Ген abfb-2 penicillium funiculosum

Ген abfb-2 penicillium funiculosum

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится r гену abfB-2, выделенному из Penicillium funiculosum и полипептиду ABFB-2, кодируемому этим геном и обладающему активностью α-L-арабинофуранозидазы В.

Penicillium funiculosum представляет собой таларомицет семейства Aspergilleae. Выделение этого микроорганизма из множества органических субстратов, подверженных воздушному или водному загрязнению, указывает на то, что этот грибок обладает удивительно богатым арсеналом гидролитических ферментов. Применение этой ферментной смеси в питании животных способствует деполимеризации природных органических субстратов и позволяет улучшить их перевариваемость. Так, в заявке WO 99/57325 описывается штамм Penicillium funiculosum, обозначаемый IMI378536, который вырабатывает ферментную смесь, пригодную, в частности, для применения в питании животных. Тем не менее, такие ферментные смеси, вырабатываемые Penicillium funiculosum, охарактеризованы биохимически в недостаточной степени. В действительности, для полученных ферментационных сред охарактеризовано только ограниченное количество ферментов, таких как ксиланаза и β-глюканаза. Эти активности отражают лишь часть совокупности ферментов, присутствующих в смеси.

Соединения типа гемицеллюлоз сельскохозяйственного происхождения составляют, вслед за целлюлозой, второй по значимости резерв полисахаридов в составе растительных тканей. Эта группа характеризуется широким спектром гетерополисахаридов, основными представителями которых являются ксиланы, арабинаны, галактаны, глюканы и маннаны. Арабиноза в фурфурольной форме широко представлена среди таких гетерополисахаридов, как арабинаны и арабиноксиланы. Арабинан представляет собой полимер из остатков арабинофуранозы, соединенных связями α-1-5, который может быть замещен в положении O-2 или O-3 одним или двумя остатками арабинозы. Что же касается арабиноксиланов, α-L-арабинофуранозильные остатки соединяются с основной β-1-4-ксилопиранозильной цепью связями α-1-3 и α-1-2. Присутствие остатков арабинозы в этих боковых цепях может препятствовать ферментативному гидролизу гемицеллюлозных соединений при разного рода промышленных применениях, например, при улучшении перевариваемости кормов для животных. Ферменты, расщепляющие α-L-арабинофуранозидные связи, могут действовать синергично с ксиланазами, позволяя проходить гидролизу арабиноксиланов и арабинанов.

Таким образом, арабиназные активности (эндо-, экзоарабиназной и, в большинстве своем, α-L-арабинофуранозидазные активности) могут действенным образом, синергично с ксиланазами, вносить свой вклад в деполимеризацию гемицеллюлозных соединений. Гемицеллюлозные и пектиновые соединения могут составлять до 50% общего количества углеводов в растительном сырье и представляют собой главный источник энергии для животных. Улучшение перевариваемости этих соединений связано с уменьшением степени замещения арабинозильными остатками гемицеллюлозных соединений (Brice, R.E., Morrison, I.M. 1982, Carbohydr. Res. 101:93-100).

Ферменты, гидролизующие связи между остатками L-арабинозы, выделены из таких микроорганизмов, как бактерии и нитчатые грибы. Такие арабинозидазы в основном представлены α-L-арабинофуранозидазами (ЕС 3.2.1.55), способными гидролизовать невосстанавливающие α-L-арабинофуранозильные остатки, происходящие из L-арабиноксиланов или таких соединений, как арабинаны и арабиногалактаны.

α-L-арабинофуранозидазы (ЕС 3.2.1.55) разделены на два семейства гликозидгидролаз (GH 51 и GH 54) по сходству аминокислотной последовательности. Эти два семейства различаются по специфичности к полисахаридному субстрату. В первой группе (GH 51) представлены арабинофуранозидазы типа А, действующие только на короткие линейные структуры арабинофуранозильных олигосахаридов, имеющих α-1-5 связи. Во вторую группу входят арабинофуранозидазы типа В (GH 54), катализирующие гидролиз связей α-1-5, α-1-3 и α-1-2 боковых цепей арабинофуранозилолигосахаридов.

Арабинофуранозидазы В (ABFB) были выделены из множества бактерий, а также из нитчатых грибов. Род Aspergillus здесь представлен в наибольшей степени, однако этот фермент выделяли и из представителей родов Trichoderma, Penicillium, и Fusarium.

В WO 96/29416, WO 96/06935, и US 5,989,887 описываются гены арабинофуранозидазы Aspergillus niger.

Гилькенс и др. (Gielkens et al. - Microbiology, 145, 735-741, 1999) описали ген abfB Aspergillus nidulans.

В WO 96/29416, WO 96/06935, WO 2004/018662 и US 5,989,887 описываются гены арабинофуранозидазы Aspergillus niger. Выравнивание аминокислотных последовательностей указывает на то, что белок abfB А. niger на 50,9% идентичен белку ABFB-2 P. funiculosum. В этих патентных заявках не описано ни одной характеристики, существенной для применения полипептида в питании животных.

Описаны (Clinche et al. - J. Agric. Food Chem., 45, 2379-2383, 1997) три α-L-арабинофуранозидазы из Aspergillus terreus, потенциально применимые в виноделии.

Гены abfB Aspergillus kawachii и Aspergillus awamori были описаны Косеки и др. (Koseki et al. -J. of Bioscience and Bioengineering, vol. 96, no. 3, 232-241, 2003). Эти ферменты находят применение для сбраживания японского ликера сечу.

Описан также ген abfB нитчатого грибка Trichoderma reesei (Margolles-Clark et al. - Applied and Environmental Microbiology, 3840-3846, 1996).

Кроме того, описаны две внеклеточные α-L-арабинофуранозидазы из Fusarium oxysporum (Panagiotou et al. - Can J 10 Microbiol. 2003: 49(10):639-4).

Карвальо и др. (Carvallo et al. - Mycol. Res., 107 (4), 388-394, 2003) описывают α-L-арабинофуранозидазу В из Penicillium purpurogenum. Выравнивание аминокислотных последовательностей говорит о том, что белок abf-1 P. purpurogenum на 51,2% идентичен белку ABFB-2 Р. funiculosum. В этой статье не описано ни одной характеристики, существенной для применения этого полипептида в питании животных.

Сакамото и др. (Sakamoto ef al - FEBS Letters 560, 199-204, 2004) описывают ген abnx Penicillium chrysogenum, кодирующий фермент с арабиназной активностью, отличной, однако, от таковой ABFB.

Тем не менее, эти ферменты ABFB не обладают оптимальными свойствами, необходимыми для применения в питании животных.

В самом деле, для применения в питании животных ABFB должны обладать свойствами, совместимыми с условиями обработки, которой подвергаются корма, предназначенные для питания. В частности, активность используемых ферментов должна быть устойчива при температурах и условиях рН, при которых обрабатываются корма, и, по возможности, являться оптимальной как для приготовления кормов, так и при условиях, имеющих место в пищеварительной системе животных, поедающих эти корма.

Сверх того, эти ферменты должны обладать широким спектром действия на различные гетерополисахариды (арабинаны, арабиноксиланы и арабиногалактаны) в отношении снижения разветвленности для обеспечения эффективного улучшения перевариваемости кормов животными. Такое улучшение перевариваемости кормов позволяет повысить их питательную ценность. Таким образом, ферменты, обладающие улучшенными показателями специфичности (стереоспецифичность, энантиослективность), активности или сродства по отношению к природным субстратам (арабиноксиланам и арабинанам), представляют большой интерес в области питания животных.

Кроме того, перед гидролизом арабинофуранозильных связей строго необходимо прежде деполимеризовать сложные молекулы, такие как целлюлоза. Целлюлозолитические ферменты (целлюлазы) грибов обыкновенно содержат домен fCBD (домен связывания целлюлозы грибного типа - fungal cellulose binding domain), который играет решающую роль в деполимеризации целлюлозы.

Настоящее изобретение описывает α-L-арабинофуранозидазу В (ABFB-2) Penicillium funiculosum, подходящую для применения в питании животных, а также ген, кодирующий этот фермент. Настоящее изобретение касается также гомологов, вариантов и фрагментов ABFB-2, обладающих теми же каталитическими свойствами.

Ферменты ABFB, соответствующие настоящему изобретению, предпочтительно отличаются тем, что имеют очень кислый рН-оптимум (рН 2,6) и сохраняют 55% своей активности при рН 1,5.

Кроме того, предпочтительно фермент ABFB2 содержит домен связывания целлюлозы грибного типа (fCBD). Домен такого типа описан в других ферментах, но никогда ранее не был описан для арабинофуранозидаз грибов. Функциональную активность этого домена связывания целлюлозы в составе фермента ABFB2 Penicillum funiculosum оказалось возможным проверить экспериментально. Присутствие этого домена связывания повышает сродство фермента к своему субстрату и вследствие этого позволяет улучшить деградацию нерастворимой целлюлозы.

Таким образом, благодаря своим каталитическим свойствам и своему сродству к целлюлозе ABFB-2 Penicillium funiculosum особо пригоден к применению, в частности, в питании животных.

Однако ферменты, соответствующие настоящему изобретению, имеют и другие промышленные и агропромышленные применения. Отметим, в частности, обработку фруктовых соков, производство бумаги, превращение гемицеллюлозных биомасс в топливо или химические продукты, производство алкогольных продуктов сбраживанием.

Описание последовательностей

SEQ ID No.1: Геномная последовательность гена abfB-2 Penicillium funiculosum.

SEO ID No.2: Аминокислотная последовательность полипептида ABFB-2 Penicillium funiculosum, обладающего α-L-арабинофуранозидазной активностью типа В.

SEO ID No.3: Домен fCBD ABFB-2 Penicillium funiculosum.

SEQ ID No.4: Домен низкой сложности ABFB-2 Penicillium funiculosum.

SEQ ID No.5: Домен fCBD цианомилэстеразы Penicillium funiculosum.

SEQ ID No.6: Домен fCBD эндо-1-4-D-ксиланазы Penicillium funiculosum.

SEQ ID No.7: Домен fCBD ксиланазы целлобиогидролазы Penicillium funiculosum.

SEQ ID No.8: ПЦР праймер XbaI-abfB-2.

SEQ ID No.9: ПЦР праймер HindIII-abfB-2.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к полипептиду, включающему полипептид, выбираемый из следующих полипептидов:

- полипептид SEQ ID No.2,

- полипептид, аминокислотная последовательность которого находится между положениями 28 и 400 SEQ ID No.2,

- фрагмент полипептида SEQ ID No.2, обладающий активностью α-L-арабинофуранозидазы В,

- полипептид, обладающий активностью α-L-арабинофуранозидазы В, и являющийся идентичным полипептиду SEQ ID No.2, по меньшей мере, на 80%.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему активность α-L-арабинофуранозидазы В, выбираемому из числа следующих полинуклеотидов:

- полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого находится между положениями 268 и 1470 SEQ ID No.1,

- полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого находится между положениями 349 и 1470 SEQ ID No.1,

- полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.1 формулы изобретения.

Другим объектом настоящего изобретения является полинуклеотид, обладающий последовательностью, представленной SEQ ID No.1, или последовательностью, комплементарной SEQ ID No.1.

Настоящее изобретение касается также экспрессионных кассет, в которых в направлении транскрипции расположены:

- промотор, являющийся функциональным в организме хозяина;

- полинуклеотид, соответствующий настоящему изобретению, и

- терминатор, являющийся функциональным в организме того же хозяина.

Другим объектом настоящего изобретения является вектор, содержащий полинуклеотид, соответствующий настоящему изобретению, и/или экспрессионую кассету, соответствующую настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится также к организму-хозяину, трансформированному полинуклеотидом, соответствующим настоящему изобретению, экспрессионной кассетой, соответствующей настоящему изобретению, и/или вектором, соответствующим настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения организм-хозяин выбирают среди дрожжей и нитчатых грибов.

Предпочтительно организмом-хозяином является штамм Penicillium funiculosum.

Настоящее изобретение также относится к кормовой добавке для животных, содержащей полипептид, соответствующий настоящему изобретению, организм-хозяин, соответствующий настоящему изобретению, или ферментационную среду из организма-хозяина, соответствующего настоящему изобретению.

Предпочтительно эта кормовая добавка представлена в виде жидкости или в виде порошка.

Другим аспектом настоящего изобретения является корм для животных, содержащий основу питания животных и кормовую добавку для животных, соответствующую настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится также к применению полипептида ABFB, соответствующего настоящему изобретению, или организма-хозяина, соответствующего настоящему изобретению, для производства кормовой добавки для животных или корма для животных.

Другим объектом настоящего изобретения является применение полипептида ABFB, соответствующего настоящему изобретению, или организма-хозяина, соответствующего настоящему изобретению, для гидролиза α-L-арабинофуранозильных связей в арабинофуранозилолигосахаридах.

Полипептиды

Итак, настоящее изобретение относится к полипептидам ABFB, обладающим активностью α-L-арабинофуранозы В. Предпочтительно эти полипептиды выделены из Penicillium funiculosum.

Выражение "α-L-арабинофуранозидаза В" следует понимать как α-L-арабинофуранозидазы (ЕС 3.2.1.55) типа В (GH 54), которые катализируют гидролиз связей α-1,5; α-1,3 и α-1,2 боковых цепей, содержащихся в арабинофуранозилолигосахаридных соединениях.

Полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, пригодны для применения в питании животных.

Выражение "полипептид, пригодный для применения в питании животных" следует понимать как полипептид, свойства которого таковы, что он подходит для питания животных. Характеристиками, существенными для применения в питании животных, в частности, являются рН и температура, при которых тот или иной фермент активен. В самом деле, рН в пищеварительной системе животных является кислым, и, следовательно, для сохранения активности фермента в отношении гидролиза по остаткам L-арабинозы, важно, чтобы фермент оставался активным при таком рН. Кроме того, применение в кормовой добавке или в корме для животных подразумевает обработку добавки или корма в процессе приготовления и нахождение при температуре выше температуры окружающей среды. Активность применяемых при этом ферментов должна быть устойчива к условиям обработки, в частности, к соответствующим температурным условиям.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения полипептид проявляет α-L-арабинофуранозидазную активность при кислом рН, например, менее 4,5, предпочтительно, менее 4. Кроме того, в соответствии с одним из осуществлений настоящего изобретения, оптимум α-L-арабинофуранозидазной активности у рассматриваемого полипептида лежит в области рН от 1,5 до 3,5.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения полипептид проявляет α-L-арабинофуранозидазную активность при температурах, превышающих температуру окружающей среды. Предпочтительно температурный оптимум α-L-арабинофуранозидазной активности для полипептида, соответствующего настоящему изобретению, лежит в области от 30°С до 70°С, более предпочтительно, от 40 до 60°С.

α-L-арабинофуранозидаза В штамма IMI378536 Penicillium funiculosum представлена последовательностью SEQ ID No. 2.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, являются гликозилированными. Полипептид, соответствующий SEQ ID No.2, в частности, несет участки N-гликозилирования по аминокислотому остатку 123 и аминокислотному остатку 127. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления остатки аспарагина в положениях 123 и 127 в составе полипептида, соответствующего SEQ ID No.2, являются гикозилированными.

α-L-арабинофуранозидаза В Penicillium funiculosum представляет собой фермент, секретируемый грибком во внеклеточную среду. Поэтому полипептид SEQ ID No.2 содержит сигнальный полипептид из 27 амиокислотных остатков. Объектом настоящего изобретения является и зрелый полипептид, образующийся после отщепления сигнального пептида. В частности, настоящее изобретение относится к полипептиду, аминокислотная последовательность которого находится между положением 28 и положением 400 SEQ ID No.2. В соответствии с другим вариантом осуществления сигнальный пептид полипептида SEQ ID No.2 может быть заменен гетерологичным сигнальным пептидом для экспрессии и секреции полипептида SEQ ID No.2 чужеродным организмом-хозяином.

Настоящее изобретение также относится к фрагментам полипептида SEQ ID No.2, обладающих активностью α-L-арабинофуранозидазы В.

Термин "фрагмент" полипептида обозначает полипептид, включающий часть полипептида, производным которого он является, но не весь целиком. Настоящее изобретение, таким образом, относится к полипептиду, содержащему фрагмент полипептида SEQ ID No.2 длиной 100, 200 или 300 аминокислотных остатков.

Такой фрагмент полипептида SEQ ID No.2 сохраняет α-L-арабинофуранозидазную активность. Таким образом, настоящее изобретение относится биологически активным фрагментам полипептида SEQ ID No.2. Термин "биологически активный фрагмент" обозначает фрагмент полипептида, сохраняющий функцию полипептида, от которого он происходит. Биологически активные фрагменты полипептида SEQ ID No.2, таким образом, сохраняют функцию полипептида ABFB-2 Penicillium funiculosum. Эти биологически активные фрагменты обладают активностью α-L-арабинофуранозидазы В. Фрагменты ABFB, соответствующие настоящему изобретению, предпочтительно содержат домен связывания целлюлозы. В предпочтительном варианте осуществления домен связывания целлюлозы имеет последовательность, описываемую SEQ ID No. 3. Предпочтительно такие фрагменты проявляют максимальную α-L-арабинофуранозидазную активность при рН 2,6.

Способы приготовления фрагментов полипептида, а также методики измерения α активности -L-арабинофуранозидазы В хорошо известны специалистам.

Объектом настоящего изобретения также являются полипептиды, проявляющие активность L-арабинофуранозидазы В и обладающие, по меньшей мере, 90%-ной идентичностью с полипептидом SEQ ID No.2. Предпочтительно, эти полипептиды обладают теми же свойствами и, в частности, теми же каталитическими свойствами, что и полипептиды SEQ ID No.2. Предпочтительно, такие полипептиды выделяют из других штаммов Penicillium funiculosum или других нитчатых грибов. Альтернативно, такие полипептиды могут получать, например, способами направленного мутагенеза.

Объектом настоящего изобретения являются полипептиды, имеющие, по меньшей мере, 80%, 90%, 95%, 98%, предпочтительно, по меньшей мере, 99% аминокислотных остатков, идентичных полипептиду SEQ ID No.2.

Выражение "идентичные аминокислотные остатки" следует понимать как аминокислотные остатки, неизменные в двух последовательностях. Указанные полипептиды могут иметь делецию, инсерцию или замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка по сравнению с полипептидом SEQ ID No.2.

Объектом настоящего изобретения являются также полипептиды, обнаруживающие, по меньшей мере, 90%, 95%, 98%, предпочтительно, по меньшей мере, 99% сходства с полипептидом SEQ ID No.2.

Выражение "сходство" следует понимать как степень схожести между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями. Указанные полипептиды могут иметь делецию, инсерцию или замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка по сравнению с полипептидом SEQ ID No.2. Степень сходства двух последовательностей, рассчитываемая по результатам подсчета, основывается на доле совпадений и/или консервативных замен в сличаемых последовательностях.

Способы измерения и/или установления степени идентичности и степени сходства между полипепидами известны специалистам. Например, можно пользоваться такими программами выравнивания, как Vector NTi 9.1.0; AlignX (Clustal W algorithm, Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). Предпочтительно использовать параметры, принятые по умолчанию.

Полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, выделяют или очищают из естественной для них среды. Способы получения полипептидов могут быть различными. Такими способами, в частности, являются очистка из природных источников, таких как клетки, естественно экспрессирующие упомянутые полипептиды; выработка рекомбинантных полипептидов подходящими клетками-хозяевами с последующей очисткой; получение при помощи химического синтеза или, наконец, сочетание этих различных подходов. Указанные различные способы получения хорошо знакомы специалистам. Так, полипептиды ABFB, соответствующие настоящему изобретению, могут быть выделены из Penicillium funiculosum. В другом варианте осуществления полипептиды ABFB, соответствующие настоящему изобретению, выделяют из рекомбинантных организмов-хозяев, экспрессирующих полипептид ABFB, соответствующий настоящему изобретению.

Объектом настоящего изобретения являются также гибридные белки, рекомбинантные белки или химерные белки, включающие полипептиды, соответствующие настоящему изобретению. Термин "полипептид" обозначает как белки, так и модифицированные полипептиды.

Полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, обладают активностью ABFB. Предпочтительно, полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, содержат домен связывания целлюлозы. В предпочтительном варианте осуществления домен связывания целлюлозы имеет последовательность, описываемую SEQ ID No.3. Предпочтительно, такие полипептиды проявляют максимальную α-L-арабинофуранозидазную активность при рН 2,6. Предпочтительно, такие полипептиды проявляют максимальную α-L-арабинофуранозидазную активность при 50°С.

Полинуклеотиды.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, имеющие активность α-L-арабинофуранозидазы В. Предпочтительно, эти полинуклеотиды кодируют α-L-арабинофуранозидазу В Penicillium funiculosum.

В соответствии с настоящим изобретением выражение "полинуклеотид" следует понимать как однонитевую нуклеотидную цепь или комплементарную ей цепь, которые могут представлять собою ДНК или РНК; либо двунитевую нуклеотидную цепь, которая может представлять собою комплементарную или геномную ДНК. Предпочтительно, полинуклеотиды, соответствующие настоящему изобретению, представляют собой ДНК, в частности, двунитевую ДНК. Термин "полинуклеотид" обозначает также модифицированные полинуклеотиды.

Полинуклеотиды, соответствующие настоящему изобретению, выделяют или очищают из естественной для них среды. Предпочтительно, полинуклеотиды, соответствующие настоящему изобретению, могут быть приготовлены обычными для молекулярной биологии способами, такими, как описано у Sambrook et al. Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989, - или при помощи химического синтеза.

В соответствии с первым вариантом осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, последовательность которого находится между положением 268 и положением 1470 SEQ ID No.1. Этот полинуклеотид кодирует фермент ABFB-2 Penicillium funiculosum (SEQ ID No.2).

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, последовательность которого находится между положением 349 и положением 1470 SEQ ID No.1. Этот полинуклеотид кодирует зрелый полипептид ABFB-2 Penicillium funiculosum после отщепления сигнального пептида.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, имеющим, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичность с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 268 и положением 1470 SEQ ID No.1, и/или с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 349 и положением 1470 SEQ ID No.1. Эти полинуклеотиды кодируют полипептиды, имеющие активность α-L-арабинофуранозидазы В. Предпочтительно, эти полинуклеотиды кодируют α-L-арабинофуранозидазу В Penicillium funiculosum.

Выражение "идентичные нуклеотиды" следует понимать как нуклеотиды, неизменные в двух последовательностях. Указанные полинуклеотиды могут иметь делецию, инсерцию или замену, по меньшей мере, одного нуклеотида по сравнению с эталонным полинуклеотидом.

Настоящее изобретение также относится к полипептидам, обнаруживающим, по меньшей мере, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% предпочтительно, по меньшей мере, 99% сходства с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 268 и положением 1470 SEQ ID No.1, и/или с полинуклеотидом, последовательность которого заключена между положением 349 и положением 1470 SEQ ID No.1. Эти полинуклеотиды кодируют полипептиды с активностью α-L-арабинофуранозидазы В. Предпочтительно, эти полинуклеотиды кодируют α-L-арабинофуранозидазу В Penicillium funiculosum.

Выражение "сходство" следует понимать как степень схожести между полипептидными или полинуклеотидными последовательностями. Указанные полинуклеотиды могут иметь делецию, инсерцию или замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка по сравнению с эталонным полинуклеотидом. Степень сходства двух последовательностей, рассчитываемая по результатам подсчета, основывается на доле совпадений и/или консервативных замен в сличаемых последовательностях.

Способы измерения и/или установления уровня тождественности и уровня сходства между полинуклеотидами известны специалистам. Например, можно пользоваться такими программами для выравнивания, как Vector NTi 9.1.0, AlignX (Clustal W algorithm, Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). Предпочтительно используются параметры, принятые по умолчанию.

Предпочтительно, полинуклеотиды, обнаруживающие определенную степень сходства с эталонным полинуклеотидом, сохраняют функцию эталонной последовательности. В настоящем случае полинуклеотиды кодируют полипептиды с активностью α-L-арабинофуранозидазы В.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, способным гибридизоваться избирательным образом с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 268 и положением 1470 SEQ ID No.1 и/или с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 349 и положением 1470 SEQ ID No.1. Предпочтительно, избирательную гибридизацию осуществляют в условиях средней жесткости, более предпочтительно, в условиях высокой жесткости. Эти полинуклеотиды кодируют полипептиды с активностью α-L-арабинофуранозидазы В. Предпочтительно, эти полинуклеотиды кодируют α-L-арабинофуранозидазу В Penicillium funiculosum.

Выражение "последовательности, способные гибридизоваться избирательным образом" в соответствии с настоящим изобретением следует понимать как последовательности, которые гибридизуются с эталонной последовательностью с уровнем гибридизации, значительно превышающим фоновый шум. Уровень сигнала, который возникает при взаимодействии последовательности, способной гибридизоваться селективным образом с эталонными последовательностями, обычно в 10 раз, предпочтительно, в 100 раз более интенсивен, нежели сигнал при взаимодействии других последовательностей ДНК, приводящем к образованию фонового шума. Жесткие условия гибридизации, способствующие селективной гибридизации, хорошо известны специалистам. Обыкновенно температура гибридизации и отмывки, по меньшей мере, на 5°С ниже, чем температура отжига последовательности при данной величине рН и для данной ионной силы. В типичном случае температура гибридизации составляет, по меньшей мере, 30°С для полинуклеотида длиной от 15 до 50 оснований и, по меньшей мере, 60°С для полинуклеотида длиннее 50-ти оснований. Гибридизацию осуществляют, для примера, в буфере состава: 6Х SSC, 50 мМ Tris-HCl (рН 7.5), 1 мМ ЭДТА, 0.02% поливинилпирролидона, 0.02% Ficoll, 0.02% БСА, 500 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лосося. Отмывку осуществляют, например, последовательно в мягких условиях (в буфере 2Х хлорид натрия + цитрат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия), в условиях средней жесткости (в буфере 0,5Х хлорид натрия + цитрат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия) и в жестких условиях (в буфере 0,1X хлорид натрия + цитрат натрия, 0,1% додецилсульфат натрия). Разумеется, гибридизацию могут осуществлять и другими обычными способами, хорошо знакомыми специалистам (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labratory Manual, 1989). Предпочтительно, полинуклеотиды, гибридизующиеся избирательным образом с эталонной полинуклеотидной последовательностью, сохраняют функцию исходной последовательности. В настоящем случае полинуклеотиды, гибридизующиеся избирательным образом с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 268 и положением 1470 SEQ ID No. 1 и/или с полинуклеотидом, последовательность которого находится между положением 349 и положением 1470 SEQ ID No.1, кодируют полипептиды с активностью α-L-арабинофуранозидазы В.

Вообще говоря, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам кодирующим полипептиды, соответствующие настоящему изобретению. Ввиду вырожденности генетического кода различные полинуклеотиды могут кодировать один и тот же полипептид.

Другим объектом настоящего изобретения является полинуклеотид, последовательность которого соответствует SEQ ID No.1. Полинуклеотид SEQ ID No.1 включает в себя последовательности, фланкирующие открытую рамку считывания гена abfB-2 Penicillium funiculosum. Речь, в частности, идет о промоторных и терминаторных последовательностях гена abfB-2. Ген abfB может экспрессироваться при помощи регуляторных последовательностей, гомологичных указанным и вызывающих сверхэкспрессию, в частности, у Penicillium funiculosum или у других нитчатых грибов.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения ген abfB может быть экспрессирован в различных организмах-хозяевах, таких, например, как бактерии, дрожжи и грибы. Ген abfB может быть экспрессирован в организме-хозяине под контролем промотора согласно SEQ ID No.1 настоящего изобретения либо под контролем гетерологичного промотора.

Экспрессионные кассеты

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий полипептид, соответствующий настоящему изобретению, вводят в состав экспрессионной кассеты при помощи способов клонирования, хорошо знакомых специалистам. Эта экспрессионная кассета включает в себя элементы, необходимые для транскрипции и трансляции последовательностей, кодирующих полипептиды, соответствующие настоящему изобретению.

Такая экспрессионная кассета предпочтительно включает как элементы, обеспечивающие возможность выработки полипептида клеткой-хозяином и элементы, необходимые для регуляции этой экспрессии.

Такие экспрессионные кассеты включают в направлении транскрипции:

- промотор, способный функционировать в организме хозяина;

- полинуклеотид, соответствующий настоящему изобретению;

- терминаторную последовательность, способную функционировать в организме хозяина.

В экспрессионных кассетах, соответствующих настоящему изобретению, могут использоваться промоторные последовательности любого типа. Выбор промотора будет зависеть, в частности, от организма-хозяина, выбранного для экспрессии гена, представляющего интерес. Одни промоторы обеспечивают конститутивную экспрессию, тогда как другие промоторы, наоборот, индуцибельны. Среди промоторов, способных функционировать в грибах, можно отметить, в частности, промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Aspergillus nidulans (Roberts et al., Current. Genet. 15:177-180, 1989). Среди промоторов, способных функционировать в бактериях, можно отметить, в частности, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 (Studier et al., Methods in enzymology 185:60-89, 1990). Среди промоторов, способных функционировать в дрожжах, можно отметить, в частности, промотор гена GAL 1 (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA. 88:1731-1735, 1991) или промоторы GAL4 и ADH S.cerevisiae. Все эти промоторы описаны в литературе и хорошо известны специалистам.

Для экспрессии в Penicillium funiculosum можно выбрать, например, экспрессионные кассеты, содержащие промотор гена гистона Н4 В, промотор кислой аспартилпротеазы или промотор csl13 (WO 00/68401).

В соответствии с настоящим изобретением экспрессионные кассеты могут дополнительно включать любую другую последовательность, необходимую для экспрессии полипептидов или полинуклеотидов, такую, например, как регуляторные последовательности или сигнальные последовательности, позволяющие полипептидам, выработанным в организме-хозяине, секретироваться. В частности, можно использовать любую регуляторную последовательность, позволяющую повысить уровень экспрессии кодирующей последовательности, включенную в состав экспрессионной кассеты. В соответствии с настоящим изобретением можно, в частности, использовать в сочетании с промоторной последовательностью и другие регулирующие последовательности, располагающиеся между промотором и кодирующей последовательностью, такие как активаторы транскрипции ("энхансеры").

В экспрессионных кассетах, соответствующих настоящему изобретению, можно использовать большое количество различных терминаторов, обеспечивающих завершение транскрипции и полиаденилирование мРНК. При этом можно использовать любой терминатор, способный функционировать в выбранном организме-хозяине.

Для экспрессии в Penicillium funiculosum можно выбрать, например, экспрессионные кассеты, включающие терминатор гистона Н4 В, терминатор кислой аспартилпротеазы или терминатор csl13 (WO 00/68401).

Объектом настоящего изобретения является также полинуклеотид, включающий экспрессионную кассету, соответствующую настоящему изобретению. Предпочтительно экспрессионные кассеты, соответствующие настоящему изобретению, включены в состав какого-либо вектора.

Векторы

Таким образом, настоящее изобретение относится к векторам репликации или экспрессии для трансформации организма-хозяина. Такой вектор содержит, по меньшей мере, один полинуклеотид или одну экспрессионную кассету, соответствующие настоящему изобретению. Такой вектор, в частности, может соответствовать плазмиде, космиде, бактериофагу или вирусу, в которые введен полинуклеотид или экспрессионая кассета, соответствующие настоящему изобретению. Способы создания таких векторов и вставки в них полинуклеотидов хорошо известны специалистам. Говоря в общем, можно использовать любой вектор, способный к самоподдержанию, самостоятельной репликации или распространению в клетке-хозяине для обеспечения, в частности, экспрессии полинуклеотида или полипептида. Специалист сможет выбрать подходящие векторы в зависимости от организма-хозяина, подлежащего трансформации, и в зависимости от применяемой техники трансформации.

Векторы, соответствующие настоящему изобретению, используются, в частности, для трансформации организма-хозяина с целью репликации вектора и/или экспрессии полипептида, соответствующего настоящему изобретению, в организме-хозяине.

Настоящее изобретение относится также к способу получения полипептида, соответствующего настоящему изобретению, включающему следующие этапы:

- организм-хозяин трансформируют экспрессионым вектором, содержащим экспрессионную кассету, соответствующую настоящему изобретению, и/или полинуклеотидом, соответствующим настоящему изобретению;

- выделяют полипептиды, выработанные организмом-хозяином.

Организмы-хозяева

Объектом настоящего изобретения также является способ трансформации организма-хозяина посредством введения в указанный организм-хозяин, по меньшей мере, одного полинуклеотида или одной экспрессионной кассеты, или одного вектора, соответствующих настоящему изобретению. Полинуклеотид может быть встроен в геном организма-хозяина или реплицироваться устойчивым образом в организме-хозяине. Способы трансформации организмов-хозяев хорошо известны специалистам и широко описаны в литературе.

Настоящее изобретение относится также к организму-хозяину, трансформированному полинуклеотидом, экспрессионной кассетой или вектором, соответствующим настоящему изобретению. В частном случае настоящего изобретения выражение "организм-хозяин" следует понимать как любой одно- или многоклеточный организм, низший или высший, в частности, выбираемый среди бактерий, дрожжей и грибов. Выражение "организм-хозяин" следует понимать как организм, отличный от человеческого. Дрожжи предпочтительно выбирают из числа Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisae, Yarrow/а lipolytica и Schwanniomyces occidentalis. Грибы выбирают из Aspergillus и Penicillium, предпочтительно, из Penicillium funiculosum, Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus kawachii и Trichoderma koningii. В предпочтительном варианте осуществления организмом-хозяином является штамм Penicillium funiculosum, в котором экспрессируется или сверхэкспрессируется полипептид ABFB, соответствующий настоящему изобретению.

Способы создания векторов, трансформации организмов-хозяев и экспрессии чужеродных белков в этих организмах широко описаны в литературе (Ausubel F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology Vol. 1 и 2, Greene Publishing Associates et Wiley - Interscience, 1989; T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook, Molecular Cloning A laboratory Handbook, 1982).

Кормовые добавки и корма для животных

Настоящее изо