Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота (варианты) и вакцина против блютанга крупного и мелкого рогатого скота

Способ изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота (варианты) и вакцина против блютанга крупного и мелкого рогатого скота

Реферат

Группа изобретений относится к области ветеринарии, в частности к ветеринарной вирусологии и биотехнологии.

Известен способ изготовления вакцины универсальной против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающий приготовление посевного атериала вируса блутанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделением вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта (Патент RU 2077583 С1, 20.04.1997).

Способ включает приготовление посевного материала на основе вируса блютанга одного или смеси серотипов в различных комбинациях и культуры перевиваемых клеток ВНК-21/13, инфицирование клеток вирусом, их культивирование, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию, очистку и приготовление целевого продукта с добавлением комплекса гидроокись алюминия с сапонином или масляным адъювантом.

Недостатком известного способа является его сложность, а вакцина, полученная по известному способу, имеет низкую инфекционную и иммуногенную активность.

Задачей заявленной группы изобретений является упрощение способа изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота и увеличение инфекционной и иммуногенной активности полученной вакцины.

Поставленная задача по первому варианту изготовления вакцины решается тем, что в способе изготовления вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающем приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта, согласно изобретению в качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13, инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД₅₀/клетка, а культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-3 7,5°С в течение 48-72 часов до содержания жизнеспособных клеток 7-10%, далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%, перемешивание проводят в течение 1,5-2,0 часов при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С, далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 часа при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта, антиген концентрируют до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД₅₀/см³, к антигену добавляют адъювант в конечной концентрации 40-65%.

Задача решается также тем, что в качестве адьюванта используют адъювант «ISA 50» или адъювант «ISA 70».

Поставленная задача по второму варианту изготовления вакцины решается тем, что в способе получения вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота, включающем приготовление посевного материала вируса блютанга, инфицирование посевным материалом культуры клеток животного, культивирование клеточно-вирусной суспензии, отделение вирусспецифического антигена с последующей его инактивацией и приготовлением целевого продукта, согласно изобретению в качестве культуры клеток животного используют клетки ВНК-21/13, инфицирование клеток животного проводят заражающей дозой 0,001-0,002 ТЦД₅₀/см³, а культивирование клеточно-вирусной суспензии ведут при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С в течение 48-72 часов до содержания жизнеспособных клеток 7-10%, далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5-3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель в конечной концентрации 0,02-0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7-0,8%, перемешивание осуществляют в течение 1,5-2,0 часов при pH 7,2-7,4 и температуре 36,5-37,5°С, далее реакционную смесь инкубируют 1,5-2 часа при температуре 36,5-37,5°С и центрифугируют при 8000-9000 об/мин, отделяют антиген в виде супернатанта, антиген концентрируют до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5-7,5 lg ТЦД₅₀/см³, к антигену добавляют сапонин, взятый в конечной концентрации 0,0001-0,0005%, или гидроокись алюминия, или смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятые в массовых соотношениях 1:0,000004-0,0000625, в конечной концентрации 8-25%.

Задача решается также тем, что в качестве пеногасителя используют пеногасители Пента-465П, или Пента-473П, или Пента-483П.

Известно использование пеногасителей Пента-465П (ТУ 2257-001-40245042-98), Пента-473 П (ТУ 2229-062-40245042-2004), Пента-483 П (ТУ 2257-008-40245042-99) при производстве пищевых и кормовых дрожжей, а также на сахарном производстве.

Технический результат, полученный при реализации заявленной группы изобретений, заключается в том, что впервые предложена вакцина против блютанга крупного и мелкого рогатого скота с инфекционной активностью 6,5-7,5 lg ТЦД₅₀/см³. В настоящее время известны 24 серотипа возбудителя блютанга, которые вызывают сходную клиническую картину при заражении восприимчивых животных. Авторами впервые показано, что использование серотипов вируса блютанга 1, 2, 4, 8, 9, 12 и 14 при культивировании на культуре клеток ВНК-21/13 существенно повышает инфекционную и иммуногенную активность целевого продукта, снижая вакцинальную дозу с 4,0 мл до 2,0 мл (внутримышечно для крупного рогатого скота (КРС) и с 2,0 мл до 1,0 мл (внутримышечно для мелкого рогатого скота), что позволяет решить поставленную задачу.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 9 из расчета 0,001 ТЦД₅₀/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД₅₀/см³.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-х суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют сапонин до конечной концентрации 0,0001%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 2. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 9 из расчета 0,0015 ТЦД₅₀/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8%-ным раствором соды до pH 7,3- Вирус культивируют в течение 60 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,75 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД₅₀/см³.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6-7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 7,5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 4°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к смеси добавляют сапонин до конечной концентрации 0,00035%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 3. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 9 из расчета 0,002 ТЦД₅₀/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 72 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-465П в конечной концентрации 0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH 7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД₅₀/см³.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 22 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 6°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют 10%-ный сапонин до конечной концентрации 0,0005% мг/мл, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 4. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 12 из расчета 0,001 ТЦД₅₀/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473 П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД₅₀/см³.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют гидроокись алюминия до конечной концентрации 8%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 5. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 12 из расчета 0,0015 ТЦД₅₀/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8%-ным раствором соды до pH 7,3. Вирус культивируют в течение 60 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,75 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД₅₀/см³.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6-7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 7,5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 4°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к смеси добавляют гидроокись алюминия до конечной концентрации 14%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 6. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 12 из расчета 0,002 ТЦД₅₀/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 72 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH 7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД₅₀/см³.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3 6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 22 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 6°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют гидроокись алюминия, взятого в конечной концентрации 25%. перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 7. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 14 из расчета 0,001 ТЦД₅₀/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 7%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-483П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД₅₀/см³.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,000004, взятых в конечной концентрации 8%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 8. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 14 из расчета 0,0015 ТЦД₅₀/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37°С и скорости вращения сосудов 50 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8%-ным раствором соды до pH 7,3. Вирус культивируют в течение 60 часов и до содержания жизнеспособных клеток 8,5%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-483П в конечной концентрации 0,0225% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,75%, перемешивание проводят в течение 1,75 часов при pH 7,3 и температуре 37°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8500 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,0 ТЦД₅₀/см³.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6-7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 7,5 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 4°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к смеси добавляют смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,000005125, взятых в конечной концентрации 14,25%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 9. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 14 из расчета 0,002 ТТЦД₅₀/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при температуре 37,5°С и скорости вращения сосудов 60 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 8,0%-ным раствором соды до pH 7,4. Вирус культивируют в течение 72 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 3,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-483П в конечной концентрации 0,025% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,8%, перемешивание проводят в течение 2,0 часов при pH7,4 и температуре 37,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 9000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 7,5 ТЦД₅₀/см³.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 22 мин при температуре (37±0,5)°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 3-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 10 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 6°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч к полученной смеси добавляют смесь гидроокиси алюминия и сапонина, взятых в массовых соотношениях 1:0,0000625, взятых в конечной концентрации 25%, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Пример 10. Для получения предложенной вакцины против блютанга крупного и мелкого рогатого скота суспензию клеток ВНК-21/13 при концентрации 600 тыс. клеток в 1 см питательной среды (среда Игла MEM, содержащая 3% сыворотки крови крупного рогатого скота) заражают вирусом блютанга серотип 1 из расчета 0,001 ТЦД₅₀/клетка на клетку, разливают в бутыли и культивируют в роллерной установке. Выращивание вируса проводят при pH 7,2 и температуре 36,5°С и скорости вращения сосудов 40 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,0%-ным раствором соды до pH 7,2. Вирус культивируют в течение 48 часов и до содержания жизнеспособных клеток 10%. Далее клеточно-вирусную суспензию центрифугируют при 2,5 тыс.об/мин, к супернатанту добавляют пеногаситель Пента-473П в конечной концентрации 0,02% и при постоянном перемешивании вводят в клеточно-вирусную суспензию хлороформ в конечной концентрации 0,7%, перемешивание проводят в течение 1,5 часов при pH 7,2 и температуре 36,5°С. Далее реакционную смесь центрифугируют при 8000 об/мин, отделяя антиген в виде супернатанта.

В результате был получен вируссодержащий материал из вируса блютанга с инфекционной активностью 6,5 ТЦД₅₀/см³.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ВНК-21/13, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно pH суспензии снижают до значений 6,8. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при 36,5°С в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5 ч, затем каждые 8 ч. С помощью 18%-ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄).

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ВНК-21/13. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-суточной культуры клеток ВНК-21/13 вносят по 1 мл вируса в разведении 1:8 и выдерживают 18 мин при температуре 36,5°С, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-суточную культуру клеток ВНК-21/13 и инкубируют 6 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ВНК-21/13 на третьем пассаже вируса.

Инактивированную суспензию концентрируют методом ультрафильтрации до инфекционной активности на культуре клеток ВНК-21/13 6,5 lg ТЦД₅₀/см³ и добавляют адъювант «ISA 70» в конечной концентрации 40%, тщательно перемешивают и оставляют при температуре 2°С для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч инактивированную вирусную суспензию тщательно перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят