Способ оценки уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки крыс в процессе полового цикла

Способ оценки уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки крыс в процессе полового цикла

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии и гистохимии.

Покровные и железистые эпителиоциты эндометрия матки содержат гистамин (Гунин А.Г. Локализация гистамина в структурах матки. // Архив АГЭ. - 1988. - №12. - С.66-68), который занимает одно из ведущих мест в регуляции процессов жизнедеятельности организма. Он является тканевым гормоном и медиатором, стимулятором и ингибитором внутриклеточного и тканевого метаболизма (Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н. Гистамин в биохимии и физиологии. - М.: Наука, 1981). В последние годы существенно расширилось представление о важной роли гистамина в реализации репродуктивной функции женщин, в частности установлено его участие в регуляции процессов оплодотворения и имплантации (Циркин В.И., Хлыбова С.В. Роль гистамина в репродукции. // Вятский медицинский вестник. - 2006. - №3-4). Установлено, что гистамин участвует в стимулированной эстрогенами пролиферации эпителиоцитов эндометрия (Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н., 1981; Гунин А.Г. Эстроген-индуцированный гистогенез в матке при эндокринном дисбалансе. Авторефер. дис.… д-ра мед. наук. - М., 1996). Имеются данные (Zhao X. et al. Blastocyst H(2) receptor is the target for uterine histamine in implantation in the mouse // Development. - 2000. - Vol.127, №12. - P.2643-2651), что эпителиоциты эндометрия могут быть источником гистамина. Нашими исследованиями установлено наличие этого биоамина в содержимом полости матки (Диндяев С.В., Виноградов С.Ю. Биоаминпозитивные структуры матки крыс в процессе полового цикла. // Вестник Ивановской медицинской академии. - 2006. - Т.11, №3-4. - С.25-30). В связи с вышеизложенным определение уровня гистамина в эпителиальных клетках имеет важное клиническое значение.

Одним из распространенных способов гистохимического выявления гистамина является метод Кросса-Эвена-Роста с ортофталевым альдегидом (Cross S.W.D. et al. A study of the methods available for the cytochemical localization of histamine by fluorescence induced with o-phthalaldehyde or acetaldehyde // Histochem. J. - 1971. - Vol.3. - P.471-476).

Забор материала для флуоресцентно-гистохимического исследования уровня гистамина в структурах эндометрия экспериментальных животных осуществляется после их умерщвления (Гунин А.Г. Влияние эстрадиола на распределение гистамина в структурах матки крыс в норме и при экспериментальном введении гормона. // Проблемы эндокринологии. - 1991. - Т.37, №4. - С.49-51). Дальнейший процесс исследования включает следующие этапы:

1. Изготовление криостатных срезов и монтирование их на покровных стеклах.

2. Выдерживание срезов в парах ортофталевого альдегида в термостате при 100°С в течение 10 секунд. Стеклянный сосуд, содержащий ортофталевый альдегид и плотно закрытый крышкой, предварительно выдерживается в термостате в течение 10 минут.

3. Помещение срезов во влажную камеру (предварительно прогретый в течение 10 минут сосуд, содержащий на дне воду) в термостате при 100°С в течение 1 минуты.

4. Высушивание срезов в термостате с температурным режимом 70-80°С в течение 5 минут.

5. Изучение полученных препаратов под люминесцентным микроскопом. По условиям этой реакции наибольшая концентрация гистамина дает желтое свечение при длине волны 515 нм (Сергеева В.Е. Люминесцентно-гистохимические методы и флуориметрия в морфологических исследованиях. - Чебоксары, 1985. - Деп. в ВИНИТИ. - №6358-85).

Для окончательной идентификации и количественного выражения уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия препарат подвергается цитоспектрофлуориметрии при помощи фотометрической люминесцентной электронной насадки ФМЭЛ-1А для определения в условных единицах регистрирующего прибора концентрации гистамина в биологических структурах. Для определения интенсивности люминесценции гистамина в исследуемых объектах по традиционной методике используется интерференционный светофильтр №7 фотометрической люминесцентной насадки ФМЭЛ-1А (максимальная длина пропускаемой волны 503±14 нм). Световой поток люминесценции от изучаемого участка поля зрения отсекается автоматически аппаратным зондом и преобразуется ФЭУ в силу тока, которая вызывает отклонение стрелки стандартного измерительного прибора, что пропорционально концентрации гистамина под зондом.

К недостаткам указанного способа определения уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки можно отнести:

1) негуманность и финансовую затратность, связанные с умерщвлением животного,

2) необходимость наличия криостата.

Технический результат предлагаемого нами способа заключается в том, что в каждую фазу полового цикла определяют содержание гистамина в содержимом влагалища экспериментального животного, сравнивают его с уровнем гистамина, составляющим в стадии раннего эструса 0,50±0,07, позднего эструса - 0,34±0,04, метаэструса 0,68±0,08, раннего диэструса - 0,72±0,12, позднего диэструса - 0,75±0,13, проэструса - 0,87±0,11 усл.ед. регистрирующего прибора, и при значениях содержания гистамина ниже расчетных оценивают уровень гистамина в эпителиальных клетках эндометрия как сниженный, а при значениях выше - как повышенный.

Описание сущности предлагаемого способа

Каждую фазу на протяжении полового цикла в утреннее время (в 9.00) с помощью металлической петли осуществляется забор влагалищного содержимого крысы. Полученное содержимое размазывается на 2 предметных стеклах (мазок №1 и мазок №2).

Последовательность дальнейшего приготовления препаратов

1. Выдерживание мазка №1 в стеклянном сосуде с парами ортофталевого альдегида, а мазка №2 в аналогичном сосуде без ортофталевого альдегида в термостате при 100°С в течение 10 секунд.

2. Помещение мазков в раздельные влажные камеры, предварительно прогретые в течение 10 минут, в термостате при 100°С в течение 1 минуты.

3. Высушивание мазков в термостате с температурным режимом 70-80°С в течение 5 минут.

Изучение полученных препаратов осуществляется под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ-2А. С помощью интерференционного светофильтра №7 фотометрической люминесцентной насадки ФМЭЛ-1А определяются средние уровни специфической люминесценции мазка №1 (величина А) и аутолюминесценции мазка №2 (величина В) в условных единицах регистрирующего прибора.

Концентрация гистамина в содержимом влагалища определяется по разнице величин А и В. Результаты представлены в таблице 1.

У этих же крыс во время эфирного наркоза извлекалась матка, из тела которой изготавливались криостатные срезы. Полученные криостатные срезы обрабатывались в соответствии с методом Кросса-Эвена-Роста. Микроспектрофлуориметрически в покровных и железистых эпителиоцитах эндометрия определена средняя концентрация гистамина в каждую фазу полового цикла (таблица 2).

В результате рангового корреляционного анализа Спирмена установлена высокая положительная сопряженность (R=0,829) изменений концентраций гистамина в содержимом влагалища с колебаниями концентрации этого биоамина в покровных и железистых эпителиоцитах эндометрия.

Ниже приводятся 2 примера определения уровня гистамина в эпителиоцитах эндометрия по результатам исследования влагалищных мазков.

Пример 1

Крыса №1

Поля зрения		ранний эструс	поздний эструс	метаэструс	ранний диэструс	поздний диэструс	проэструс
1	0,40	0,35	0,70	0,75	0,80	1,10
2	0,55	0,35	0,60	0,85	0,70	0,80
3	0,45	0,40	0,65	0,75	0,65	0,80
4	0,40	0,35	0,55	0,65	0,70	0,75
5	0,55	0,30	0,60	0,60	0,60	0,85
6	0,55	0,30	0,70	0,60	0,80	0,80
7	0,55	0,25	0,65	0,80	0,80	0,80
8	0,45	0,35	0,60	0,80	0,80	0,80
9	0,60	0,30	0,75	0,60	0,60	1,00
10	0,50	0,30	0,70	0,80	0,70	0,85
Средняя концентрация		0,500±0,0671	0,325±	0,650±	0,72±	0,715±	0,855±
0,0403	0,0592	0,0923	0,0776	0,1036

Сравнение полученных результатов с данными, представленными в таблице 1, показывает их сходство, что позволяет оценивать уровень гистамина в эпителиоцитах эндометрия матки крысы №1 как соответствующий его нормальному содержанию в течение полового цикла.

Пример 2

Крыса №2

Поля зрения		ранний эструс	поздний эструс	метаэструс	ранний диэструс	поздний диэструс	проэструс
1	0,60	0,50	0,90	1,05	0,95	1,10
2	0,75	0,50	0,80	0,85	1,00	1,00
3	0,65	0,60	0,85	1,00	1,00	1,20
4	0,60	0,50	0,80	0,95	0,95	1,10
5	0,55	0,30	0,60	0,60	0,60	0,85
6	0,75	0,50	0,80	0,90	1,00	1,20
7	0,75	0,65	0,75	0,80	0,80	0,90
8	0,65	0,55	0,85	0,80	0,80	1,00
9	0,60	0,50	0,90	0,90	1,00	1,00
10	0,70	0,50	0,90	1,10	1,05	1,00
Средняя концентрация		0,680±0,064	0,530±	0,825±	0,925±	0,945±	1,050±
0,051	0,064	0,096	0,082	0,092

Результаты этого исследования показывают во все стадии полового цикла большее содержание гистамина в содержимом влагалища по сравнению с контрольными данными.

Таблица 1
Содержание гистаминов в мазках содержимого влагалища крыс в различные фазы полового цикла (в усл.ед.)
	ранний эструс	поздний эструс	метаэструс	ранний диэструс	поздний диэструс	проэструс
Гистамин	0,507±0,069	0,341±0,036	0,683±0,080	0,722±0,121	0,749±0,130	0,865±0,114

Таблица 2
Содержание гистамина в эпителиоцитах эндометрия тела матки крыс в различные фазы полового цикла (в усл.ед.)
	ранний эструс	поздний эструс	метаэструс	ранний диэструс	поздний диэструс	проэструс
ЭП	3,198±0,47	2,765±0,36	2,710±0,42	3,672±0,45	6,060±0,44	6,945±0,94
ЭЖ	3,348±0,48	3,058±0,33	2,945±0,41	3,769±0,92	5,963±0,60	7,616±0,77
ЭП - эпителиоциты покровные, ЭЖ - эпителиоциты железистые

Способ оценки уровня гистамина в эпителиальных клетках эндометрия матки крыс в процессе полового цикла, включающий забор материала с последующим флуоресцентно-гистохимическим исследованием с использованием ортофталевого альдегида, отличающийся тем, что в каждую фазу полового цикла определяют содержание гистамина в содержимом влагалища крысы, сравнивают его с уровнем гистамина, составляющим в стадии раннего эструса 0,50±0,07, позднего эструса -0,34±0,04, метаэструса 0,68±0,08, раннего диэструса - 0,72±0,12, позднего диэструса - 0,75±0,13, проэструса - 0,87±0,11 усл.ед. регистрирующего прибора, и при значениях содержания гистамина во влагалищном содержимом ниже контрольных оценивают уровень гистамина в эпителиальных клетках эндометрия как сниженный, а при значениях выше - как повышенный.