Способ индукции дифференциации стволовых клеток в миокардиальные

Способ индукции дифференциации стволовых клеток в миокардиальные

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к селективному и эффективному способу получения кардиомиоцитов из клеток ES и других полипотентных клеток, а также к клеткам для использования в регенеративной медицине, получаемых данным способом.

Предпосылки создания изобретения

Как правило, до рождения кардиомиоциты активно делятся, формируя орган, способный к автономной пульсации, однако после рождения они утрачивают способность к делению, и, поскольку существует мало недифференцированных клеток-предшественников, кардиомиоциты, погибшие вследствие воздействия разных видов стресса, в том числе инфаркта миокарда, миокардита и т.п., не восполняются. В результате живые кардиомиоциты пытаются поддержать функцию миокарда посредством компенсаторной гипертрофии и т.п., однако если воздействие стресса продолжается и превышает допустимый предел, то оно приводит к дополнительному истощению, гибели кардиомиоцитов и к последующему ухудшению функции миокарда (то есть к сердечной недостаточности).

Сердечная недостаточность и другие типы сердечных заболеваний являются второй основной причиной смерти в Японии и имеют очень плохой прогноз: 5-летний коэффициент выживаемости пациентов с заболеваниями сердца составляет приблизительно только 50%. Следовательно, можно надеяться, что разработка высокоэффективных способов лечения сердечной недостаточности приведет к значительному снижению расходов на медицинское обслуживание и к улучшению экономических показателей медицины. Традиционно для лечения сердечной недостаточности используют препараты наперстянки, которые усиливают сократительную активность миокарда, ксантиновые препараты и другие сердечные стимуляторы, однако известно, что длительное введение этих лекарственных средств приводит к ухудшению состояния из-за чрезмерного расходования энергии в миокарде. В последнее время предпочтение отдается бета-блокаторам и ингибиторам ACE, которые уменьшают чрезмерную нагрузку на сердце вследствие стимуляции симпатической нервной системы и ренин-ангиотензинной системы, однако данные методы только позволяют устранять непосредственные симптомы, но не восстанавливают поврежденную ткань сердца. Наоборот, трансплантация сердца является кардинальным способом лечения тяжелой сердечной недостаточности, однако ее применение обычно затруднено из-за таких причин, как дефицит доноров сердца, этические проблемы, большие физические нагрузки для пациентов, высокая стоимость и т.п.

Следовательно, способы трансплантации с целью замены ослабленных или утраченных кардиомиоцитов могут быть крайне полезными для лечения сердечной недостаточности. Фактически эксперименты на животных показали, что, если незрелые кардиомиоциты, полученные от зародыша, трансплантировать в ткань сердца взрослой особи, трансплантированные клетки эффективно функционируют (см. непатентный документ 1). Однако для такого способа трудно получить достаточное количество кардиомиоцитов, и, кроме того, применение такого способа в клинической медицине также затруднено из-за этических проблем.

Поэтому в последнее время повышенное внимание уделяется индукции дифференциации стволовых клеток в кардиомиоциты и применению данных клеток для трансплантации. В настоящее время пока невозможно однозначно идентифицировать популяцию клеток-предшественников или стволовых клеток, способных продуцировать кардиомиоциты во взрослой ткани сердца, поэтому предполагается, что для указанного способа можно использовать полипотентные стволовые клетки, которые являются менее дифференцированными и могут дифференцироваться в разные клетки.

Полипотентными стволовыми клетками называют клетки, способные к неограниченной или длительной клеточной пролиферации с сохранением недифференцированного состояния в клеточной культуре in vitro, которые сохраняют нормальный кариотип и способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых слоев (эктодерм, мезодерм и эндодерм). В настоящее время известно три типа полипотентных стволовых клеток: эмбриональные стволовые клетки (клетки ES), получаемые из эмбрионов на ранней стадии развития, эмбриональные зародышевые клетки (клетки EG), получаемые из примордиальных зародышевых клеток на эмбриональной стадии, и полипотентные клетки-предшественники взрослых особей (МАРС), получаемые из костного мозга.

Давно известно, что in vitro можно индуцировать дифференциацию, в особенности клеток ES с получением кардиомиоцитов. Большую часть ранних исследований проводили с использованием мышиных клеток ES. Если клетки ES культивируют в суспензии в виде одиночных клеток (отдельных клеток, которые при диспергировании не прилипают друг к другу вследствие обработки ферментом или т.п.) в отсутствие фактора, ингибирующего дифференциацию, такого как фактор, ингибирующий лейкоз (LIF) и т.п., клетки ES прилипают друг к другу и агрегируют, образуя структуру, называемую эмбриоидные тельца (EB), подобную ранним эмбриональным структурам. Также известно, что при культивировании ES в суспензии или прилипшими на поверхности приспособлений для культивирования кардиомиоциты образуют структуры, способные к спонтанной пульсации.

Кардиомиоциты, полученные из клеток ES по описанному выше способу, имеют свойства, очень похожие на свойства незрелых кардиомиоцитов фетальных сердец (см. непатентные документы 2 и 3). Более того, на экспериментах с животными было показано, что трансплантация кардиомиоцитов, полученных из клеток ES, в ткани сердца взрослой особи дает эффективные результаты, подобные полученным при трансплантации фетального миокарда (см. патентный документ 1; непатентный документ 4).

В 1995 г. Thomson et al. впервые выделили клетки ES из приматов (см. патентный документ 2; непатентный документ 5), и регенерационная терапия с использованием кардиомиоцитов, полученных из полипотентных стволовых клеток, стала реальной. Затем они также успешно выделили клетки ES из ранних человеческих эмбрионов и получили соответствующие клеточные линии (см. непатентный документ 6). Кроме того, Gearhart et al. получили линии клеток ES из примордиальных зародышевых клеток человека (см. непатентный документ 7; патентный документ 3).

Kehat et al. (см. непатентный документ 8) и Chunhui et al. (см. патентный документ 4; непатентный документ 9) описали, что человеческие клетки ES, как и мышиные клетки ES, могут дифференцироваться в кардиомиоциты in vitro. В соответствии с указанными публикациями кардиомиоциты, полученные в результате индукции дифференциации человеческих клеток ES, не только обладают способностью к спонтанной пульсации, но также экспрессируют и продуцируют специфичные для миокарда белки, такие как тяжелые и легкие цепи миозина, альфа-актинин, тропонин I и атриальный натрийуретический пептид (ANP), а также специфичные для миокарда факторы транскрипции, такие как GATA-4, Nkx2.5, MEF-2c и т.п., а результаты микроанатомических наблюдений и электрофизиологического анализа показывают, что полученные клетки сохраняют свойства незрелых кардиомиоцитов на стадии зародыша и могут использоваться для регенерационной терапии.

Однако при использовании кардиомиоцитов, полученных из полипотентных стволовых клеток, в терапии с применением трансплантации клеток и для других целей остается одна серьезная проблема. Если EBS получают из клеток ES и EG традиционными методами, то образуются не только кардиомиоциты, но и другие типы дифференцированных клеток, такие как кровяные клетки, клетки сосудов, нервные клетки, клетки кишечника, клетки костей, хрящей и т.п. Более того, доля кардиомиоцитов в данной популяции дифференцированных клеток не так высока и составляет приблизительно только 5-20% от общего количества клеток.

Способы выделения кардиомиоцитов из смеси клеток разных видов включают в себя добавление к генам клеток ES искусственной модификации, придающей устойчивость к лекарственному средству или обеспечивающей эктопическую экспрессию, и сбор клеток, обладающих свойствами кардиомиоцитов или их предшественников. Например, путем введения генной кассеты, обеспечивающей экспрессию гена устойчивости к неомицину (G418) под контролем промотора тяжелой цепи α-миозина, Field и соавторы получили систему, в которой во время дифференциации в кардиомиоциты и экспрессии гена тяжелой цепи α-миозина выживать в среде могут только те клетки ES, в которые был добавлен G418 (см. патентный документ 1; непатентный документ 4). Было подтверждено, что 99% или больше G418-устойчивых клеток, отобранных с помощью данного способа, являются кардиомиоцитами. Однако, хотя чистота кардиомиоцитов, полученных с помощью указанного способа, является очень высокой, конечное число полученных кардиомиоцитов составляет только несколько процентов от общего числа клеток, что затрудняет получение достаточного для трансплантации количества кардиомиоцитов.

Недавно Chunhui et al. описали, что, если человеческие клетки ES обработать 5-азацитидином, процент тропонин I-положительных клеток (подходящих кардиомиоцитов) в EB увеличивается от 15% до 44% (см. непатентный документ 9), но даже в данном способе процент кардиомиоцитов в EB не превышает 50%. Более того, 5-азацитидин является деметилирующим агентом, который изменяет экспрессию генов путем удаления метильных групп, связанных с ДНК, и, поскольку он действует непосредственно на хромосомы, он не подходит для получения клеток, предназначенных для трансплантации.

Другие способы более эффективного получения кардиомиоцитов из клеток ES включают в себя, в случае мышиных клеток ES, добавление ретиноевой кислоты (см. непатентный документ 10), аскорбиновой кислоты (см. непатентный документ 11), TGF-бета, BMP-2 (см. непатентный документ 12), PDGF (см. непатентный документ 13) и динорфин В (см. непатентный документ 14), а также обработку средствами, увеличивающими количество реакционноспособных частиц кислорода (ROS) (см. непатентный документ 15) и Ca²⁺ (см. непатентный документ 16) в клетках, причем известно, что все они оказывают положительное воздействие на индукцию дифференциации кардиомиоцитов. Однако кардимиоцит-специфичная, селективная дифференциация не достигается при применении указанных способов.

Секреторные белки Noggin и Chordin вначале были идентифицированы как факторы индукции нервов в эмбрионах Xenopus (см. непатентные документы 17 и 18; патентные документы 5-8). В другом исследовании было показано, что Noggin и Chordin связываются с семейством молекул BMP (костный морфогенетический белок (bone morphogenic protein)), которые ухудшают передачу сигнала и вызывают индукцию и дифференциацию нейронов (см. непатентные документы 19-21). Фактически эксперименты, проводимые с использованием мышиных клеток ES, показали, что дифференциация нервных клеток индуцируется в клетках, постоянно экспрессирующих ген Noggin или Chordin (см. непатентный документ 22).

Если человеческие клетки ES культивируют в среде, в которую добавлен Noggin, эндогенная продукция BMP-2 снижается и состояние клеток ES в экстраэмбриональных эндодермальных клетках ухудшается так, что они остаются в недифференцированном состоянии. Кроме того, если затем клетки ES, обработанные Noggin, культивируют в условиях дифференциации нейронов, то индуцируется развитие нервных клеток (см. патентный документ 9).

В более ранних исследованиях, проводимых с использованием эмбриональных раковых клеток кур (см. непатентный документ 23), Xenopus (см. непатентный документ 24) и мышей (см. непатентный документ 25), также было показано, что семейство молекул BMP стимулирует развитие и/или дифференциацию кардиомиоцитов, а после блокады этого эффекта путем обработки Noggin развитие и/или дифференциация кардиомиоцитов подавляется.

До настоящего времени не предпринимались попытки стимулировать развитие и/или дифференциацию кардиомиоцитов с помощью Noggin, Chordin или других факторов семейства BMP, ингибирующих передачу сигнала.

Патентный документ 1: патент США № 6015671;

Патентный документ 2: патент США № 5843780;

Патентный документ 3: патент США № 6015671;

Патентный документ 4: описание международного патента 03/06950, памфлет;

Патентный документ 5: описание международного патента 94/05791, памфлет;

Патентный документ 6: патент США № 5679783;

Патентный документ 7: патент США № 5846770;

Патентный документ 8: патент США № 5986056;

Патентный документ 9: описание международного патента 01/98463, памфлет;

Непатентный документ 1: Soonpaa et al., Science 264:98, 1994;

Непатентный документ 2: Maltsev et al., Mech. Dev. 44:41, 1993;

Непатентный документ 3: Maltsev et al., Circ. Res. 75:233, 1994;

Непатентный документ 4: Klug et al., J.Clin. Invest. 98:216, 1996;

Непатентный документ 5: Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995;

Непатентный документ 6: Thomson et al., Science 282:114, 1998;

Непатентный документ 7: Shamblott et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998;

Непатентный документ 8: Kehat et al., J. Clin. Invest. 108:407, 2001;

Непатентный документ 9: Chunhui et al., Circ. Res. 91:508, 2002;

Непатентный документ 10: Wobus et al., J. Mol. Cell Cardiol. 29:1525, 1997;

Непатентный документ 11: Takahashi et al., Circulatuon 107:1912, 2003;

Непатентный документ 12: Behfar et al., FASEB J. 16:1558, 2002;

Непатентный документ 13: Sachinidis et al., Cardiovasc. Res. 58:278, 2003;

Непатентный документ 14: Ventura et al., Circ. Res. 92:623, 2003;

Непатентный документ 15: Sauer et al., FEBS Lett. 476:218, 2000;

Непатентный документ 16: Li et al., J. Cell Biol. 158:103, 2002;

Непатентный документ 17: Smith & Harland, Cell 70:829, 1992;

Непатентный документ 18: Sasai et al., Cell 79:779, 1994;

Непатентный документ 19: Re'em-Kalma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:12141, 1995;

Непатентный документ 20: Zimmerman et al., Cell 86:599, 1996;

Непатентный документ 21: Piccolo et al., Cell 86:589, 1996;

Непатентный документ 22: Gratsch & O'Shea, Dev. Biol. 245:83, 2002;

Непатентный документ 23: Schultheiss et al., Genes Dev., 11:451, 1997;

Непатентный документ 24: Sparrow et al., Mech. Dev. 71:151, 1998;

Непатентный документ 25: Monzen et al., Mol. Cell. Biol. 19:7096, 1999.

Описание изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

Целью настоящего изобретения является предоставление эффективного и селективного способа индукции дифференциации стволовых клеток в кардиомиоциты, а также кардиомиоцитов, полученных с помощью данного способа, и способа применения данных клеток в трансплантации, инъекции и других способах лечения, направленных на заболевания сердца.

Способы решения проблем

Настоящее изобретение, в основном, включает в себя:

(1) Способ индукции кардиомиоцитарной дифференциации стволовых клеток, где стволовые клетки культивируют с целью индукции дифференциации в присутствии вещества, ингибирующего сигнальный путь, опосредованный BMP.

(2) Способ по приведенному выше п.1, где культивирование стволовых клеток с целью индукции дифференциации включает в себя стадию получения эмбриоидных телец путем культивирования в суспензии с агрегацией.

(3) Способ по приведенному выше п.1, где культивирование стволовых клеток с целью индукции дифференциации включает в себя стадию совместного культивирования с питающими клетками.

(4) Способ по приведенному выше п.1, где культивирование стволовых клеток с целью индукции дифференциации включает в себя стадию культивирования в чашках на культуральном контейнере.

(5) Способ по любому из приведенных выше п.п.(1)-(4), включающий в себя стадию обработки стволовых клеток веществом, которое ингибирует сигнальный путь BMP, в течение первых нескольких дней стадии индукции дифференциации.

(6) Способ по любому из приведенных выше п.п.(1)-(4), включающий в себя стадию обработки стволовых клеток веществом, которое ингибирует сигнальный путь BMP, предшествующую дифференциации.

(7) Способ по любому из приведенных выше п.п.(1)-(4), включающий в себя стадию обработки стволовых клеток веществом, которое ингибирует сигнальный путь BMP, до стадии дифференциации и стадию обработки стволовых клеток веществом, которое ингибирует сигнальный путь BMP, в течение первых нескольких дней стадии индукции дифференциации.

(8) Способ по любому из приведенных выше п.п.(1)-(7), где вещество, которое ингибирует сигнальный путь BMP, представляет собой антагонист BMP.

(9) Способ по приведенному выше п.8, где антагонист BMP представляет собой одно или несколько средств, выбранных из группы, включающей в себя Noggin, Chordin, фетуин, фоллистатин, склеростин, DAN, Cerberus, гремлин, Dante и родственные им белки.

(10) Способ по любому из приведенных выше п.п.(1)-(9), где стволовые клетки представляют собой клетки млекопитающих, обладающие способностью к дифференциации в кардиомиоциты in vitro.

(11) Способ по приведенному выше п.10, где клетки млекопитающих, обладающие способностью к дифференциации в кардиомиоциты, представляют собой полипотентные стволовые клетки или клетки, полученные из них.

(12) Способ по приведенному выше п.11, где полипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки, клетки, обладающие свойствами эмбриональных стволовых клеток, эмбриональные зародышевые клетки или полипотентные клетки-предшественники взрослых особей.

(13) Способ по приведенному выше п.12, где полипотентные стволовые клетки представляют собой эмбриональные стволовые клетки.

(14) Способ по любому из приведенных выше п.п.(1)-(13), где стволовые клетки представляют собой человеческие клетки.

(15) Способ получения кардиомиоцитов, включающий в себя способ по любому из приведенных выше п.п.(1)-(14).

(16) Кардиомиоциты, полученные по способу любого из приведенных выше п.п.(1)-(14).

(17) Способ лечения заболеваний сердца, возникающих в результате истощения, функциональной недостаточности или гибели кардиомиоцитов, включающий в себя введение (трансплантацию) кардиомиоцитов по приведенному выше п.(16) в участок истощения, функциональной недостаточности или гибели кардиомиоцитов или вблизи данного участка.

(18) Способ скрининга веществ, пригодных для лечения заболеваний сердца, возникающих в результате истощения, функциональной недостаточности или гибели кардиомиоцитов, который включает в себя приведение в контакт тестируемого вещества и кардиомиоцитов по приведенному выше п.(16) и измерение количественных или качественных изменений клеточных функций или эффективности дифференциации клеток в кардиомиоциты.

(19) Композиция лекарственного средства или подложка для лечения заболеваний сердца, возникающих в результате истощения, функциональной недостаточности или гибели кардиомиоцитов, содержащая в качестве активного компонента кардиомиоциты по приведенному выше п.(16).

В качестве источника стволовых клеток для получения кардиомиоцитов авторы данного изобретения использовали полипотентные стволовые клетки, чаще всего клетки ES, и в результате экстенсивного изучения условий индукции дифференциации в кардиомиоциты или клетки-предшественники они обнаружили, что если на определенной, ограниченной стадии культивирования в среду добавить вещество, ингибирующее сигнальный путь BMP (костного морфогенетического белка), то популяции клеток, обладающих способностью к пульсации, которые были идентифицированы как кардиомиоциты, развиваются гораздо более селективно и эффективно, чем полученные с помощью традиционных методов, что и составило основу изобретения, также было обнаружено, что добавление избыточного количества BMP приводит к сильному снижению индукции миокардиальной дифференциации под действием вещества, ингибирующего сигнальный путь BMP, это показывает, что ингибирование сигнального пути BMP вызывает дифференциацию полипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты.

В настоящем изобретении вещество, ингибирующее сигнальный путь BMP, представляет собой вещество, которое оказывает блокирующее действие на сигнальный путь, опосредованный BMP, или является конкурентом BMP, примеры данного вещества включают в себя антагонисты BMP, семейство специфичных нейтрализующих антител против BMP, солюбилизированные молекулы рецептора BMP (относящиеся к типу рецепторов, не связанных с клеточной мембраной) и т.п. Другие примеры включают в себя генные векторы экспрессии, специфичные антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, антисмысловую РНК для связывания РНК, низкомолекулярные соединения и т.п., которые либо подавляют, либо останавливают экспрессию молекул семейства BMP или функциональных продуктов генов их рецепторов, или, иначе, подавляют или останавливают экспрессию генов, которые кодируют компоненты, препятствующие активации сигнального пути BMP.

Способные к пульсации клетки, полученные из полипотентных стволовых клеток по способу настоящего изобретения, представляют собой клетки, обладающие характеристиками "кардиомиоцитов", например, показано, что данные клетки экспрессируют гены GATA-4, TEF-1, Tbx-5, MEF2, MLC-2v и другие, специфичные для миокарда факторы транскрипции, а также белки, такие как специфичные для миокарда маркеры саркомерный миозин, тропонин I, α-актинин, ANP и т.п.

Кроме традиционно используемого способа культивирования в суспензии с получением агрегатов для индукции дифференциации полипотентных стволовых клеток настоящего изобретения можно использовать способ культивирования в висячей капле или способ совместного культивирования с питающими клетками.

При определении моментов и периодов времени, подходящих для добавления вещества, ингибирующего сигнальный путь BMP, было обнаружено, что если полипотентные стволовые клетки культивируют в виде отдельных клеток или клеточных агрегатов, состоящих из небольшого числа клеток, а дифференциацию индуцируют с помощью такого способа, как агрегационное культивирование в суспензии или совместное культивирование с питающими клетками, то более эффективные результаты получают при обработке полипотентных стволовых клеток BMP либо до дифференциации, либо в течение первых нескольких дней после начала культивирования с индукцией дифференциации, либо при объединении двух указанных методов. Также было показано, что если антагонист BMP присутствует в течение всего времени культивирования в суспензии, совместного культивирования с питающими клетками или т.п., то эффективность дифференциации полипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты сильно снижается.

То есть настоящее изобретение относится к способу индукции дифференциации полипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты, где стволовые клетки культивируют с использованием временной обработки веществом, ингибирующим сигнальный путь BMP.

В настоящем изобретении стволовые клетки, обладающие способностью к миокардиальной дифференциации, представляют собой клетки, которые могут дифференцироваться в кардиомиоциты в культуре in vitro, их примеры включают в себя полипотентные стволовые клетки, мезинхимальные стволовые клетки, клетки CMG, клетки Spoc и т.п. Полипотентные стволовые клетки представляют собой клетки, способные к неограниченной или длительной клеточной пролиферации с сохранением недифференцированного состояния в культуре in vitro, которые имеют нормальный кариотип и способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых слоев (эктодерм, мезодерм и эндодерм) в подходящих условиях, примеры данных клеток включают в себя клетки ES, ES-подобные клетки, клетки EG, MAPC и т.п.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к клеткам, которые обладают морфологическими, физиологическими и/или иммунологическими характеристиками кардиомиоцитов и которые получают из полипотентных стволовых клеток. С точки зрения физиологических и/или иммунологических свойств клетки, полученные по способу настоящего изобретения, могут экспрессировать один или несколько маркеров, специфичных для кардиомиоцитов, по которым распознаются кардиомиоциты, но это не является ограничением.

Настоящее изобретение также относится к способу скрининга с использованием клеток, полученных по способу настоящего изобретения, с целью идентификации возможных химиотерапевтических лекарственных средств или новых факторов, которые стимулируют развитие, дифференциацию, регенерацию, выживание и другие процессы, связанные с кардиомиоцитами.

Настоящее изобретение также относится к набору для индукции дифференциации полипотентных стволовых клеток в клетки, обладающие морфологическими, физиологическими и/или иммунологическими свойствами миокардиальных клеток-предшественников или кардиомиоцитов. Данный набор используют для осуществления способа настоящего изобретения.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к способу лечения заболеваний сердца с использованием клеток, полученных по способу настоящего изобретения, и к лекарственному средству для лечения заболеваний сердца, которое в качестве активного компонента содержит клетки, полученные по способу настоящего изобретения.

Указанные и другие преимущества и характеристики настоящего изобретения соответствующим образом отражены в нижеследующем подробном описании предпочтительных воплощений.

При любом осуществлении настоящего изобретения можно использовать стандартные ссылки, касающиеся традиционных методов культивирования клеток и исследований в области развития и цитологии полипотентных стволовых клеток. Данные ссылки включают в себя (Wasserman et al. Eds., Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (M.V.Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual (Hogan et al. Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994); and Embryonic Stem Cells (Turksen Ed., Humana Press, 2002). Реагенты и наборы для культивирования клеток и исследований в области развития и цитологии, упомянутых в данном описании, можно получить из коммерческих источников, в том числе Invitrogen/GIBCO, Sigma и т.п.

Эффекты данного изобретения

Миокардиальные клетки-предшественники и кардиомиоциты можно эффективно и селективно получать из стволовых клеток с помощью способа настоящего изобретения. Миокардиальные клетки (предшественники), полученные по данному способу, можно использовать для скрининга и разработки эффективных лекарственных средств для лечения заболеваний сердца, и потенциально могут использоваться для трансплантационной терапии миокарда при тяжелых сердечных заболеваниях.

Краткое описание чертежей

На фиг.1А показано влияние добавления белка Noggin (500 нг/мл) на частоту появления способных к пульсации EB, образующихся из клеток ES (EB3) при культивировании в суспензии.

На фиг.1В показано влияние добавления белка Noggin (500 нг/мл) на частоту появления способных к пульсации EB, образующихся из клеток ES (EB3) при культивировании методом висячей капли.

На фиг.2 приведена частота появления способных к пульсации EB в присутствии разных доз Noggin. EB получают из клеток ES (клеток EB3 и клеток R1) и количество способных к пульсации EB определяют на 10-й день культивирования в суспензии.

На фиг.3 показана экспрессия специфичных для миокарда маркерных генов в клетках ES, обработанных Noggin. EB (полученные из клеток EB3) собирают после 0, 5, 10 и 15 дней культивирования в суспензии и анализируют экспрессию каждого гена. TEF-1: фактор увеличения транскрипции-1, MEF-2c: повышающий мышечный фактор-2с, α-MHC: тяжелая цепь α-миозина, MLC-2v: легкая цепь миозина-2v, GAPDH: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа.

На фиг.4 приведены результаты иммунохимического окрашивания выделенных кардиомиоцитов группы EB Noggin (+) (полученных из клеток EB3) на 10 день культивирования в суспензии. a: саркомерный миозин, b: тропонин I, с: α-актинин, d: ANP.

На фиг.5 приведены результаты иммунохимического окрашивания кардиомиоцитов групп EB Noggin (+) и Noggin (-) (полученных из клеток EB3) на 10 день культивирования в суспензии. a,b: саркомерный миозин, c,d: тропонин I, e,f: α-актинин, g,h: ANP.

На фиг.6 показано ингибирующее действие BMP на индукцию кардиомиоцитов под действием Noggin.

На фиг.7А показано получение дифференцированных кардиомиоцитов методом совместного культивирования с питающими клетками. Клетки ES (R1) высевают на питающие клетки ST2 и миокардиальную дифференциацию анализируют методом иммуноцитохимического окрашивания с использованием антител против саркомерного миозина (MF20) на 8 день после высевания (n>5). При сравнении с группой Noggin (-) *p<0,01.

На фиг.7B показана частота появления миокардиальных колоний из клеток ES, обработанных Noggin, при использовании совместного культивирования с питающими клетками. Клетки ES (R1) высевают на питающие клетки ST2 и миокардиальную дифференциацию оценивают по частоте появления MF20-положительных колоний на 8 день после высевания (n>5). При сравнении с группой Noggin (-) *p<0,01.

На фиг.7С показана частота появления способных к пульсации колоний из клеток ES, обработанных Noggin, при использовании совместного культивирования с питающими клетками. Клетки ES (R1) высевают на питающие клетки ST2 и миокардиальную дифференциацию оценивают по частоте появления способных к пульсации колоний на 12 день после высевания (n>5). При сравнении с группой Noggin (-) *p<0,01.

На фиг.8 показано влияние добавления белка Chordin (500 нг/мл) на частоту появления способных к пульсации EB по сравнению с добавлением белка Noggin (500 нг/мл) при культивировании методом висячей капли. Дни культивирования считают от начала культивирования в висячей капле (n=8). При сравнении с необработанной группой (-) *p<0,01.

На фиг.9 показано влияние добавления белка Chordin (150 нг/мл) на частоту появления способных к пульсации EB из клеток ES (R1) с использованием чашки для культивирования в суспензии. С: Chordin, N: Noggin (150 нг/мл), (-): необработанные. В выражениях "А"→"В" А и В означают белок, добавляемый до и после образования EB соответственно.

На фиг.10 показано влияние добавления белков антагонистов BMP (150 нг/мл) на частоту образования способных к пульсации EB из клеток ES (R1) при использовании чашки для культивирования в суспензии.

Наилучший способ осуществления изобретения

В данном описании термин "кардиомиоциты" включает в себя предшественников клеток сердца, способные в будущем функционировать как кардиомиоциты, а также кардиомиоциты зародышей и взрослых особей на всех стадиях дифференциации; данный термин относится к клеткам, которые можно идентифицировать с помощью одного или, предпочтительно, нескольких из нижеследующих методов с использованием одного или, предпочтительно, нескольких маркеров или индексов.

Экспрессию различных маркеров, специфичных для кардиомиоцитов, детектируют с помощью традиционных биохимических или иммунохимических методов. Особых ограничений по данным методам не существует, однако предпочтительно используют иммунохимические методы, такие как иммунохимическое окрашивание или иммуноэлектрофорез. В данных способах можно использовать маркер-специфичные поликлональные антитела или моноклональные антитела, которые взаимодействуют с предшественниками клеток сердца или с кардиомиоцитами. Антитела против отдельных специфических маркеров коммерчески доступны и просты в использовании. Маркеры, специфичные для предшественников клеток сердца, включают в себя, например, тяжелую/легкую цепи миозина, α-актинин, тропонин I, ANP, GATA-4, Nkx2.5, MEF-2c и т.п.

Альтернативно, хотя используемые способы конкретно не ограничиваются, экспрессию генов маркеров, специфичных для предшественников клеток сердца или кардиомиоцитов, также можно подтвердить с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) или гибридизационного анализа, методов молекулярной биологии, которые в прошлом обычно использовались для амплификации, детекции и анализа мРНК, кодирующих маркерные белки. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие маркеры, специфичные для предшественников клеток сердца или кардиомиоцитов (такие как тяжелая/легкая цепи миозина, α-актинин, тропонин I, ANP, GATA-4, Nkx2.5 и MEF-2c), уже известны и находятся в таких общедоступных базах данных, как GenBank, а маркер-специфичные последовательности, используемые в качестве праймеров или зондов, можно легко определить.

Для подтверждения дифференциации полипотентных клеток в кардиомиоциты также можно использовать физиологические показатели. Например, подходящие показатели включают в себя спонтанную пульсацию клеток, полученных из полипотентных клеток, экспрессию различных ионных каналов и способность взаимодействовать с электрофизиологическими стимулами.

Полипотентные стволовые клетки, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают в себя клетки ES, MAPC и т.п., полученные из таких млекопитающих, как мыши, обезьяны и люди, данные клетки уже широко используются для культивирования. Конкретные примеры мышиных клеток ES включают в себя клетки EB3, клетки E14, клетки D3, клетки CCE, клетки R1, клетки 129SV, клетки J1 и т.п. Были разработаны стандартные методы получения, субкультивирования и хранения клеток ES, клеток EG и MAPC для получения таких полипотентных стволовых клеток, кроме указанных выше, можно использовать другие ссылки (Matsui et al., Cell 70:841, 1992; Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. USA 95:13726, 1998; U.S. Patent № 6090622; Jiang et al., Nature 418:41, 2002; International Patent Disclosure 01/11011).

Клетки, которые можно использовать в настоящем изобретении, не ограничиваются тремя вышеуказанными типами и включают в себя все полипотентные стволовые клетки, полученные из эмбрионов и зародышей млекопитающих, пуповинной крови млекопитающих или из тканей, крови и т.п. взрослых млекопитающих, например из органов и костного мозга взрослых особей. Конкретные примеры включают в себя стволовые клетки, полученные путем обработки клеток эпителиального влагалища корня волоса или эпидермальных клеток таким средством, как 5-азацитидин (Sharda & Zahner, International Patent Disclosure 02/051980), стволовые клетки, полученные путем обработки моноцитов антителами CR3/43 (Abuljadayel, Curr. Med. Res. Opinion 19:355, 2003), и стволовые клетки, которые имеют характеристики, подобные характеристикам клеток ES, например стволовые клетки, полученные из клеток внутреннего уха взрослой особи (Li et al., Nature Med., Advance online publication). В данном случае характеристическое подобие клеткам ES определяется с точки зрения индивидуальных цитобиологических свойств клеток ES, таких как наличие поверхностных маркеров (антигенов), специфичных для клеток ES, экспрессия генов, характерных для клеток ES, или способность продуцировать тератомы или химерных мышей.

В способах настоящего изобретения можно использовать даже клетки, которые по характеристикам отличаются от клеток ES, или клетки, отличные от полипотентных стволовых клеток, если данные клетки способны дифференцироваться in vitro в клетки, обладающие признаками кардиомиоцитов. Примеры таких клеток включают в себя мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (Bruder et al., патент США № 5736396; Pittenger et al., Science 284:143, 1999), клетки CMG (Makino et al., J. Clin. Invest. 103:697, 1999; описание международного патента 01/048151) и клетки Spoc, полученные из мышечной ткани (описание международного патента 031/035382).

Любой способ, подходящий для индукции дифференциации кардиомиоцитов, можно использовать как способ культивирования для получения кардиомиоцитов из полипотентных стволовых клеток в настоящем изобретении, в случае клеток ES примеры таких способов включают в себя культивирование в суспензии с получением агрегатов, культивирование в висячей капле, совместное культивирование с питающими клетками, культивирование с вращением, культивирование на мягком агаре, культивирование на микроносителе и т.п. Конкретным примером культивирования в суспензии с получением агрегатов является способ, включающий в себя суспендирование клеток ES в виде одиночных клеток (отдельные клетки, которые при диспергировании не прилипают друг к другу вследствие обработки ферментом или т.п.) в среде с получением плотности клеток, предпочтительно, от 10 клеток/мл до 1×10⁷ клеток/мл или, более предпочтительно, от 100 клеток/мл до 1×10⁶ клеток/мл, высевание их в чашку для культивирования и культивирование в течение 4-30 дней или, предпочтительно, 6-15 дней при 37°С в условиях продувания 5% СО₂.

В другом воплощении при использовании способа совместного культивирования с питающими клетками вид данных клеток особо не ограничивается, однако, предпочтительно, они представляют собой клетки, обладающие характеристиками мезенхимальных клеток, и, более предпочтительно, клетки, обладающие свойствами, подобными свойствам клеток стромы костного мозга, такие как клетки ST2, клетки OP9, клетки PA6 и т.п. Данные питающие клетки культивируют до получения высокой плотности и формируют из них фидер, используя такие способы, как обработка митомицином С, облучение и т.п., затем клетки ES, суспендированные в виде отдельных клеток в среде с получением плотности, составляющей от 1 клетки/мл до 1×10⁶ клеток/мл, предпочтительно, от 100 клеток/мл до 1×10⁵ клеток/мл или, более предпочтительно, от 1×10³ клеток/мл до 1×10⁴ клеток/мл, высевают на полученный фидер и