Способ очистки антител

Способ очистки антител

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу очистки антител. Данный способ может быть, например, применен к неочищенному исходному материалу или в качестве стадии, следующей за аффинной хроматографией, для удаления оставшихся примесей и веществ, выходящих со смолы для аффинной хроматографии. Настоящее изобретение также включает набор для очистки антител.

Предшествующий уровень техники

Иммунная система состоит из большого числа независимых типов клеток, которые совокупно защищают организм от бактериальных, грибковых, вирусных инфекций, инфекций, вызываемых паразитами, и от роста опухолевых клеток. "Охранниками" иммунной системы являются макрофаги, которые постоянно блуждают по кровотоку их хозяина. На попадание в организм веществ в результате инфекции или иммунизации макрофаги отвечают поглощением "оккупантов", помеченных чужеродными молекулами, известными как антигены. Это событие, опосредованное хелперными Т-клетками, запускает сложную цепь ответов, результатом которых является стимуляция В-клеток. Эти В-клетки, в свою очередь, продуцируют белки, называемые антителами, которые связываются с чужеродным "оккупантом". В результате связывания антитела и антигена чужеродный "оккупант" метится для деструкции посредством фагоцитоза или активации системы комплемента. Существует несколько различных классов антител, известных также как иммуноглобулины, таких как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Они различаются не только по их физиологической роли, но и по их структуре. Со структурной точки зрения широко изучены IgG-антитела возможно ввиду того, что они играют основную роль в природном иммунном ответе. Поликлональные антитела получают в соответствии со стандартными способами иммунизации животного соответствующим антигеном. В ответ на это животное будет продуцировать антитела, являющиеся поликлональными. Однако для решения многих задач желательно иметь единичный клон конкретного антитела, известный как моноклональные антитела. Моноклональные антитела (mAb) продуцируются гибридными или слитыми клетками, образованными в результате слияния нормальной В-клетки, продуцирующей только единичное антитело, с аномальной опухолевой клеткой миеломы. Получающийся в результате гибрид, известный как гибридома, в наши дни используется в стандартных способах получения антител. Биологическая активность, которой обладают иммуноглобулины, в настоящее время применяется в ряде различных приложений в области диагностики, охраны здоровья и терапии людей и животных. Фактически в течение нескольких последних лет моноклональные антитела и рекомбинантные конструкции антител стали наиболее обширным классом белков, проходящих текущие исследования в рамках клинических испытаний и получающих одобрение FDA (Food and Drug Administration; Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США)) в качестве терапевтических и диагностических средств. В дополнение к разработкам систем экспрессии и стратегий производства для получения высокоочищенных антител простым и эффективным с точки зрения затрат способом необходима разработка эффективных протоколов очистки антител.

Традиционные способы выделения иммуноглобулинов основаны на избирательном обратимом осаждении белковой фракции, содержащей иммуноглобулины, при котором остальные группы белков остаются в растворе. Типичными агентами для осаждения являются этанол, полиэтиленгликоль, лиотропные соли, такие как сульфат аммония и фосфат калия, и каприловая кислота. Обычно применение таких способов осаждения приводит к получению продуктов очень низкой степени чистоты, при этом одновременно требует больших затрат времени и является трудоемким. Кроме того, добавление вызывающего осаждение агента к неочищенному материалу затрудняет использование супернатанта для других целей и создает проблему утилизации остатков, которая является особенно острой, когда речь идет о крупномасштабной очистке иммуноглобулинов.

Альтернативным способом выделения иммуноглобулинов является хроматография, которая включает в себя семейство близкородственных способов разделения. Характерной чертой, отличающей хроматографию от большинства других физических и химических способов разделения, является наличие двух взаимно несмешивающихся фаз, приведенных в контакт, причем одна фаза является неподвижной, а вторая подвижной. Смесь образцов, введенная в подвижную фазу, претерпевает ряд взаимодействий с неподвижной и подвижной фазами по мере ее переноса по системе подвижной фазой. Взаимодействия основываются на различиях в физических и химических свойствах компонентов образца. Эти различия влияют на скорость перемещения индивидуальных компонентов под влиянием подвижной фазы, движущейся через колонку, содержащую неподвижную фазу. Разделенные компоненты появляются на выходе в зависимости от возрастания силы взаимодействия с неподвижной фазой. В наименьшей степени удерживаемый компонент элюируется первым, наиболее сильно удерживаемый материал элюируется последним. Разделение достигается, когда один компонент удерживается в достаточной степени для того, чтобы предотвратить перекрытие с зоной соседнего растворенного вещества по мере того, как компоненты образца элюируются с колонки. Постоянно предпринимаются усилия для создания оптимальной неподвижной фазы для каждой конкретной цели разделения. Такая неподвижная фаза в общем случае содержит подложку или основную матрицу, к которой присоединен лиганд, содержащий функциональные группы, то есть группы, участвующие в связывании. Ссылка на каждый вид хроматографии, как правило, дается на основании используемого принципа взаимодействия, как, например, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобных взаимодействий и аффинная хроматография.

В протоколах выделения иммуноглобулинов часто используется ионообменная хроматография. При анионообменной хроматографии отрицательно заряженные боковые цепи аминокислот иммуноглобулина будут взаимодействовать с положительно заряженными лигандами хроматографической матрицы. При катионообменной хроматографии, наоборот, положительно заряженные боковые цепи аминокислот иммуноглобулина будут взаимодействовать с отрицательно заряженными лигандами хроматографической матрицы.

Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) представляет собой другой способ, описанный и используемый в протоколах выделения иммуноглобулинов. Если задачей является получение высокоочищенного иммуноглобулинового продукта, в общем случае рекомендуется объединять HIC с одной или более дополнительными стадиями очистки. При HIC, для того чтобы иммуноглобулин эффективно связывался с HIC-матрицей, необходимо добавление лиотропных солей к подвижной фазе. Связанный иммуноглобулин далее высвобождают с матрицы посредством снижения концентрации лиотропной соли. Таким образом, недостатком этой процедуры является необходимость добавления лиотропной соли к неочищенному материалу, поскольку это может создавать проблемы и в результате повышать стоимость при крупномасштабном применении. Например, добавление лиотропных солей к таким неочищенным материалам, как сыворотка, плазма и яичный желток, будет во многих случаях затруднять крупномасштабные применения, поскольку соль может препятствовать любому экономически возможному использованию отделенного от иммуноглобулинов исходного материала. Дополнительной проблемой при крупномасштабных применениях будет утилизация нескольких тысяч литров отходов.

Аффинная хроматография основывается на специфических взаимодействиях между биомолекулой-мишенью и биоспецифическим лигандом по принципу узнавания "замок-ключ". Таким образом, мишень и лиганд будут составлять аффинную пару, такую как антиген/антитело, фермент/рецептор и так далее. Хорошо известны аффинные лиганды на основе белков, таких как белок А и белок G, аффинная хроматография с использованием которых является широко распространенным способом как выделения, так и очистки антител. Хорошо известно, что хроматография с использованием белка А обеспечивает выдающуюся специфичность, в особенности в отношении моноклональных антител, и вследствие этого получение высокой степени чистоты. Основанные на применении белка А способы, используемые в сочетании со стадиями ионного обмена, гидрофобного взаимодействия, очистки на гидроксиапатите и/или гельфильтрации, стали предметом выбора многих биофармацевтических компаний в качестве способов очистки антител, смотри, например, WO 8400773 и US 5151350. Однако ввиду наличия пептидных связей в белках матрицы с белком А являются в определенной степени чувствительными к щелочам. К тому же, когда матрицы с белком А используются для очистки антител из клеточной культуральной среды, клеточные протеазы могут вызывать утечку белка А или его фрагментов.

Попытка уменьшить утечку лиганда из матриц для аффинной хроматографии представлена в WO 03/041859 (Boehringer Ingelheim Pharma KG), где предлагается предварительно обрабатывать, например, матрицы с белком А по меньшей мере одним поверхностно-активным веществом для снижения утечки лиганда. Аффинная матрица может быть обработана, например, поверхностно-активным веществом в количестве 5-15 свободных объемов. Продолжительность контакта является критичной для эффективности процесса. Например, при комнатной температуре для снижения утечки требуется продолжительность контакта по меньшей мере 16 ч.

Альтернативный подход к решению проблемы утечки лиганда из матриц для аффинной хроматографии предложен в US 4983722 (Miles Inc.), где белок А избирательно выделяют из жидкости, содержащей антитело и белок А, посредством выдерживания их с анионообменным материалом. Оба компонента адсорбируются на анионообменном материале, а затем антитела и белок А элюируют друг за другом в условиях повышения ионной силы. Иллюстративным анионообменником является диэтиламиноэтил (DEAE) Trisacryl M или DEAE Sepharose™.

WO 2004/076485 (Lonza Biologics Pic.) относится к очистке антител с использованием белка А и ионообменной хроматографии. Стадия ионного обмена включает нанесение антител, очищенных на белке А, на ионообменный материал в условиях, допускающих связывание белка А и осуществление сбора антител в проходящем потоке. Анионообменник представляет собой анионообменник на основе четвертичного амина, наиболее предпочтительно, Sepharose™ Q (Amersham Biosciences, теперь GE Healthcare).

US 5429746 (SmithKline Beecham Corp.) относится к способу, при котором антитела первоначально адсорбируют на связанной с белком А хроматографической подложке и элюируют; затем адсорбируют на катионообменной хроматографической подложке и селективно элюируют с нее; и окончательно адсорбируют на HIC-подложке и элюируют. Нанесенная на HIC-колонку смесь после аффинной и/или катионообменной хроматографии может содержать агрегаты иммуноглобулинов, неправильно изогнутые разновидности молекул, белки клетки-хозяина и остаточный материал со стадии аффинной хроматографии.

US 6498236 (Upfront Chromatography) направлен на решение конкретных проблем, вызываемых незначительной разницей в молекулярных массах у аффинных лигандов на основе белков по сравнению с иммуноглобулинами-мишенями. Так, описан способ выделения или очистки иммуноглобулинов из раствора, например супернатанта культивируемых гибридомных клеток, плазмы или сыворотки животных, который предложен в качестве альтернативы использования белка А, белка G, синтетических пептидов и других относительно высокомолекулярных лигандов. Твердофазные матрицы, использованные в этом описанном способе, определены формулой M-SP1-X-A-SP2-ACID, где М обозначает основу матрицы, SP1 обозначает спейсер, Х обозначает О, S или NH, А обозначает моно- или бициклическую, возможно замещенную ароматическую или гетероароматическую группировку, SP2 обозначает возможный спейсер и ACID обозначает кислотную группу. Утверждается, что решающее значение, будет ли матрица эффективно связывать иммуноглобулины, имеют конкретные заместители.

В US 5945520 (Burton и др.) описаны хроматографические смолы смешанного действия, которые демонстрируют гидрофобный характер при значениях рН, соответствующих связыванию, и гидрофильный и/или электростатический характер при значениях рН, соответствующих десорбции. Смола специально разработана для связывания соединения-мишени из водного раствора как при низких, так и при высоких значениях ионной силы. Таким образом, на стадии адсорбции используется HIC, в то время как десорбция основывается на отталкивании зарядов.

В US 6702943 (Johansson и др.) описан способ удаления субстанции-мишени из жидкости посредством ее адсорбции на матрице, несущей множество лигандов, содержащих анионообменные группы и имеющих гидрофобную структуру. Более конкретно, лиганды содержат ароматическое кольцо поблизости от положительно заряженных анионообменных групп. Утверждается, что включение других групп, способных участвовать в электронодонорно-электроноакцепторных взаимодействиях, может усиливать степень взаимодействия между субстанцией и адсорбентом. Утверждается, что желаемыми субстанциями являются клетки, части клеток и вещества, содержащие пептидные структуры. Емкость наполнения матрицы определяют по белкам сравнения, таким как бычий сывороточный альбумин и IgG. Описанные лиганды обозначаются как "высокосолевые лиганды" в силу их способности адсорбировать субстанции-мишени при высоких значениях концентраций соли, например 0,25 М NaCl.

Кроме того, в WO 01/38228 (Belew и др.) описан другой способ удаления отрицательно заряженной субстанции из жидкости посредством ее связывания с матрицей, содержащей анионообменные лиганды смешанной природы. Каждый лиганд содержит положительно заряженный азот и тиоэфирную связь на расстоянии 1-7 атомов от указанного заряженного азота. Аналогично сказанному выше, такие желаемые субстанции, как клетки, части клеток и вещества, содержащие пептидные структуры, адсорбируются при концентрациях солей в области 0,25 М NaCl.

Было высказано предположение, что керамический гидроксиапатит является полезным для стадии доочистки иммуноглобулинов. Более конкретно, сообщалось (Chromatography, tech note 2849; S.G. Franklin, Bio-Rad Laboratories, Inc., 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547 USA), что IgG1 можно выделить из комплекса IgG1-белок А в нефракционированной среде на керамическом гидроксиапатите СНТ (Bio-Rad). Более конкретно, гидроксиапатит (Са₁₀(PO₄)₆(ОН)₂) представляет собой форму фосфата кальция, которая, как было показано, обладает уникальными свойствами разделения. Однако также известно, что матрицы на основе гидроксиапатита имеют ряд недостатков. Например, ввиду утечки Са они нестабильны при кислых значениях рН и чувствительны к хелатирующим агентам, таким как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). К тому же было показано, что трудно осуществить разработку и масштабирование надежного и воспроизводимого способа очистки с использованием матриц на основе гидроксиапатита, например, ввиду трудности при упаковке гидроксиапатита и поддержании рабочих характеристик колонок большого размера. Наконец, существует риск изменений свойств носителя, обусловленных примесью ионов металлов и обменом ионов кальция, которые вызывают серьезную обеспокоенность у распорядительных органов.

Johansson и др. (Journal of Chromatography A, 1016 (2003) 21-33: "Preparation and characterization of prototypes for multi-modal separation media aimed for capture of negatively charged biomolecules at high salt conditions") описывают скрининг прототипов мультимодальных лигандов для захвата отрицательно заряженных белков из подвижных фаз высокой проводимости. Было обнаружено, что неароматические мультимодальные анионообменные лиганды на основе слабых ионообменных лигандов (первичных и вторичных аминов) были оптимальными для захвата белков посредством адсорбции в условиях высоких концентраций солей.

Краткое описание изобретения

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен способ отделения антител от других компонентов жидкости, который требует меньших затрат времени и меньшего количества осуществляемых стадий, чем способы предшествующего уровня техники. Это может быть достигнуто способом, при котором жидкость, содержащую антитела, приводят в контакт с мультимодальной разделительной матрицей и существенно чистые антитела извлекают в несвязанной форме. Например, если эту жидкость наносят на хроматографическую колонку, содержащую указанную матрицу, то антитела легко извлекают из проходящего потока.

Согласно другому аспекту данного изобретения предложен способ отделения антител от других компонентов жидкости с новыми специфическими особенностями по сравнению со способами предшествующего уровня техники.

Согласно следующему аспекту данного изобретения предложен способ отделения антител от других компонентов жидкости, при котором улучшена степень отделения от примесей, присутствующих в неочищенном исходном материале, таких как белки клетки-хозяина.

Дополнительные аспекты и преимущества изобретения будут очевидны из следующего далее подробного описания.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1a)-d) показана иллюстративная подборка мультимодальных анионообменных лигандов, полезных в способе по настоящему изобретению: N-бензил-N-метил-этаноламина, N,N-диметилбензиламина, 2-аминобензимидазола и тиомикамина.

На Фиг.2 показана хроматограмма, соответствующая отделению моноклональных антител на мультимодальных разделительных матрицах, содержащих N-бензил-N-метил-этаноламин, иммобилизованный на Sepharose™ 6 FF; N,N-диметилбензиламин, иммобилизованный на Sepharose™ 6 FF; и, для сравнения, на сильном анионообменнике Q Sepharose™ FF, как описано в Примере 1, приведенном ниже.

На Фиг.3а) и b) показаны хроматограммы моноклональных антител, нанесенных на разделительные матрицы, содержащие тиомикамин и 2-аминобензимидазол, иммобилизованные на Sepharose™ 6 FF с различной плотностью, как описано в Примере 3, приведенном ниже.

На Фиг.4а)-g) показаны результаты хроматографии смеси mAb1-rProtein A (рекомбинантный белок А), проведенной на прототипах.

На Фиг.5a)-h) показаны результаты аналитической эксклюзионной (гельпроникающей) хроматографии (SEC) образца, содержащего mAb1 и 1% рекомбинантного белка А, и собранных вместе фракций проходящего потока и собранных вместе фракций элюата с хроматографических разделений, показанных на Фиг.4.

На Фиг.6 показано отделение молекул моноклональных антител с использованием мультимодальной матрицы Q Phenyl Sepharose™ Fast Flow, как описано в Примере 5.

Определения

Термины "антитело" и "иммуноглобулин" используются в настоящем описании взаимозаменяемо.

Термин "разделительная матрица" используется в данном описании для обозначения материала, состоящего из подложки, с которой связаны один или более лигандов, содержащих функциональные группы.

Термин "мультимодальная" разделительная матрица относится к матрице, способной обеспечить наличие по меньшей мере двух различных, но действующих вместе сайтов, которые взаимодействуют с соединением, которое должно быть связано. Например, один из этих сайтов может давать тип взаимодействия заряд-заряд, вызывающий притяжение между лигандом и веществом, представляющим интерес. Другой сайт может давать электронодонорно-акцепторное взаимодействие и/или гидрофобные и/или гидрофильные взаимодействия. Электронодонорно-акцепторные взаимодействия включают такие взаимодействия, как образование водородных связей, π-π, катион-π, с переносом заряда, диполь-диполь, индуцированный диполь и так далее. "Мультимодальные" разделительные матрицы также известны как разделительные матрицы "смешанного типа".

Термин "поверхность" означает в данном описании все внешние поверхности и включает, в случае пористой подложки, наружные поверхности, а также поверхности пор.

Фраза "электронодонорно-акцепторные взаимодействия" означает, что электроотрицательный атом со свободной парой электронов действует в качестве донора и связывается с электрондефицитным атомом, который действует в качестве акцептора для электронной пары данного донора (см., например Karger et al., An Introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973), page 42).

Термин "анионообменная группа" означает в данном описании группу, которая заряжена положительно или может быть заряжена положительно.

Термин "элюент" используется в его обычном значении в данной области техники, то есть для обозначения буфера с подходящим значением рН и/или ионной силы для высвобождения одного или более соединений с разделительной матрицы.

Термин "стадия захвата" в контексте жидкостной хроматографии относится к начальной стадии процедуры разделения. В самом общем смысле стадия захвата включает в себя осветление, концентрирование, стабилизацию и существенную очистку от растворимых примесей. После стадии захвата может следовать промежуточная очистка, в результате которой дополнительно снижается количество оставшихся примесей, таких как белки клетки-хозяина, ДНК, вирусы, эндотоксины, питательные вещества, компоненты клеточной культуральной среды, например противовспениватели и антибиотики, и ассоциированные с продуктом примеси, такие как агрегаты, неправильно изогнутые разновидности молекул и агрегатов.

Термин "стадия доочистки" в контексте жидкостной хроматографии относится к заключительной стадии очистки, на которой удаляются следовые количества примесей и остается активный безопасный продукт. Примеси, удаленные на стадии доочистки, часто представляют собой конформационные изомеры молекулы-мишени или подозрительные просачивающиеся продукты.

Термин "Fc-связывающий белок" означает белок, способный связываться с кристаллизующейся частью (Fc) антитела и включает, например, белок А и белок G или любой их фрагмент либо слитый белок, который сохраняет указанное свойство к связыванию.

Подробное описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу отделения антител от одного или более чем одного другого соединения жидкого образца, при котором подвижную фазу, содержащую указанный жидкий образец, приводят в контакт с мультимодальной разделительной матрицей с целью адсорбции одного или более соединений-мишеней, в то время как антитела остаются в свободном состоянии в подвижной фазе, где мультимодальная разделительная матрица содержит группы первого типа, способные взаимодействовать с отрицательно заряженными сайтами соединения(ий)-мишени(ей), и группы второго типа, способные по меньшей мере к одному взаимодействию, отличному от взаимодействия заряд-заряд, с указанным(и) соединением(ми)-мишенью(ями). Настоящее изобретение также охватывает способ, где в дополнение к группам первого и второго типа добавляют группы третьего или следующего типа.

В предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют с использованием принципов жидкостной хроматографии, то есть путем пропускания подвижной фазы через хроматографическую колонку, содержащую мультимодальную разделительную матрицу. Подложка может быть в форме пористых или непористых частиц, таких как по существу сферические частицы, в форме монолита, фильтра, мембраны, поверхности, капилляров или в любой другой обычно используемой форме. В альтернативном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют с использованием принципов хроматографии в увеличенном по объему слое, то есть посредством добавления подвижной фазы к увеличенному по объему слою разделительной матрицы в форме частиц, таких как по существу сферические частицы, содержащей наполнитель с высокой плотностью. В другом альтернативном воплощении способ по настоящему изобретению осуществляют с использованием периодического процесса, при котором разделительную матрицу добавляют в сосуд, содержащий жидкий образец.

Таким образом, в способе очистки антител в соответствии с данным изобретением одно или более нежелательных соединений адсорбируют на разделительной матрице, в то время как желаемые антитела остаются в подвижной фазе, не подвергаясь адсорбции. В контексте способа по настоящему изобретению понимают, что термин соединения-"мишени" относится к соединениям, адсорбируемым на разделительной матрице. Очевидно, что природа и особенности адсорбируемых соединений будут зависеть от происхождения жидкого образца. Примерами соединений-мишеней являются клетки и клеточный дебрис; белки и пептиды; нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК; эндотоксины и вирусы.

Согласно одному воплощению настоящего изобретения предложена мультимодальная разделительная матрица в хроматографической колонке, и подвижная фаза проходит через указанную колонку под действием силы тяжести и/или с помощью насоса, при этом антитела извлекают из потока, проходящего через колонку. Преимущество способа по настоящему изобретению состоит в том, что он не требует никакого элюирования антител с колонки. Отсутствие отдельной стадии элюирования является преимуществом рассматриваемого процесса, поскольку меньшее число стадий будет приводить к протоколу более быстрой очистки и, следовательно, снижать производственные издержки. К тому же антитела являются чувствительными к некоторым условиям, которые могут повредить их изогнутую картину либо вызвать их деградацию в результате воздействия на пептидные связи в них. Даже если условия элюирования для анионообменников в общем случае не включают никаких экстремальных химических реагентов, любое видоизменение соли и рН может воздействовать на чувствительное антитело, при этом воздействие изменяется от разновидности к разновидности в зависимости от рI, распределения заряда и так далее. Следовательно, другое преимущество способа по настоящему изобретению состоит в том, что удается избежать добавления элюента и применения условий элюирования к антителам.

Как упомянуто выше, в способе по настоящему изобретению соединения-мишени, от которых желательно отделить антитела, адсорбируются на мультимодальной разделительной матрице. Для достижения наиболее подходящих условий адсорбции соединений-мишеней жидкий образец объединяют с подходящим буфером или другой жидкостью, получая подвижную фазу. Способ по настоящему изобретению преимущественно проводят в условиях, традиционных для анионообменной хроматографии, которые обычно включают адсорбцию при относительно низкой концентрации соли. Таким образом, в одном воплощении способа по настоящему изобретению проводимость подвижной фазы находится в диапазоне от 0 до 25, например от 10 до 15 мСм/см. В одном воплощении рН подвижной фазы составляет приблизительно 5-6. Специалист в этой области техники может легко подобрать условия получения антител в проходящем потоке, например путем регулирования рН или проводимости, которые будут зависеть, например, от заряда и распределения заряда очищаемых антител. Если потребуется, то могут быть введены одна или более стадий промывки до любого или между любыми из таких стадий прохода потока. Если после этого желательно высвобождение адсорбированных соединений, например, для повторного использования матрицы, то может быть осуществлено элюирование при более высокой концентрации соли, например, путем использования возрастающего градиента концентрации соли. Для элюирования адсорбированных соединений можно также, или альтернативно, сдвигать значение рН, например, путем использования понижающего рН градиента.

Как упомянуто выше, мультимодальная разделительная матрица содержит группы первого типа, которые способны взаимодействовать с отрицательно заряженными сайтами соединений-мишеней, и группы второго типа, которые способны по меньшей мере к одному взаимодействию, отличному от взаимодействия заряд-заряд, с указанными соединениями-мишенями. В этом контексте понятно, что на одно и то же соединение-мишень нацелены группы разделительной матрицы с различными типами взаимодействия, то есть каждое соединение-мишень в идеальном случае адсорбируется за счет двух или более типов взаимодействия. Мультимодальные лиганды, содержащие положительно заряженные или способные быть положительно заряженными анионообменные группы, известны в этой области техники, смотри, например, US 6702943 (Johansson et al), WO 01/38228 (Belew et al) и WO 02/053252 (Belew et al).

В одном воплощении группы первого типа, то есть анионообменные группы мультимодальной разделительной матрицы, представляют собой сильные анионообменники. В этом контексте под термином "сильные" анионообменники понимают группы, которые остаются заряженными в широком диапазоне рН. В преимущественном воплощении сильные анионообменные группы представляют собой четвертичные амины, также известные как группы Q. В альтернативном воплощении группы первого типа мультимодальной разделительной матрицы представляют собой слабые анионообменники. В этом контексте термин "слабые" анионообменники понимается как обозначающий группы, которые являются заряженными при определенных значениях рН, но могут терять заряд при изменении рН. В конкретном воплощении группы первого типа включают смесь анионообменных групп и дополнительных функциональных групп, например анионообменные и группы, образующие водородные связи. Таким образом, в этом воплощении группы первого типа могут представлять собой ТРИС (TRIS; трис(гидроксиметил)аминометан).

В одном воплощении группы второго типа мультимодальной разделительной матрицы включают ароматические группы и/или группы, образующие водородные связи. В одном воплощении указанные ароматические группы включают кольцевые системы, содержащие ароматические или гетероароматические структуры. В преимущественном воплощении группы второго типа включают фенильные группы. Альтернативно, группы второго типа могут включать смесь ароматических и неароматических гидрофобных групп, таких как алкильные группы. Таким образом, в конкретном воплощении, группы второго типа включают алкильные группы. Разделительная матрица, применяемая в соответствии с изобретением, может содержать две или более чем две функциональные группы одного и того же типа, например два или более разных типов гидрофобных групп; или два или более разных типов мультимодальных анионообменников.

Специалистам в данной области понятно, что функциональные группы разделительной матрицы, применяемой в способе по настоящему изобретению, могут быть представлены на одном и том же лиганде, в этом случае каждый лиганд является мультимодальным, или на разных лигандах, в этом случае мультимодальной является общая природа разделительной матрицы.

Так, в одном воплощении разделительная матрица содержит группы первого и второго типа, связанные с одними и теми же лигандами. Любая из групп первого и второго типа, рассмотренных выше, может быть использована в этом воплощении, например группы четвертичного амина и фенильные группы. В одном воплощении лиганды связаны с подложкой посредством своих групп первого типа, например через аминогруппы, что приводит к образованию четвертичных аминов. В одном воплощении группы первого и второго типа отделены друг от друга углеводородной цепью, содержащей 1-6, например 1-3, предпочтительно 1-2 атомов углерода. В конкретном воплощении лиганды выбраны из группы, состоящей из N-бензил-N-метил-этаноламина; N,N-диметилбензиламина; 2-аминобензимидазола; тиомикамина и Q-фенила (Q Phenyl).

В альтернативном воплощении разделительная матрица содержит группы первого и второго типа, связанные с разными лигандами. Любая из групп первого и второго типа, рассмотренных выше, может быть использована в этом воплощении, например группы четвертичного амина и фенильные группы. В этом воплощении, в случае разделительной матрицы в форме частиц, эти разные лиганды могут быть иммобилизованы на разных или на одних и тех же частицах по существу в одинаковых или разных количествах. Альтернативно или в дополнение к этому разделительная матрица в форме частиц может содержать разные виды групп первого типа или разные виды групп второго типа, иммобилизованные на разных частицах.

Мультимодальная хроматографическая матрица, применяемая в способе по настоящему изобретению, легко изготавливается специалистом в этой области. Кратко, матрица состоит из лигандов, связанных с подложкой (в этой области также известной как основа матрицы) напрямую либо опосредованно через общепринятый спейсер, обеспечивающий соответствующее расстояние между поверхностью подложки и взаимодействующими группами. Для получения высокой адсорбционной емкости подложка в предпочтительном случае является пористой, и тогда лиганды связываются с внешними поверхностями, а также с поверхностями пор. Способы иммобилизации лигандов на пористых или непористых поверхностях хорошо известны в данной области; смотри, например, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992. В одном воплощении плотность лигандов на поверхности подложки находится в диапазоне, близком к обычно используемому для традиционных ионообменных матриц. Лиганды могут быть непосредственно связаны с подложкой через линкерный элемент, образующийся в результате используемой химической реакции, или через более длинный элемент, известный как экстендер (extender), щупальце или гибкая рука; смотри, например US 6428707, включенный тем самым в данное описании посредством ссылки. Кратко, экстендер может быть в форме полимера, например гомо- или сополимера. Гидрофильные полимерные экстендеры могут иметь синтетическое происхождение, то есть быть с синтетическим каркасом, или биологическое происхождение, то есть быть биополимером с существующим в природе каркасом. Типичные синтетические полимеры выбраны из группы, состоящей из поливиниловых спиртов; полиакрил- и полиметакриламидов; и поливиниловых простых эфиров. Типичные биополимеры выбраны из группы, состоящей из полисахаридов, таких как крахмал; целлюлоза; декстран; и агароза.

Подложка может быть изготовлена из органического или неорганического материала. В одном воплощении подложка изготовлена из природного полимера, такого как перекрестно-сшитый углеводородный материал, например агароза, агар, целлюлоза, декстран, хитозан, konjac (конджак), каррагенан, геллан, альгинат и так далее. Природные полимерные подложки легко изготавливают и возможно осуществляют перекрестное сшивание в соответствии со стандартными способами, такими как обращенное суспензионное желатинирование (S. Hjertén: Biochim. Biophys. Acta 79(2), 393-398 (1964)). В особо предпочтительном воплощении подложка представляет собой вид относительно жесткой, но пористой агарозы, которая изготовлена способом, повышающим ее реологические свойства, смотри, например US 6602990 (Berg) или SE 0402322-2 (Berg и др.). В альтернативном воплощении подложка изготовлена из синтетического полимера или сополимера, такого как перекрестно-сшитые синтетические полимеры, например стирол или производные стирола, дивинилбензол, акриламиды, акрилатные сложные эфиры, метакрилатные сложные эфиры, виниловые сложные эфиры, виниламиды и так далее. Такие синтетические полимеры легко изготавливают и возможно осуществляют перекрестное сшивание в соответствии со стандартными способами, смотри, например "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R. Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988)). Природные или синтетические полимерные подложки также доступны из коммерческих источников, таких как GE Healthcare (Uppsala, Sweden), например, в форме пористых частиц. В еще одном альтернативном воплощении подложка изготовлена из неорганического полимера, такого как диоксид кремния. Неорганические пористые и непористые подложки хорошо известны в этой области и их легко изготавливают в соответствии со стандартными способами.

Подходящие размеры частиц разделительной матрицы по настоящему изобретению могут находиться в диапазоне для диаметра 5-500 мкм, таком как 10-100 мкм, например 20-80 мкм. В случае по существу сферических частиц средний размер частиц может находиться в диапазоне 5-1000 мкм, например 10-500. В конкретном воплощении средний размер частиц находится в диапазоне 10-200 мкм. Специалист в этой области техники может легко выбрать подходящие размер и пористость частиц в зависимости от способа, который будет использован. Например, для крупномасштабного процесса по экономическим причинам может быть предпочтительна более