты, пирофосфаты или полифосфаты, а также им подобные.

Настоящее изобретение включает также способ лечения, осуществляемый в целях снижения количества бактерий в ротовой полости или снижения их активности. Метод предусматривает следующие стадии: приготовление состава для ухода за полостью рта, содержащего экстракт коры магнолии в таком количестве, которое, в сочетании с поверхностно-активным средством, достаточно для уничтожения или дезактивирования бактерий полости рта; а также потребление указанного состава для ухода за полостью рта субъектом, нуждающимся в таком лечении, причем благодаря этому лечению количество бактерий в ротовой полости указанного субъекта снижается или эти бактерии инактивируются.

В одной форме указанный состав для ухода за полостью рта составлен таким образом, чтобы в полость рта доставлялось по меньшей мере от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,005% экстракта коры магнолии. В другой форме указанный состав для ухода за полостью рта составлен таким образом, чтобы в полость рта доставлялось по меньшей мере 0,01% экстракта коры магнолии. Для того чтобы увеличить эффективность состава для ухода за полостью рта, в качестве средства доставки в указанный состав добавляют одно или более поверхностно-активнощ средство.

В соответствии с одним вариантом настоящего изобретения в составе для ухода за полостью рта присутствует один или более поверхностно-активных агентов, их концентрация составляет от приблизительно 0,001% до приблизительно 2,0%. В таком составе для ухода за полостью рта экстракт коры магнолии объединен с поверхностно-активным агентом в таком синергическом соотношении, которое обеспечивает увеличение эффективности по уничтожению микроорганизмов. Указанное синергическое соотношение составляет от приблизительно 1 части экстракта коры магнолии на 1 часть поверхностно-активного агента до приблизительно 4 частей экстракта коры магнолии на 1 часть поверхностно-активного агента. Одним особенно эффективным поверхностно-активным агентом является натрий лаурилсульфат, а особенно эффективным с синергической точки зрения является состав, содержащий 2 части коры на 1 часть натрий лаурилсульфата.

Принимая во внимание, что экстракт коры магнолии представляет собой гидрофобное соединение, имеется несколько средств доставки в полость рта, которые можно использовать в целях увеличения высвобождения экстракта коры магнолии из состава для ухода за полостью рта. В жевательной резинке ее основа является гидрофильной и это также способствует высвобождению экстракт коры магнолии. В различных вариантах изобретательских кондитерских составов экстракт коры магнолии, объединенный с поверхностно-активным соединением, можно инкапсулировать, высушить распылением или включить в состав покрытия; это делается для того, чтобы облегчить высвобождение указанного экстракта в полость рта.

В целях оценки эффективности экстракта коры магнолии проводился in vitro анализ трех поддесневых бляшкообразных вирусных бактерий, связанных с наличием дурного запаха изо рта. Порядок определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) был следующим. В качестве положительного эталона использовали хлоргексидин, а в качестве отрицательного - стерильную воду. В качестве растворителя экстракта коры магнолии использовался ментол и Твин 80. Твин 80 известен под стандартным названием Polysorbate 80. Для описанного анализа использовали микротитровальные пластины с 96 ячейками. В каждой из ячеек находились бактерии в количестве 5×105 колониеобразующих единиц/мл (КОЕ/мл), периодически разбавляемые адаптогенами, а также среда для роста бактерий. Все бактериальные культуры стационарно инкубировали при 37°С. Рост бактерий оценивали спустя 48 ч, используя для этого спектрофотометрический анализ при 660 нм. Минимальная ингибирующая концентрация для каждой из анализируемых бактерий определялась как такая минимальная концентрация испытуемого соединения, которая ограничивает мутность до величины поглощения, составляющей при 660 нм менее 0,05.

Минимальные бактерицидные концентрации (МВС) определяли с использованием микротитровальных пластины с 96 ячейками, при этом периодически проводилось такое разбавление, как это было описано выше для определения MIC. Периодическое разбавление культур в ячейках продемонстрировало, что никакого видимого роста не произошло, и 10 мкл культуры поместили на три одинаковые пластины с кровяным агаром. После проведения на этих пластинах инкубирования в течение 48 ч при 37°С сделали подсчет жизнеспособных колоний. В первичном инокуляте для каждой из испытуемых бактерий была определена величина КОЕ/мл. Значение МВС определялось как такая самая низкая концентрация испытуемого соединения, при которой уничтожается по крайней мере 99,9% клеток, находящихся в первичном инокуляте.

Результаты проведенных исследований по определению минимальной ингибирующей концентрации (MIC) и минимальной бактерицидной концентрации (МВС) для экстракта коры магнолии были следующими. Значение MIC для 90% экстракта коры магнолии в случае Streptococcus mutans составило 15,62 мкг/мл. В случае Porphyromonas gingivalis величина MIC для 90% экстракта коры магнолии равна 3,91 мкг/мл, а для 65% экстракта коры магнолии - 7,82 мкг/мл. В случае Fusobacterium nucleatum значение MIC для 90% экстракта коры магнолии составило 3,91 мкг/мл, а величина МВС - 7,82 мкг/мл. В отношении того же самого микроорганизма значения MIC и МВС для 65% экстракта коры магнолии составили 7,82 мкг/мл. В качестве положительного эталона использовался хлоргексидин, величины MIC и МВС в хлоргексидине для всех трех указанных типов бактерий составили 1,25 мкг/мл. Растворитель, представляющий собой воду с 10% добавкой метанола и 3,8% добавкой Твин 80, не оказал существенного влияния ни на один из трех исследуемых микроорганизмов.

Известно также, что экстракт коры магнолии эффективен в отношении Actinobacillus actinomyecetemcomintans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Prevotellagingivalis, Veilonella disper, Capnocytophaga gingivalis, а также в отношении микроорганизмов периодонта и десневых фибробластов.

Помимо описанных выше результатов действие экстракта коры магнолии на формирование биологической пленки и ее удаление сравнивали с различными травяными и природными ингредиентами. Сравнительные исследования проводились с использованием экстракта зеленого чая, экстракта чая оолонг, лакричника и экстракта коры магнолии (Masson Magnolia Bark Extract MBE90). Указанное исследование включало в себя: определение растворимости в воде, этаноле, смеси вода: этанол и других растворителях (например, твина в воде); MIC для роста S. mutans, MIC для формирования биологической пленки S. mutans в пластинах с 96 ячейками; а также эффект от прикрепления биологической пленки S. mutans.

Экстракт зеленого чая растворялся в воде; все другие вещества, как было обнаружено, растворяются в смеси вода: этанол = 2:1. Экстракт коры магнолии также был растворим в 0,01 мкл 50% раствора Твин 80 в воде.

Для дальнейшей оценки влияния на формирование биологической пленки S. mutans использовались микротитровальные пластины с 96 ячейками. Каждую из ячеек, содержащую S. mutans (5×106 КОЕ/мл), периодически разбавляли исследуемыми соединениями и питательной средой (BHI с 5% сахарозой). Контрольные образцы включали питательную среду, но не содержали исследуемых соединений. Все пластины инкубировали в течение 48 ч при 37°С в аэробных условиях, рост оценивали спустя 48 ч спектрофотометрически (660 нм). После этого супернатант, содержащий неприкрепленные клетки, удалили из каждой ячейки методом аспирации, а массу прикрепившейся биологической пленки растворили в 200 мкл 1 N NaOH. Оптическую плотность измеряли при 660 нм, используя для этого считывающее устройство для микротитровальных пластин. В качестве положительного эталона применяли хлоргексидин (40 мг/мл).

Для дальнейшей оценки влияния на прикрепление биологической пленки S. mutans использовались стерильные микротитровальные пластины с 96 ячейками, в каждую из которых был инокулирован S. mutans (5×106 КОЕ/мл). Добавили питательную среду (бульон экстракта мозг-сердце, BHI с 5% сахарозой), в целях формирования биологической пленки провели инкубирование в течение 48 ч при 37°С в аэробных условиях. Спустя 48 ч неприкрепленный супернатант подвергли аспирации, а потом периодически разбавляли. К полученной сформировавшейся биологической пленке добавили исследуемые соединения и провели инкубирование в течение 48 ч при 37°С в аэробных условиях. Спустя 30 мин супернатант аспирировали из ячеек, а оставшуюся биологическую пленку растворили в 200 мкл 1 N NaOH. Количественную оценку провели спектрофотометрически при 660 нм, используя для этого считывающее устройство для микротитровальных пластин. В качестве положительного эталона применяли хлоргексидин. Если под действием исследуемых соединений произошло прикрепление биологической пленки, то спектрофотометрическое поглощение или оптическая плотность (OD) должны продемонстрировать снижение по сравнению с необработанными контрольными образцами.

Ниже в таблице 1 приведены результаты сравнительного анализа в виде значений мкг/мл для каждого из соединений. В указанной таблице 1, а также и в следующих таблицах экстракт коры магнолии обозначен МВЕ, а хлоргексидин, используемый в качестве положительного эталона, обозначен СНХ.

Таблица 1
Сравнительное действие на MIC и биопленку, мкг/мл
Эталон Зеленыйчай Оолонг чай Лакричник МВЕ СНХ
Рост MIC 250 1000 250 7,8 2,5
MIC, формирование биопленки 250 250 250 7,8 2,5
MIC, отделение биопленки >1000 >1000 >10000 >1000 >10

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что ни одно из исследуемых соединений не было более эффективным по удалению образовавшейся биологической пленки, чем хлоргексидин. Экстракт зеленого чая, экстракт лакричника и экстракт коры магнолии способны сдерживать образование биологической пленки S. mutans, ингибируя рост бактерий, поскольку величины MIC для роста и для формирования биологической пленки идентичны. Экстракт коры магнолии наиболее эффективен для сдерживания как роста, так и формирования биологической пленки, и его эффективность имеет значение в пределах аналогичного параметра для положительного эталона - хлоргексидина.

Несмотря на то что приведенный далее тест показывает сравнительное действие экстракта коры магнолии на формирование биологической пленки и на рост MIC, этот тест не способен эффективно имитировать in vivo действие состава для ухода за полостью рта (типа жевательной резинки) на возникновение из зубного налета биологической пленки. В ситуации in vivo активнодействующее вещество может воздействовать на налет в течение определенного периода времени с заданной частотой (например, по 5 минут три раза в день). Потому была проведена серия экспериментов для того, чтобы имитировать использование in vivo потенциальных активных ингредиентов. Для того чтобы осуществить указанные исследования, были приготовлены буферные композиции, составы которых приведены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2
Буферные составы слюны (стерилизованы на фильтре после приготовления)
Соединение мг/л
Хлорид аммония 233
Хлорид кальция, дигидрат 210
Хлорид магния, гексагидрат 43
Хлорид калия 1162
KH2PO4 354
Тиоцианат калия 222
Цитрат натрия 13
Бикарбонат натрия 535
Na2HPO4 375
Мочевина 173
Таблица 3
Среда, содержащая слюну с добавками (стерилизована на фильтре после приготовления)
Ингредиент Весовые %
Неразбавленная слюна 25
Буфер для слюны 45
Модифицированная среда (MEM) 20
Триптический соевый бульон 10

Была использована смешанная культуральная система с бактериями из свежесобранной стимулированной неразбавленной слюны. Для инокулирования покрытых слюной гидроксиапатитных (S-НА)дисков использовался осадок, полученный в результате центрифугирования клеток слюны. Указанные диски поместили в культуральные планшеты на 24 ячейки, и в течение 3 суток проводили инкубирование. Биологические пленки подвергались воздействию на 2 и 3 день (начиная с 18 ч), а на 4 день была проведена количественная оценка. Количество бактерий определяли по спектрофотометрическому поглощению или оптической плотности (OD) при 600 нм. Эксперимент включал в себя 5 следующих фаз: образование пелликулы, прикрепление бактерий, рост биологической пленки, обработка активнодействующими соединениями и установление численности бактерий.

В целях формирования пелликулы диски НА промывали в деионизированной воде под воздействием ультразвука, затем высушили на воздухе и обработали в автоклаве. После этого указанные диски на 2 ч поместили в планшет на 24 ячейки с 1 мл 50% стерильной слюны (1 часть стерильной неразбавленной слюны: 1 часть буфера для слюны, стерилизован на фильтре после приготовления), процесс проводили при медленном перемешивании при комнатной температуре. Осуществили засасывание слюны, а потом диски перенесли в чистые ячейки для того, чтобы произошло прикрепление бактерий.

Диски инокулировали слюнными бактериями, используя один из двух следующих методов: (1) инкубирование слюнными бактериями, суспендированными в течение 2 ч и при 37°С в 50% слюне при стандартной оптической плотности; после фазы закрепления диски переносят в питательную среду, содержащую слюну и добавки; или (2) непосредственное добавление бактерий вместе со средой и инкубирование.

Для формирования биологической пленки суспензию бактерий удалили, а диски перенесли в чистые ячейки. Добавили 1 мл питательной среды, которая содержала слюну с добавками, а планшет поместили в инкубатор для ночного инкубирования на все время эксперимента (до 72 ч).

Был приготовлен исходный раствор 1% экстракта коры магнолии в 60% этаноле. В растворе фосфатно-солевого буфера (PBS) приготовили образцы экстракта коры магнолии в концентрациях 125, 250, 500 и 1000 мкг/мл; отрицательным эталоном служил PBS, а в качестве положительного эталона использовали СНХ с концентрацией 0,12%. Эталонный раствор PBS имел состав, приведенный ниже в таблице 4.

Таблица 4
Состав фосфатно-солевого буфера
Ингредиент г/л
NaCl 8,0
KCl 0,2
Na2PO4 1,44
KH2PO4 0,24

В чистые ячейки поместили 1 мл активных и эталонных ингредиентов, и в эти ячейки на 5 мин перенесли диски. Воздействие хлоргексидином (эталоном) проводили в течение 1 мин дважды в день, имитируя стандартную процедуру полоскания рта. Воздействие активного ингредиента проводили в 8 часов утра, 12 часов дня и в 16 часов вечера. По окончании указанного времени раствор удалили, диски дважды промыли PBS, а затем перенесли в чистую среду. Для некоторых экспериментов используемой ежедневно средой был триптический соевый бульон (TBS) с добавкой в каждую ячейку 50 мкл 40% стерильного раствора сахарозы (в целях получения 2% раствора сахарозы). После воздействия в течение полдня указанную среду не заменяли.

После инкубирования в течение ночи (второй день) диски подвергли воздействию эталонных и активных соединений. На третий день описанную процедуру повторили. На четвертый день диски изъяли из среды и измерили ее рН в целях определения метаболической активности. Диски поместили в пробирки, содержащие 2,5 мл PBS, встряхивали в течение 20 с, а затем на следующие 20 с перенесли в ультразвуковую ванну. Полученную суспензию поместили в кюветы, плотность бактериальных клеток оценивали по измерениям оптической плотности (OD) при 600 нм.

Ниже в таблице 5 приведены результаты измерений рН, а также процентное снижение OD по сравнению с эталонным PBS.

Таблица 5
Измерение рН
Исследуемый образец рН
Эталон PBS 5,4
Эталон СНХ 8,8
МВЕ 125 5,2
МВЕ 250 6,0
МВЕ 500 7,1
МВЕ 1000 7,6
Таблица 6
Процентное снижение оптической плотности при 600 нм
Исследуемый образец Снижение OD, %
Эталон PBS 0
Эталон СНХ 84
МВЕ 125 ppm -2
МВЕ 250 ppm 21
МВЕ 500 ppm 53
МВЕ 1000 ppm 59

Результаты, представленные выше в таблице 5 и таблице 6, иллюстрируют четкое влияние экстракта коры магнолии на ингибирование метаболической активности биологической пленки (по определению рН среды) и на формирование биологической пленки (OD), причем это влияние зависит от дозы. Хлоргексидин обладает сильным ингибирующим действием на метаболизма зубного налета и на подавление количества клеток. Экстракт коры магнолии был менее эффективен чем хлоргексидин, однако концентрация хлоргексидина была немного выше концентрации экстракта коры магнолии.

Для того чтобы оценить действие экстракта коры магнолии в сочетании с поверхностно-активным агентом, были приготовлены натрий лаурилсульфат, 5 растворов активных ингредиентов; эти вещества использовали по методике, описанной выше. Был приготовлен эталонный раствор хлогексидина, концентрация которого, составляющая 0,1%, была немного снижена (1000 ppm). Помимо этого, были приготовлены растворы МВЕ, имеющие концентрацию 500 ppm. Натрий лаурилсульфат был добавлен к двум растворам экстракта коры магнолии, в результате получили растворы, концентрация натрий лаурилсульфата в которых составила 0,05%, а концентрация экстракта коры магнолии - 0,1%. Описанное выше тестирование было повторено для 5 растворов.

Ниже в таблице 7 приведены результаты, полученные по измерению рН; в указанной таблице натрий лаурилсульфат обозначен SLS.

Таблица 7
Измерение рН
Исследуемый образец рН
Эталон PBS 4,9
Эталон СНХ 8,8
SLS 1000 ppm 5,7
МВЕ 500 ppm 7,1
МВЕ 500 ppm/SLS 500 ppm 5,9
МВЕ 500 ppm/SLS 1000 ppm 6,2

Процентное снижение оптической плотности, наблюдаемое экспериментально, приведено ниже в таблице 8. Заметим, что данные из последней строки указанной таблицы взяты из другого эксперимента.

Таблица 8
Процентное снижение оптической плотности при 600 нм
Исследуемый образец Снижение OD, %
Эталон PBS 0
Эталон СНХ 94
SLS 1000 ppm 61
МВЕ 500 ppm 65
МВЕ 500 ppm/SLS 500 ppm 79
МВЕ 500 ppm/SLS 1000 ppm 70
МВЕ 1000 ppm/SLS 500 ppm 88

Результаты, приведенные выше в таблицах 7 и 8, показывают, что хлоргексидиновый эталон имеет самое высокое значение рН и самое низкое значение оптической плотности. На основании данных о рН (показатель метаболической активности) видно, что чистый экстракт коры магнолии в концентрации 500 ppm имеет более высокую ингибирующую активность метаболизмов, чем натрий лаурилсульфат или смеси экстракт коры магнолии/натрий лаурилсульфат. Однако данные по оптической плотности (численность бактерий) указывают на синергический эффект уменьшения биологической пленки в исследуемых растворах, содержащих экстракт коры магнолии и натрий лаурилсульфат. В частности, эти результаты показывают, что 100 ppm натрий лаурилсульфата и 500 ppm экстракта коры магнолии обладают аналогичным действием на величину зубного налета, хотя экстракт коры магнолии подавляет метаболическую в большей степени активность указанного налета. Экстракт коры магнолии с натрий лаурилсульфатом в концентрации 500 ppm снижает увеличение налета, и это снижение сравнимо с индивидуальным действием 500 ppm экстракта коры магнолии. Помимо этого, натрий лаурилсульфат в концентрации 1000 ppm был менее эффективен, чем в сочетании с 500 ppm экстракта коры магнолии. Наиболее эффективной была комбинация 1000 ppm с 500 ppm натрий луарилсульфата.

Вне связи с определенной теорией, рассматривающей активный механизм действия настоящего изобретения, возможно, что причиной парадоксального действия смесей экстракт коры магнолии/натрий лаурилсульфат, имеющих уменьшенную клеточную массу при увеличении метаболической активности, является действие натрий лаурилсульфата, допускающее более быструю проницаемость экстракта коры магнолии в биологическую пленку, в которой он обладает мгновенным действием, уничтожая микроорганизмы и/или подавляя их рост; однако, помимо этого, экстракт коры магнолии быстрее вымывается и поэтому его действенность, а также пролонгированное метаболическое действие минимизированы.

Для того чтобы определить эффективность уничтожения микроорганизмов, а также синергический эффект объединения двух или более веществ, активнодействующих по уничтожению микроорганизмов, было проведено исследование, в кот