Жидкая водная фармацевтическая композиция, содержащая полипептид фактора vii

Жидкая водная фармацевтическая композиция, содержащая полипептид фактора vii

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к жидким водным фармацевтическим композициям, содержащим полипептиды фактора VII, и к способам получения и применения таких композиций, а также к контейнерам, содержащим такие композиции, и к применению таких композиций для лечения синдрома, зависимого от фактора VII. Более конкретно, изобретение относится к жидким композициям, стабилизированным против химической и/или физической деградации.

Предшествующий уровень техники

Было идентифицировано множество факторов, вовлеченных в процесс свертывания крови, включая фактор VII (FVII), представляющий собой гликопротеин плазмы. Коагуляция инициируется образованием комплекса между тканевым фактором (TF), подвергающимся воздействию циркулирующей крови после повреждения стенки сосуда, и FVIIa, который присутствует в кровотоке в количестве, соответствующем примерно 1% общей массы белка FVII. FVII существует в плазме главным образом в виде одноцепочечного зимогена, который расщепляется FXa на его двухцепочечную активированную форму FVIIa. Рекомбинантный активированный фактор VIIa (rFVIIa) был разработан как прогемостатический агент. Введение rFVIIa обеспечивает быстрый и высокоэффективный прогемостатический ответ у гемофилических субъектов с кровотечениями, которых невозможно лечить другими продуктами факторов свертывания крови вследствие образования антител. С помощью FVIIa можно успешно лечить также кровотечение у субъектов с дефицитом фактора VII или у субъектов, имеющих нормальную систему коагуляции, но подверженных чрезмерным кровотечениям.

Желательно иметь формы для введения фактора VIIa, подходящие как для хранения, так и для доставки. Идеально, когда лекарственный продукт хранят и вводят в виде жидкости. В качестве альтернативы лекарственный продукт лиофилизируют, т.е. высушивают сублимацией, и затем растворяют, добавляя подходящий разбавитель перед тем, как он будет использоваться пациентом. Идеально, когда лекарственный продукт имеет стабильность, достаточную для хранения в течение длительного периода времени, т.е. более шести месяцев.

Решение либо сохранять готовый лекарственный препарат в виде жидкости, либо лиофилизировать его обычно основано на стабильности белкового лекарства в этих формах. На стабильность белка могут оказывать влияние, в частности, такие факторы, как ионная сила, рН, температура, повторные циклы замораживания/оттаивания и воздействие сил трения. Активный белок может быть утрачен в результате физической нестабильности, включая денатурацию и агрегирование (образование как растворимых, так и нерастворимых агрегатов), а также химической нестабильности, включая, например, гидролиз, деамидирование и окисление, которые приведены лишь в качестве примера. Для общего обзора стабильности белковых фармацевтических средств можно сослаться, например, на Manning, et al., Pharmaceutical Research 6:903-918 (1989).

Хотя возможное возникновение белковой нестабильности широко признано, невозможно предсказать конкретные проблемы нестабильности конкретного белка. Любой из видов этой нестабильности может приводить к образованию побочного белкового продукта или производного, имеющего сниженную активность, повышенную токсичность и/или повышенную иммуногенность. Действительно, осаждение белка может приводить к тромбозу, неоднородности лекарственной формы и количества, а также к засорению шприцов. Кроме того, посттрансляционные модификации, такие как, например, гамма-карбоксилирование некоторых остатков глутаминовой кислоты на N-конце и добавление боковых углеводных цепей, обеспечивают потенциальные сайты, которые могут оказаться чувствительными к модификации при хранении. Также специфически для фактора VIIa, который является сериновой протеазой, может происходить фрагментация в результате автокатализа (ферментативная деградация). Таким образом, безопасность и эффективность любой композиции белка напрямую связаны с его стабильностью. Поддержание стабильности в жидкой форме, как правило, отличается от поддержания стабильности в лиофилизированной форме из-за значительно большего потенциала молекулярного движения и, следовательно, повышенной вероятности молекулярных взаимодействий. Поддержание стабильности в концентрированной форме также отличается от упомянутой выше стабильности благодаря склонности к образованию агрегатов при повышенных концентрациях белка.

При разработке жидкой композиции учитывают многие факторы. Для достижения кратковременной, т.е. менее шести месяцев, стабильности жидкости, как правило, следует предотвращать грубые структурные изменения, такие как денатурация и агрегирование. Эти процессы описаны в литературе для целого ряда белков, и существуют многие примеры стабилизирующих агентов. Общеизвестно, что агент, эффективный для стабилизации одного белка, фактически дестабилизирует другие белки. После того как белок был стабилизирован против грубых структурных изменений, разработка жидкой композиции для достижения долговременной стабильности (например более шести месяцев) следует дополнительно стабилизировать белок от типов деградации, специфических для этого белка. Более специфические типы деградации могут включать в себя, например, изменение положения дисульфидной связи, окисление некоторых остатков, деамидирование, циклизацию. Хотя не всегда возможно точно определить конкретные виды деградации, разработаны анализы для мониторинга едва уловимых изменений, для того чтобы контролировать способность конкретных наполнителей однозначно стабилизировать интересующий белок.

Желательно, чтобы рН композиции находилось в физиологически подходящем диапазоне после инъекции/инфузии, иначе это может привести к боли и дискомфорту для пациента.

Общий обзор белковых композиций представлен, например, в Cleland et al.: The development of stable protein compositions: A closer look at protein aggregation, deamidation and oxidation, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10(4): 307-377; и Wang et ai., Parenteral compositions of proteins and peptides: Stability and stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology 1988 (Supplement), 42 (2S).

Фактор VIIa подвергается нескольким путям деградации, в особенности агрегации (димеризации), окислению и автолитическому расщеплению (укорочению пептидного скелета или "деградации тяжелой цепи"). Кроме того, может наблюдаться осаждение. Многие из этих реакций могут быть существенно замедлены удалением воды из белка. Однако разработка водной композиции для фактора VIIa имеет преимущества устранения ошибок разведения, тем самым увеличивая точность дозирования, а также упрощая применение продукта в клинике, улучшая, таким образом, соблюдение пациентом режима и схемы лечения. Идеально, когда композиции фактора VIIa должны быть стабильны в течение более 6 месяцев в широком диапазоне концентраций белка. Это дает возможность приспособиться к методам введения. Как правило, более высококонцентрированные формы позволяют вводить меньшие объемы, что весьма желательно с точки зрения пациентов. Жидкие композиции могут иметь многие преимущества над лиофилизированными продуктами, что касается легкости введения и применения.

В настоящее время единственная, имеющаяся в продаже композиция, содержащая полученный рекомбинантными методами полипептид FVII, представляет собой лиофилизированный продукт фактора FVIIa, который растворяют перед использованием; она содержит относительно низкую концентрацию фактора VIIa, например приблизительно 0,6 мг/мл. Ампула (1,2 мг) NovoSeven^® (Novo Nordisk A/S, Дания) содержит 1,2 мг рекомбинантного фактора VIIa человека, 5,84 мг NaCl, 2,94 мг CaCl₂, 2 Н₂O, 2,64 мг глицилглицина (GlyGly), 0,14 мг полисорбата 80 и 60,0 мг маннита; разводится до рН 5,5 2,0 мл воды для инъекции (WFI). После разведения белковый раствор является стабильным для применения в течение 24 часов. Таким образом, никаких жидких, готовых для применения или концентрированных продуктов фактора VII в настоящее время нет в продаже.

Соответственно, задача этого изобретения состоит в том, чтобы предложить жидкую водную фармацевтическую композицию, содержащую полипептид фактора VII, в которой снижено образование продуктов химической и/или физической деградации, таких как продукты ферментативной деградации или автокатализа.

Раскрытие изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что фактор VII или его аналоги ("полипептиды фактора VII"), будучи приготовлены в виде жидких водных фармацевтических композиций вместе с по меньшей мере одним стабилизирующим агентом (3), содержащим фрагмент -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², проявляют улучшенную стабильность и, таким образом, делают возможным длительное хранение перед фактическим применением.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения касается жидкой водной фармацевтической композиции, содержащей:

по меньшей мере 0,01 мг/мл полипептида фактора VII (1);

буферный агент (2), подходящий для поддержания рН в диапазоне от примерно 4,0 до примерно 9,0; и

по меньшей мере один стабилизирующий агент (3), содержащий фрагмент -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², где

Z¹ и Z² независимо выбраны из группы, состоящей из -О-, -S-, -NR^H- и одинарной связи, где R^H выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4-алкила, арила и арилметила, и R¹ и R² независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного C_1-6-алкила, возможно замещенного C_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, или

Z² и R² такие, как определено выше, и -C=N-Z¹-R¹ образует часть гетероциклического кольца, или

Z¹ и R¹ такие, как определено выше, и -C-NH-Z²-R² образует часть гетероциклического кольца, или

-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² образует гетероциклическое кольцо, где -Z¹-R¹-R²-Z²-представляет собой бирадикал.

Второй аспект настоящего изобретения касается способа получения жидкой водной фармацевтической композиции полипептида фактора VII, включающего стадию получения раствора полипептида фактора VII (1) в концентрации по меньшей мере 0,01 мг/мл, где раствор содержит буферный агент (2), подходящий для поддержания рН в диапазоне от примерно 4,0 до примерно 9,0; и по меньшей мере один стабилизирующий агент (3), содержащий фрагмент -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², где

Z¹ и Z² независимо выбраны из группы, состоящей из -О-, -S-, -NR^H- и одинарной связи, где R^H выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4-алкила, арила и арилметила, и R¹ и R² независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного С_1-6-алкила, возможно замещенного C_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, или

Z² и R² такие, как определено выше, и -C=N-Z¹-R¹ образует часть гетероциклического кольца, или

Z¹ и R¹ такие, как определено выше, и -C-NH-Z²-R² образует часть гетероциклического кольца, или

-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² образует гетероциклическое кольцо, где -Z¹-R¹-R²-Z²-представляет собой бирадикал.

Третий аспект настоящего изобретения касается жидкой водной фармацевтической композиции для применения в качестве лекарства.

Четвертый аспект настоящего изобретения касается применения жидкой водной фармацевтической композиции для изготовления лекарства для лечения синдрома, зависимого от фактора VII.

Пятый аспект настоящего изобретения касается способа лечения синдрома, зависимого от фактора VII, включающего введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества жидкой водной фармацевтической композиции.

Шестой аспект настоящего изобретения касается герметичного контейнера, содержащего жидкую водную фармацевтическую композицию и возможно инертный газ.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Как упомянуто выше, настоящее изобретение состоит в разработке новой стабилизированной жидкой водной фармацевтической композиции, содержащей полипептид фактора VII. Более конкретно, жидкая водная фармацевтическая композиция содержит:

по меньшей мере 0,01 мг/мл полипептида фактора VII (1);

буферный агент (2), подходящий для поддержания рН в диапазоне от примерно 4,0 до примерно 9,0; и

по меньшей мере один стабилизирующий агент (3), содержащий фрагмент -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², где

Z¹ и Z² независимо выбраны из группы, состоящей из -О-, -S-, -NR^H- и одинарной связи, где R^H выбран из группы, состоящей из водорода, С_1-4-алкила, арила и арилметила, и R¹ и R² независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного C_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, или

Z² и R² такие, как определено выше, и -C=N-Z¹-R¹ образует часть гетероциклического кольца, или

Z¹ и R¹ такие, как определено выше, и -C-NH-Z²-R² образует часть гетероциклического кольца, или

-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² образует гетероциклическое кольцо, где -Z¹-R¹-R²-Z²-представляет собой бирадикал.

Термин "C_1-6-алкил" означает ациклические и циклические насыщенные углеводородные радикалы, которые имеют 1-6 атомов углерода и могут быть линейными или разветвленными. Конкретные примеры представляют собой метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, циклопропилметил, н-пентил, изопентил, н-гексил и т.д. Аналогично, термин "С_1-4-алкил" охватывает ациклические и циклические насыщенные углеводородные остатки, которые имеют 1-4 атома углерода и могут быть линейными или разветвленными.

Аналогично, термин "С_2-6-алкенил" означает ациклические и циклические насыщенные углеводородные радикалы, которые имеют 2-6 атомов углерода и содержат одну ненасыщенную связь, которые могут быть линейными или разветвленными. Примеры С_2-6-алкенильных групп представляют собой винил, аллил, бут-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, пент-1-ен-1-ил, и гекс-1-ен-1-ил.

Термин "возможно замещенный" в связи с C_1-6-алкильными и C_2-6-алкенильными группами предназначен для обозначения того, что рассматриваемая группа может быть замещена одной или несколькими, предпочтительно одной-тремя группами, выбранными из группы, состоящей из гидрокси, C_1-6-алкокси (т.е. C_1-6-алкил-окси), С_2-6-алкенилокси, оксо (образующей кето- или альдегидную функциональную группу), арила, арилокси, арилкарбонила, гетероциклила, гетероциклилокси, гетероциклилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, галогена, где любой арил и гетероцикпил могут быть замещены, как в частности описано ниже для возможно замещенного арила и гетероциклила.

"Галоген" включает фтор, хлор, бром и иод.

Используемый в данном описании термин "арил" предназначен для обозначения полностью или частично ароматического карбоциклического кольца или кольцевой системы, таких как фенил, нафтил, 1,2,3,4-тетрагидронафтил, антрацил, фенантрацил, пиренил, бензопиренил, флуоренил и ксантенил, среди которых предпочтительным примером является фенил.

Термин "гетероциклил" предназначен для обозначения насыщенного, частично ненасыщенного, частично ароматического или полностью ароматического карбоциклического кольца или кольцевой системы, где один или более атомов углерода замещены гетероатомами, например атомами азота (=N- или -NH), серы (-S-) и/или кислорода (-O-). Примеры таких гетероциклильных групп представляют собой оксазолил, оксазолинил, оксазолидинил, изоксазолил, изоксазолинил, изоксазолидинил, оксадиазолил, оксадиазолинил, оксадиазолидинил, тиазолил, изотиазолил, пирролил, пирролинил, пирролидинил, имидазолил, имидазолинил, имидазолидинил, пиразолил, пиридинил, пиразинил, пиридазинил, пиперидинил, кумарил, фурил, хинолил, бензотиазолил, бензотриазолил, бензодиазолил, бензоксозолил, диазолил, диазолинил, диазолидинил, триазолил, триазолинил, триазолидинил, тетразол и т.д. Предпочтительные гетероциклильные группы представляют собой 5-, 6- или 7-членные моноциклические группы, такие как изоксазолил, изоксазолинил, оксадиазолил, оксадиазолинил, пирролил, пирролинил, диазолил, диазолинил, триазолил, триазолинил, имидазолил, имидазолинил и т.д.

Термин "гетероциклическое кольцо" предназначен для обозначения кольца, соответствующего тем, которые определены термином "гетероциклил".

В связи с терминами "арил", "гетероциклил" и "гетероциклическое кольцо", термин "возможно замещенный" предназначен для обозначения того, что рассматриваемая группа может быть замещена одной или несколькими, предпочтительно одной-тремя группами, выбранными из гидрокси (которая, когда присутствует в енольной системе, может быть представлена в таутомерной кетоформе), C_1-6-алкила, С_2-6-алкенила, фенила, бензила, C_1-6-алкокси, оксо (которая может быть представлена в таутомерной енольной форме), карбокси, С_1-6-алкоксикарбонила, C_1-6-алкилкарбонила, амино, моно- и ди(С_1-6-алкил)амино, дигалоген-С_1-4-алкила, тригалоген-С_1-4-алкила и галогена. Наиболее типичные примеры заместителей представляют собой гидроксил, C_1-4-алкил, фенил, бензил, C_1-4-алкокси, оксо, амино, моно- и диметиламино и галоген.

Кроме того, что R¹ и R² независимо могут быть выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного C_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, также возможно, что часть фрагмента -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² может быть частью гетероциклического кольца, тогда как другая часть фрагмента имеет значение, определенное соответственно для Z¹, Z², R¹ и R². В некоторых воплощениях изобретения группа -C=N-Z¹-R¹ может образовывать часть гетероциклического кольца, выбранного из группы, состоящей из 1,2-диазольного кольца, изоксазольного кольца, 1,2,4-триазольного кольца, и 1,2,4-оксадиазольного кольца, или группа -C-NH-Z²-R² может образовывать часть гетероциклического кольца, выбранного из группы, состоящей из 1,2-диазолинового кольца, изоксазолинового кольца, 1,2,4-триазолинового кольца и 1,2,4-оксадиазолинового кольца. Такие гетероциклические кольца могут быть замещены, как описано выше.

В некоторых воплощениях по меньшей мере один из R¹ и R² представляет собой водород, например, оба представляют собой водород. Кроме того, в другом воплощении, которое может быть объединено с воплощениями, упомянутыми выше, по меньшей мере один из Z¹ и Z² представляет собой одинарную связь, например, оба представляют собой одинарную связь. В конкретных воплощениях R¹ и R² оба представляют собой водород, и Z¹ и Z² оба представляют собой одинарную связь.

Предполагают, что фрагмент -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² является особенно важным для стабилизирующего эффекта стабилизирующего агента (3). В частности, предполагают, что фрагмент -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² имитирует аргининовую группировку субстрата для полипептида фактора VII.

В более конкретных воплощениях стабилизирующий агент (3) представляет собой по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из амидиновых соединений, содержащих фрагмент -C-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², и гуанидиновых соединений, содержащих фрагмент >N-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R².

В некоторых воплощениях стабилизирующий агент (3) представляет собой по меньшей мере одно амидиновое соединение, выбранное из группы, состоящей из бензамидинов, содержащих фрагмент -C₆H₄-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², где C₆H₄ означает возможно замещенное бензольное кольцо, из которых бензамидин (R¹ и R² представляют собой водород, и Z¹ и Z² представляют собой одинарную связь) представляет конкретное воплощение (смотри Экспериментальную часть).

В других конкретных воплощениях изобретения бензамидины содержат фрагмент >N-C₆H₄-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², где C₆H₄ означает возможно замещенное бензольное кольцо, т.е. о-аминобензамидин, м-аминобензамидин или п-аминобензамидин, из которых п-аминобензамидин является в настоящее время наиболее предпочтительным.

Кроме того, иллюстративные примеры п-аминобензамидинов представляют собой соединения, раскрытые в ЕР 1162194 А1 (Aventis), в частности, определенные в пп.1-6 формулы изобретения и в параграфах [0009]-[0052], и в ЕР 1270551 А1, в частности, в пп.1 и 2 формулы изобретения и параграфах [0010]-[0032].

В другом воплощении стабилизирующий агент (3) представляет собой по меньшей мере одно гуанидиновое соединение, выбранное из группы, состоящей из гуанидиновых соединений, содержащих фрагмент -CH₂-NH-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R². Примеры гуанидиновых соединений представляют собой соединения, выбранные из группы, состоящей из аргинина, производных аргинина и пептидов из 2-5 аминокислотных остатков, включающих по меньшей мере один остаток аргинина. Конкретным воплощением является аргинин (смотри Экспериментальную часть).

Термин "производные аргинина" предназначен для обозначения гомологов аргинина с функционапными группами на N-конце (например, N-метилированных и N-ацилированных производных аргинина (например, ацетилированных производных)), с функционалными группами на С-конце (например, С-амидированных, С-алкиламидированных и С-алкилированных производных) и их комбинаций.

Как указано выше, один ключевой фрагмент стабилизирующих агентов представляет собой -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R². Другие части стабилизирующего агента также могут быть важными, в особенности, что касается оптимизации стабилизирующего эффекта и переносимости пациентом. Как правило, стабилизирующий агент имеет формулу Y-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², где Y представляет собой органический радикал. Радикал Y выбирают таким, чтобы улучшить эффективность стабилизирующего эффекта. Кроме того, радикал Y может содержать один или более дополнительных фрагментов формулы -C(=N-Z¹-R¹)-NН-Z²-R².

Молекулярная масса стабилизирующего агента как правило составляет не более 1000 Да, например не более 500 Да.

Соединения согласно настоящему изобретению могут иметь один или более чем один асимметрический центр, и, если не указано иначе, подразумевается, что стереоизомеры (оптические изомеры) в виде выделенных, чистых или частично очищенных стереоизомеров или их рацемических смесей включены в объем данного изобретения.

Концентрация стабилизирующего агента (или агентов) (3) как правило составляет по меньшей мере 1 мкМ. Желательная (или необходимая) концентрация как правило зависит от выбранного стабилизирующего агента (или агентов), более конкретно от аффинности связывания выбранного стабилизирующего агента с полипептидом фактора VII.

В различных воплощениях стабилизирующий агент (3) присутствует в концентрации по меньшей мере 5 мкМ, по меньшей мере 10 мкМ, по меньшей мере 20 мкМ, по меньшей мере 50 мкМ, по меньшей мере 100 мкМ, по меньшей мере 150 мкМ, по меньшей мере 250 мкМ, по меньшей мере 500 мкМ, по меньшей мере 1 мМ, по меньшей мере 2 мМ, по меньшей мере 4 мМ, по меньшей мере 5 мМ, по меньшей мере 8 мМ, по меньшей мере 9 мМ, по меньшей мере 10 мМ, по меньшей мере 15 мМ, по меньшей мере 20 мМ, такой, которая находится, например, в диапазоне 1-10000 мкМ, 10-10000 мкМ, 20-10000 мкМ, 50-10000 мкМ, 10-5000 мкМ, 10-2000 мкМ, 20-5000 мкМ, 20-2000 мкМ, 50-5000 мкМ, 0,1-100 мМ, 0,1-75 мМ, 0,1-50 мМ, 0,1-10 мМ, 0,2-75 мМ, 0,2-50 мМ, 0,2-20 мМ, 0,5-75 мМ или 0,5-50 мМ.

В одном воплощении стабилизирующий агент (3) представляет собой бензамидин, и концентрация указанного агента составляет по меньшей мере 1 мМ, например, по меньшей мере 2 мМ, хотя предполагается, что замещенные бензамидины могут быть более эффективными, поэтому они могут быть добавлены в меньших концентрациях.

В одном воплощении стабилизирующий агент (3) не является бензамидином.

В одном воплощении стабилизирующий агент (3) представляет собой аргинин, и концентрация указанного агента составляет по меньшей мере 10 мМ, например, по меньшей мере 50 мМ.

В другом воплощении стабилизирующий агент (3) представляет собой п-аминобензамидин, и концентрация указанного агента составляет по меньшей мере 0,001 мМ.

В другом воплощении стабилизирующий агент (3) представляет собой S-2-[3-(4-карбамимидоилфенил)-уреидо]-N-[1-(3-метоксифенил)-этил]-ацетамид формулы

и концентрация указанного агента составляет по меньшей мере 0,001 мМ.

В другом воплощении стабилизирующий агент (3) представляет собой S-2-[3-(4-карбамимидоилфенил)-уреидо]-N-(1-фенилэтил)-ацетамид формулы

и концентрация указанного агента составляет по меньшей мере 0,001 мМ.

В другом воплощении стабилизирующий агент (3) представляет собой N-(3-бромбензил)-2-[3-(4-карбамимидоилфенил)-уреидо]-ацетамид формулы

и концентрация указанного агента составляет по меньшей мере 0,001 мМ. В различных воплощениях молярное соотношение между стабилизирующим агентом (3) и полипептидом FVII (агент (3):FVII) составляет: более 0,1, более 0,5, более 1, более 2, более 5, более 10, более 25, более 100, более 250, более 1000, более 2500 или более 5000, такое, которое находится, например, в диапазоне 0,1-10000, 0,1-5000, 0,1-2500, 0,1-1000, 0,1-250, 0,1-100, 0,1-25, 0,1-10, 0,5-10000, 0,5-5000, 0,5-2500, 0,5-1000, 0,5-250, 0,5-100, 0,5-25, 0,5-10, 1-10000, 1-5000, 1-2500, 1-1000, 1-250, 1-100; 1-25; 1-10, 10-10000, 10-5000, 10-250, 1000-10000 или 1000-5000.

Желательная концентрация как правило зависит от выбранного стабилизирующего агента (или агентов), более конкретно от аффинности связывания выбранного агента с полипептидом фактора VII.

Биологический эффект фармацевтической композиции определяется главным образом присутствием полипептида фактора VII, хотя другие активные ингредиенты могут быть включены в комбинации с полипептидом фактора VII.

Используемый в данном описании термин "полипептид фактора VII" охватывает фактор VII дикого типа (т.е. полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, раскрытую в патенте США № 4784950), а также варианты фактора VII, проявляющие по существу такую же или улучшенную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа. Термин "фактор VII" предназначен для обозначения полипептидов фактора VII в их нерасщепленной (зимогенной) форме, а также полипептидов, которые были протеолитически обработаны с получением их соответствующих биоактивнных форм, которые могут быть обозначены как фактор VIIa. Как правило, фактор VII расщепляется между остатками 152 и 153 с получением фактора VIIa. Термин "полипептид фактора VII" также охватывает полипептиды, включая варианты, в которых биологическая активность фактора VIIa была по существу модифицирована или в некоторой степени уменьшена по сравнению с активностью фактора VIIa дикого типа. Эти полипептиды включают в себя, но не ограничены ими, фактор VII или фактор VIIa, в которые были введены специфические изменения аминокислотной последовательности, которые модифицируют или нарушают биоактивность данного полипептида.

Биологическая активность фактора VIIa в свертывании крови обусловлена его способностью (1) связываться с тканевым фактором (TF) и (2) катализировать протеолитическое расщепление фактора IX или фактора Х с получением активированного фактора IX или Х (Фактора IXa или Ха соответственно).

Для целей изобретения биологическая активность полипептидов фактора VII ("биологическая активность фактора VII") может быть количественно определена путем определения способности препарата стимулировать свертывание крови (см. Анализ 4, представленный в данном описании). В этом анализе биологическая активность выражается как уменьшение времени свертывания крови относительно контрольного образца и переводится в "единицы фактора VII" путем сравнения с объединенным сывороточным стандартом человека, содержащим 1 ед./мл активности фактора VII. Альтернативно, биологическая активность фактора VIIa может быть количественно определена путем (1) определения способности фактора VIIa или полипептида, родственного фактору VII, продуцировать активированный фактор Х (фактор Ха) в системе, включающей TF, погруженный в липидную мембрану, и фактор Х (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (2) определения степени гидролиза фактора Х в водной системе ("Анализ протеолиза in vitro", смотри Анализ 2 ниже); (3) определения степени физического связывания фактора VIIa или полипептида, родственного фактору VII, с TF с использованием прибора на основе поверхностного плазменного резонанса (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); (4) определения степени гидролиза синтетического субстрата фактором VIIa и/или полипептидом, родственным фактору VII ("Анализ гидролиза in vitro", смотри Анализ 1 ниже); или (5) определения продукции тромбина in vitro в TF-независимой системе (смотри Анализ 3 ниже).

Варианты фактора VII, имеющие по существу такую же или улучшенную биологическую активность по сравнению с фактором VIIa дикого типа, охватывают варианты, которые проявляют по меньшей мере примерно 25%, например, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 75% или по меньшей мере примерно 90% специфической активности фактора VIIa, который продуцировался в таком же типе клеток, при тестировании в одном или более чем одном анализе свертывания крови (Анализ 4), анализе протеолиза (Анализ 2) или анализе связывания TF, как описано выше. Варианты фактора VII, имеющие в значительной степени сниженную биологическую активность относительно фактора VIIa дикого типа, представляют собой варианты, которые проявляют менее примерно 25%, такую как, например, менее примерно 10% или менее примерно 5% специфической активности фактора VIIa дикого типа, который продуцировался в таком же типе клеток, при тестировании в одном или более анализе свертывания крови (Анализ 4), анализе протеолиза (Анализ 2) или анализе связывания TF, как описано выше. Варианты фактора VII, имеющие по существу модифицированную биологическую активность относительно фактора VII дикого типа, включают в себя, без ограничения, варианты фактора VII, которые проявляют TF-независимую протеолитическую активность в отношении фактора X, и варианты, которые связывают TF, но не расщепляют фактор X.

Варианты фактора VII, независимо от того, проявляют они по существу такую же или лучшую биоактивность, чем фактор VII дикого типа, или наоборот проявляют по существу модифицированную или уменьшенную биоактивность относительно фактора VII дикого типа, включают в себя, без ограничения, полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности фактора VII дикого типа вставкой, делецией или заменой одной или более чем одной аминокислоты.

Не ограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющие по существу такую же биологическую активность, как и фактор VII дикого типа, включают в себя S52A-FVIIa, S60А-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); варианты FVIIa, проявляющие повышенную протеолитическую стабильность, как раскрыто в патенте США № 5580560; фактор VIIa, который был протеолитически расщеплен между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); окисленные формы фактора VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); варианты FVII, раскрытые в PCT/DK02/00189; и варианты FVII, проявляющие повышенную протеолитическую стабильность, как раскрыто в WO 02/38162 (Scripps Research Institute); варианты FVII, имеющие модифицированный Gla-домен и демонстрирующие повышенное мембранное связывание, как раскрыто в WO 99/20767 (University of Minnesota); и варианты FVII, раскрытые в WO 01/58935 (Maxygen ApS).

He ограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих повышенную биологическую активность по сравнению с FVIIa дикого типа, включают варианты FVII, раскрытые в WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, WO 03/27147, WO 03/37932; WO 02/38162 (Scripps Research Institute); и варианты FVIIa с повышенной активностью, раскрытые в JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst).

He ограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих по существу уменьшенную или модифицированную биологическую активность относительно фактора VII дикого типа, включают в себя R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990).

Примеры полипептидов фактора VII включают в себя, но не ограничены ими, фактор VII дикого типа, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, К157А-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII и S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FV1I, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, К316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII,F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII,F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII,F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FV11, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVH, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII,

F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,

F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,

F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,

F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII,

F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,

F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,

F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,

F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,

F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-фактор VII, S60A-фактор VII; Р152Е-фактор VII, S344A-фактор VII, фактор VIIa без домена Gla; и P11Q/K33E-FVII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; и FVII, имеющий замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности от 233 Тhr до 240 Asn; FVII, имеющий замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности от 304 Аrg до 329 Cys, и FVII, имеющий замены, делеции или вставки в аминокислотной последовательности Ilе 153-Аrg 223.

В некоторых воплощениях полипептид фактора VII представляет собой фактор VIIa человека (hFVIIa), предпочтительно рекомбинантно полученный фактор VIIa человека (rhVIIa).

В других воплощениях полипептид фактора VII представляет собой вариант последовательност