Транссиалидазы из trypanosoma congolense

Транссиалидазы из trypanosoma congolense

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предмет изобретения

Настоящее изобретение относится к новым ферментам, которые переносят сиаловые кислоты от донорной молекулы (например, олигосахаридов, полисиаловых кислот, гликозилированных белков, гликозилированных пептидов, гликозилированных липидов (например, ганглиозидов) и других гликозилированных низкомолекулярных и высокомолекулярных молекул) на акцепторную молекулу (например, олиго- и полисахариды, гликозилированные белки, гликозилированные пептиды, гликозилированные липиды и другие гликозилированные низкомолекулярные и высокомолекулярные молекулы) (транс-сиалидазам). Эти ферменты были выделены из одноклеточного организма Trypanosoma congolense.

Кроме того, изобретение относится к функциональным эквивалентам этих ферментов; кодирующим эти ферменты и их функциональные эквиваленты последовательностям нуклеиновых кислот; экспрессионным конструкциям и векторам, которые содержат эти последовательности; рекомбинантным микроорганизмам, которые несут кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты согласно изобретению; способам рекомбинантного получения ферментов по изобретению; способам выделения ферментов по изобретению из Trypanosoma congolense; способам ферментативного сиалилирования акцепторных молекул с применением ферментов по изобретению; эффекторам транс-сиалидаз по изобретению; применению последовательностей нуклеиновых кислот, ферментов, эффекторов или продуктов сиалилирования по изобретению для производства вакцин, медикаментов, пищевых продуктов или пищевых добавок; а также к самим полученным продуктам по изобретению.

Уровень техники

Транс-сиалидазы могут переносить сиаловые кислоты, предпочтительно альфа-2,3-связанные сиаловые кислоты, от донорной молекулы на акцепторную молекулу, при этом снова образуются альфа-2,3-гликозидные связи, предпочтительно на β-концевом галактозном остатке.

Под термином сиаловые кислоты понимают все N- и О-производные нейраминовой кислоты (Blix et al., 1957). Нейраминовая кислота (5-амино-3,5-дидезокси-D-глицеро-D-галакто-нонуло-пираносон-кислота) является аминосахаром со скелетом из девяти атомов углерода, который благодаря карбоксильной группе при втором С-атоме приобретает очень кислый рК-показатель 2,2 и поэтому является отрицательно заряженным при физиологических условиях. Незамещенная форма является очень нестабильной и не встречается в природе в свободной форме (Schauer, 1982). Правда, теперь стали известны более 40 природных производных нейраминовой кислоты (Schauer und Kamerling, 1997). Двумя наиболее часто встречающимися в природе сиаловыми кислотами являются N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac), предшественник всех гликозидно связанных сиаловых кислот (Schauer, 1991), и N-гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc), которая возникает в результате гидроксилирования метильной группы N-ацетильного остатка СМР-Neu5Ac (Shaw und Schauer, 1988). Гидроксильные группы этих обеих сиаловых кислот могут быть заменены ацетильными, лактильными, сульфатными и фосфатными остатками в различной комбинации, что приводит к большому структурному разнообразию сиаловых кислот (Schauer, 1991; Schauer und Kamerling, 1997).

Наибольшая часть природно встречающихся сиаловых кислот существует в связанном виде в виде компонента олигосахаридов, полисахаридов и особенно гликоконъюгатов (Schauer, 1982). Но уже известны также полисиаловые кислоты из трансгенного микробного производства. Сиалилированные гликоконъюгаты встречаются прежде всего в наружной мембране клеток, но являются также важными компонентами сыворотки и мукозной слизи (Traving und Schauer, 1998). Сиаловые кислоты защищают гликопротеины и клетки от атаки протеазами и другими ферментами и, следовательно, от расщепления (Reuter et al., 1988). Содержащие сиаловые кислоты слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта образуют не только защиту от пищеварительных ферментов, но также защищают лежащие ниже ткани от проникновения патогенных бактерий (Keim und Schauer, 1997).

Очень важную функцию выполняют сиаловые кислоты при молекулярных и клеточных процессах распознавания. При этом они маскируют рецепторы и таким образом препятствуют взаимодействиям между рецепторами и лигандами (Schauer, 1985; Kelm und Schauer, 1997). Так, например, сиаловые кислоты защищают гликопротеины сыворотки и эритроциты от расщепления и фагоцитоза, маскируя лежащие под ними галактозные остатки. При отщеплении концевых сиаловых кислот субтерминальные галактозные остатки могут связываться лектинами на гепатоцитах или фагоцитах, и происходит эндоцитоз сывороточных белков или эритроцитов. Следующим примером является защита гомологичных тканей, а также многих высокосиалилированных опухолей от узнавания при помощи иммунной системы (Pilatte et al., 1993). В случае потери защищающего слоя сиаловых кислот могут произойти аутоиммунные реакции.

Сиаловые кислоты служат также в качестве сайтов узнавания для гомологичных клеток и гормонов и, следовательно, играют важную роль при клеточных взаимодействиях (Kelm und Schauer, 1997). При воспалениях, например, эндотелиальные клетки экспрессируют на их поверхности селектины, которые узнают определенные сиалилированные структуры (например, сиалил-Льюис Х) на лейкоцитах, так что они связываются с эндотелиальными клетками и могут проникать в ткань (Lasky, 1995). Кроме того, действие транс-сиалидаз влияет на активацию Т-клеток гуморальной иммунной защиты (Gao et al., 2001). Сиалоадгезины (Siglecs), такие как миелин-ассоциированный гликопротеин (MAG), также связываются с высокой специфичностью с сиалилированными гликанами (Kelm et al., 1996; Crocker et al., 1998). Миелин-ассоциированный гликопротеин участвует в нервной системе, в частности, в миелинизации и в регуляции роста аксонов. Таким образом, неудивительно, что недавно было установлено, что транс-сиалидазы посредством переноса сиаловых кислот участвуют в дифференцировке нервных клеток и глиальных клеток (Chuenkova et al., 2001). CD-22 является следующим связывающим сиаловую кислоту рецептором, который встречается на лимфоцитах и делает возможным «диалог» Т- и В-лимфоцитов. Семейство Siglecs состоит в среднем из более чем 10 молекулярно-биологически охарактеризованных предшественников.

Однако сиаловые кислоты важны не только при гомологичных процессах распознавания, но представляют собой также рецепторы для некоторых бактерий, вирусов и токсинов. Так, например, происходит связывание столбнячного токсина с ганглиозидами нервных синапсов через сиаловые кислоты (Schauer et al., 1995). Специфическая в отношении сиаловых кислот адгезия через микробные лектины (Sharon und Lis, 1997) часто является решающей стадией при инфекционных заболеваниях, например, при вызываемом некоторыми штаммами E. coli менингите новорожденных или при инфекциях слизистой оболочки желудка Helicobacter pylori. Прежде всего возбудители гриппа А и В прикрепляются через сиаловую кислоту к клеткам, которые должны инфицироваться (Schauer, 2000).

Модификации сиаловых кислот, в частности, О-ацетилирование, имеют большое значение при регуляции молекулярного и клеточного распознавания (Schauer, 1991). Так, вирусы гриппа С связываются специфически с 9-О-ацетилированными сиаловыми кислотами на эпителии бронхов (Herrler et al., 1985), тогда как О-ацетилирование препятствует связыванию вирусов гриппа А и В (Higa et al., 1985). Но прежде всего О-ацетилирование сиаловых кислот является очень важным для морфогенеза и развития различных тканей (Varki et al., 1991). В случае нейроэктодермальных опухолей оно повышается (Hubl et al., 2000; Fahr und Schauer, 2001), а при раке толстой кишки понижается (Cornfield et al., 1999). Сиаловые кислоты являются незаменимыми модуляторами биологического поведения опухолей (Schauer, 2000).

Описание фигур

Фиг.1 показывает сравнение аминокислотных последовательностей транс-сиалидаз TS1 и TS2 по изобретению. Идентичные аминокислоты в обеих последовательностях отмчены в виде темных участков. Соответствие (идентичность) обеих частичных последовательностей составляет только приблизительно 50%.

Фиг.2 показывает различные виды реакций сиалидазы, сиалилтрансфераз и транс-сиалидаз.

Фиг.3 показывает сравнение аминокислотной последовательности сиалидазы из Trypanosoma rangeli (T. r. S), транс-сиалидазы Trypanosoma cruzi (T. cr. TS) и транс-сиалидазы Trypanosoma brucei brucei (T. b. br. TS) с частичными последовательностями обеих транс-сиалидаз из Trypanosoma congolense (T. con. TS1 и T. con. TS2) по изобретению. Аминокислоты, которые во всех последовательностях являются идентичными, изображены белыми на темно-сером фоне. Аминокислоты, которые идентичны по меньшей мере в 4 из 5 последовательностей, напечатаны черным шрифтом на темно-сером фоне, тогда как аминокислоты, которые являются идентичными по меньшей мере в 3 из 5 последовательностей, представлены светло-серым цветом.

Сущность изобретения

Задачей изобретения была разработка нового средства, при помощи которого можно влиять на регулируемые сиаловой кислотой биологические или патобиологические процессы.

Вышеуказанную задачу удалось неожиданным образом решить с помощью новых ферментов с транс-сиалидазной активностью и их кодирующих последовательностей из Trypanosoma congolense.

Первый предмет изобретения относится к полинуклеотидам, которые кодируют белки с транс-сиалидазной активностью и могут быть выделены из Trypanosoma congolense, причем эти белки предпочтительно катализируют перенос сиаловой кислоты от донорной молекулы на акцепторную молекулу.

Предпочтительные полинуклеотиды включают в себя по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с SEQ ID NO:1 или 3 или представляют их фрагменты, которые включают в себя по меньшей мере 15 связанных нуклеотидных остатков. Предметом изобретения являются также комплементарные им полинуклеотиды и фрагменты; и нуклеотидные последовательности, произведенные из этих полинуклеотидов вследствие вырожденности генетического кода.

Следующий предмет изобретения относится к олигонуклеотидам, которые гибридизуются с полинуклеотидом по изобретению, в частности, при строгих условиях.

Предметом изобретения являются также полинуклеотиды, которые гибридизуются с олигонуклеотидом в соответствии с приведенным выше определением, в частности, при строгих условиях и кодируют генный продукт из микроорганизмов рода Trypanosoma.

Предметом изобретения являются также полипептиды, которые кодируются полинуклеотидом, который включает в себя последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с приведенным выше определением; или которые обнаруживают аминокислотную последовательность, которая включает в себя по меньшей мере 10 связанных аминокислот в соответствии с SEQ ID NO:2 или 4; а также их функциональные эквиваленты, которые обладают транс-сиалидазной активностью.

Предметом изобретения являются, в частности, транс-сиалидазы или их функциональные эквиваленты с транс-сиалидазной активностью, отличающиеся следующими частичными аминокислотными последовательностями:

TDTVAKYSTDGGRTWKREVIIPNGR (положения 1-25 согласно SEQ ID NO:2)

FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLI (положения 1-30 согласно SEQ ID NO:4)

Предпочтительная транс-сиалидаза 1 (TS1) отличается по меньшей мере одной из следующих характеристик:

Нуклеотидная последовательность	SEQ ID NO:1
Аминокислотная последовательность	SEQ ID NO:2
Температурный оптимум	30-40°C
Оптимум рН	рН 6,5-8,5
Изоэлектрическая точка	рН 4-5
Молекулярная масса в нативном электрофорезе	400-600 кДа
Молекулярная масса в восстанавливающем электрофорезе в ДСН-ПААГ	90 кДа

Другая предпочтительная транс-сиалидаза 2 (TS2) отличается по меньшей мере одной из следующих характеристик:

Нуклеотидная последовательность	SEQ ID NO: 3
Аминокислотная последовательность	SEQ ID NO: 4
Температурный оптимум	30-40°C
Оптимум рН	рН 6,5-8,5
Изоэлектрическая точка	рН 5-6
Молекулярная масса в нативном электрофорезе	120-180 кДа
Молекулярная масса в восстанавливающем электрофорезе в ДСН-ПААГ	90 кДа

Вышеописанные полинуклеотиды и полипептиды по изобретению, в частности кодирующие последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, происходят из организма Trypanosoma congolense. Однако они доступны также с использованием синтетических, в частности химических, биохимических, ферментативных, генотехнологических и трансгенных способов.

Кроме того, предметом изобретения являются функциональные эквиваленты транс-сиалидаз данного изобретения.

Кроме того, предметом изобретения являются экспрессионные кассеты, включающие в себя последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с вышеописанным определением в функциональной связи по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью нуклеиновой кислоты. Кроме того, изобретение включает в себя также рекомбинантные векторы, содержащие по меньшей мере одну из этих экспрессионных кассет.

Кроме того, предметом изобретения являются прокариотические и эукариотические хозяева, трансформированные по меньшей мере одним вектором в соответствии с приведенным выше определением.

Кроме того, изобретение относится к применению экспрессионной кассеты, вектора или хозяина в соответствии с приведенным выше определением для рекомбинантного получения белка с транс-сиалидазной активностью.

Предметом изобретения является также способ ферментативного сиалилирования акцепторной молекулы, отличающийся тем, что акцепторную молекулу инкубируют с содержащим остатки сиаловой кислоты донором в присутствии транс-сиалидазы в соответствии с вышеописанным определением и выделяют сиалилированный акцептор.

Подобные способы отличаются по меньшей мере одним дополнительным свойством из следующих свойств:

а) донор выбран из связанных с олигонуклеотидами, полисахаридами, полисиаловыми кислотами, гликопротеинами и гликолипидами сиаловых кислот, таких как, в частности, лактоферрины, гликозилированные белки молока и казеины и их фрагменты;

b) акцептор выбран из содержащих β-галактозу полимеров, таких как β-галактоолигосахариды, лактит, лактобионовая кислота, метил-β-лактозид, ацетиллактозамины, галактопиранозиды, транс-галактоолигосахариды, полигалактоза и другие гликоконъюгаты со связанной на конце β(1-3)- или β(1-4)-галактозой; или галактозы.

Следующий аспект изобретения относится к применению транс-сиалидазы по изобретению, кодирующей ее последовательности нуклеиновой кислоты или полученного продукта сиалилирования по изобретению для получения лекарственного средства, пищевого продукта, пищевой добавки или пищевого компонента для предупреждения или лечения контролируемых сиаловой кислотой паразитарных, бактериальных или вирусных инфекций; для лечения опухолевых заболеваний; для лечения заболеваний, которые связаны с нарушением развития ткани; для лечения заболеваний иммунной системы; для лечения аутоиммунных реакций; для лечения заболеваний с нарушенной коммуникацией клеток; и/или для лечения воспалений.

В частности, предметом изобретения является применение транс-сиалидазы по изобретению в соответствии с вышеуказанным определением для развития вакцины против трипаносомоза или для развития ферментных ингибиторов для лечения или предупреждения вызываемых трипаносомами инфекций.

Кроме того, изобретение относится к применению транс-сиалидазы, кодирующей ее последовательности нуклеиновой кислоты или полученных в соответствии с изобретением сиалилированных продуктов для получения лекарственного средства, пищевой добавки или пищевого продукта для защиты гомологичных клеток или тканей или гликопротеинов от ферментативного воздействия.

Кроме того, предметом изобретения является применение транс-сиалидазы, кодирующей ее последовательности нуклеиновой кислоты или полученных в соответствии с изобретением сиалилированных продуктов для получения лекарственного средства, пищевой добавки или пищевого продукта для воздействия на развитие и/или морфогенез тканей организма.

Кроме того, изобретение относится к эффекторам транс-сиалидазной активности, выбранным из

а) полипептидов-лигандов, которые взаимодействуют с транс-сиалидазой в соответствии с вышеуказанным определением;

b) низкомолекулярных эффекторов, которые модулируют биологическую активность транс-сиалидазы в соответствии с вышеуказанным определением; и

с) антисмысловых последовательностей нуклеиновых кислот относительно последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с вышеуказанным определением.

Кроме того, изобретение относится к применению такого эффектора для получения лекарственного средства, пищевой добавки или пищевого продукта для лечения или профилактики ассоциированных с транс-сиалидазной активностью заболеваний.

Кроме того, предметом изобретения является способ выделения фермента с транс-сиалидазной активностью, в котором

а) Trypanosoma congolense культивируют в среде и

b) желаемый продукт выделяют ионообменной хроматографией с использованием градиента соли, в случае необходимости с последующими изоэлектрическим фокусированием, гель-фильтрацией, аффинной хроматографией и/или осаждением белка.

Наконец, изобретение относится к фармацевтическому или генотерапевтическому средству, содержащему в фармацевтическом или генотерапевтическом носителе по меньшей мере один эффектор в соответствии с вышеуказанным определением.

Подробное описание изобретения

i) Значение изобретения

Значение изобретения возникает из возможного в результате осуществления изобретения влияния на контролируемые сиаловой кислотой механизмы паразитарной, бактериальной и вирусной инфекции, влияния на клеточную коммуникацию и на иммунную систему и изменения механизмов регуляции и развития тканей человека и животных, а также опухолей. Это достигается нацеленным переносом сиаловых кислот на биологически релевантные гликоструктуры (гликаны, производные гликанов и гликоконъюгаты) с использованием описанных здесь транс-сиалидаз.

Из переноса сиаловых кислот на выбранные структуры-носители возникают, например, продукты для изменения воспалительных реакций, изменения клеточных взаимодействий в теле человека и животного, защита гомологичных тканей от атак собственной иммунной системы (аутоиммунных реакций), «перерождение» раковых клеток в организме пациента, посредством чего гомологичная иммунная система снова борется с ними (терапия рака и предупреждение рака), подавление проникновения патогенных бактерий в организм человека и животного, предупреждение и подавление вирусных инфекций слизистой оболочки желудка посредством Helicobacter pylori, подавление вызываемого бактериями и вирусами менингита новорожденных, превентивное и терапевтическое влияние на рецепторы эукариотических и прокариотических патогенных организмов, бактерий, вирусов и токсинов во избежание развертывания их действия в организме человека и животного, ингибирование связывания холерного токсина со слизистыми оболочками пищеварительного тракта человека и животных, развитие вакцин против трипаносомоза, развитие ферментных ингибиторов для подавления (терапии) инфекций Trypanosoma, влияние на молекулярные и клеточные процессы распознавания в организме человека и животного, защита гликопротеинов и клеток от атаки протеазами и другими ферментами, среди прочего также для защиты от расщепления молекул ферментами пищеварительного тракта человека и животных, влияние на развитие тканей и влияние на морфогенез тканей в организме.

Транс-сиалидазы по изобретению характеризуются следующими ДНК- и аминокислотными последовательностями, а также другими ДНК-последовательностями-гомологами, например, с более чем 60-процентным соответствием (идентичностью) относительно этих частичных последовательностей.

ii) Данные последовательностей относительно предпочтительных транс-сиалидаз

(1) Информации для последовательности фермента TS1:

Признаки ДНК частичной последовательности TS1:

Длина: 1491 п.н.

Тип: нуклеиновая кислота

Форма тяжа: двойной тяж

Происхождение: Trypanosoma congolense

ДНК-последовательность фермента TS1 (SEQ ID NO:1):

Аминокислотная последовательность фермента TS1 (SEQ ID NO:2):

(2) Информации для последовательности фермента TS2:

Признаки ДНК частичной последовательности TS1:

Длина: 831 п.н.

Тип: нуклеиновая кислота

Форма тяжа: двойной тяж

Происхождение: Trypanosoma congolense

ДНК-последовательность фермента TS2 (SEQ ID NO:3):

Аминокислотная последовательность фермента TS2 (SEQ ID NO:4):

Частичные последовательности аминокислот фермента TS1 и фермента TS2 имеют соответствие (идентичность) только приблизительно 50%. Поэтому эти частичные последовательности характеризуются однозначно как два различных вещества (см. фиг.1).

(iii) Описание свойств новых обнаруженных ферментов TS1 и TS2

а) Физико-химические свойства этих веществ

Таблица 1Основные данные обеих транс-сиалидаз TS1 и TS2
Свойства	TS1	TS2
Температурный оптимум	30-40°С	30-40°С
Оптимум рН	рН 6,5-8,5	рН 6,5-8,5
Изоэлектрическая точка	рН 4-5	рН 5-6
Молекулярная масса в нативном электрофорезе	400-600 кДа	120-180 кДа
Молекулярная масса в восстанавливающем электрофорезе в ДСН-ПААГ	90 кДа	90 кДа
Влияние соли	1 М KCl и NaCl уменьшает активность обоих ферментов на 50%, обессоливание снова восстанавливает ферментативную активность
Влияние ионов металлов	20 мМ Са2+, Mg2+, Mn2+: не влияют4 мМ Cu2+, Zn2+, Fe2+, Co2+: небольшое влияние
Влияние предположительных ингибиторов	10 мМ N-(4-нитрофенил)оксаминовая кислота: небольшое ингибирование10 мМ N-ацетил-2,3-дидегидро-2-дезоксинейраминовая кислота: небольшое влияние

b) Биологические свойства этих веществ

Оба заявленных здесь вещества являются двумя ферментами, которые переносят сиаловые кислоты от донорной молекулы на акцепторную молекулу.

В качестве доноров в случае обоих ферментов, хорошими донорами для сиаловых кислот, которые могут переноситься этими ферментами, являются гликаны, например, олигосахариды, полисахариды, полисиаловые кислоты, гликопротеины и гликолипиды, связанные сиаловые кислоты. Среди гликопротеинов находятся, в частности, лактоферрины (из человека, коровы, козы, овцы, лошади, верблюда и других животных), гликозилированные белки молока (из человека, коровы, козы, овцы, лошади, верблюда и других животных), а также другие гликозилированные белки человеческого, животного и растительного происхождения, а также их части, такие как, например, гликомакропептид из казеинов этих животных. В качестве доноров могут использоваться также ганглиозиды.

Обе транс-сиалидазы имеют хорошую акцепторную специфичность в отношении галактоолигосахарида, в частности, в отношении бета-галактоолигосахарида, такого как, например, Vivinal GOS фирмы Borculo Domo Ingredients (BDI) и Oligomate 55 фирмы Yakult. Кроме того, в качестве акцепторов могут действовать лактит, лактобионовая кислота, метил-β-лактозид, ацетиллактозамины, галактопиранозиды, транс-галактоолигосахариды, полигалактозы и другие гликоконъюгаты с концевой β(1,3)- или β(1-4)-связанной галактозой. Метилирование галактозных остатков приводит к уменьшению акцепторной функции. Метилирование глюкозных остатков (например, у лактозы) имеет незначительное влияние на акцепторную функцию. Моносахарид галактоза также служит в качестве акцептора, хотя и с меньшей специфичностью.

Фермент TS1 обнаруживает вдвое более эффективный перенос сиаловых кислот на соответствующие акцепторы, чем фермент TS2. Субстраты могут быть сводобными, т.е. растворимыми, или также связанными с клеточной мембраной.

Известен также перенос альфа-2,3-связанных концевых сиаловых кислот на бета-1,4-связанные концевые галактозные остатки транс-сиалидазами Trypanosoma cruzi (Schenkman et al., 1991; Vandekerckhove et al., 1992; Scudder et al., 1993) и Trypanosoma brucei (Engstler et al., 1992, 1993, 1995). Однако TS1 и TS2 отличаются на основе различных ДНК- и аминокислотных последовательностей от этих уже известных ферментов. Таким образом, TS1 и TS2 характеризуются как однозначно новые вещества (транс-сиалидазы). Для дополнительного разграничения см. следующий параграф.

iv) Разграничение между настоящим изобретением и другими транс-сиалидазами, сиалидазами и сиалилтрансферазами

Фермент «транс-сиалидаза» был впервые описан в американском виде трипаносомы Trypanosoma cruzi (Schenkman et al., 1991). Немного позднее удалось обнаружить этот фермент также в американских видах Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei rhodesiense и Trypanosoma brucei brucei (Engstler et al., 1993, Pontes de Carvalho et al., 1993, Engstler et al., 1995). Кроме того, транс-сиалидазу детектировали в видах Endothypanum (паразитах, которые поражают ленивца) (Medina-Acosta et al., 1994), в Corinebacterium diphtheriae (Mattos-Guaraldi et al., 1998) и в плазме человека (Tertov et al., 2001). Уже задолго до обнаружения транс-сиалидаз были известны так называемые сиалидазы. Они являются гликогидралазами, которые переносят сиаловые кислоты от донорной молекулы исключительно на воду, эти сиаловые кислоты образуются также при гидролизе олигосахаридов и гликоконъюгатов.

Кроме того, определенные ферменты могут переносить активированные цитидинмонофосфатом (СМР) сиаловые кислоты на другие сахарные остатки, в основном на галактозу и N-ацетилгалактозамин. Эти ферменты называют сиалилтрансферазами (см. фиг.2).

Заявленные здесь транс-сиалидазы переносят сиаловые кислоты не исключительно от донорной молекулы на воду, как это делают просто сиалидазы. Однако, если подходящий акцептор отсутствует, заявленные здесь транс-сиалидазы гидролизуют сиаловые кислоты так же, как и простые сиалидазы. Заявленные здесь транс-сиалидазы не нуждаются также в активированных сиаловых кислотах для их реакции переноса, как ранее упомянутые сиалилтрансферазы. Транс-сиалидазы имеют также более широкую донорную и акцепторную специфичность, чем сиалилтрансферазы, и поэтому они являются особенно многосторонне применимыми. Таким образом, заявленные здесь транс-сиалидазы являются более предпочтительными для промышленного применения, чем просто сиалидазы и сиалилтрансферазы.

До сих пор известны только ДНК- и аминокислотные последовательности транс-сиалидаз Trypanosoma cruzi и Trypanosoma brucei brucei, а также ДНК- и аминокислотная последовательность простой сиалидазы из Trypanosoma rangeli. Заявленный здесь фермент TS1 имеет соответствие (идентичность) относительно соответствующей аминокислотной последовательности транс-сиалидазы из Trypanosoma brucei brucei ниже 60% и соответствие ниже 50% относительно соответствующей частичной последовательности Trypanosoma cruzi. Заявленный здесь фермент TS2 имеет соответствие (идентичность) относительно соответствующей аминокислотной последовательности транс-сиалидазы из Trypanosoma brucei brucei ниже 50% и соответствие ниже 50% относительно соответствующей частичной последовательности Trypanosoma cruzi (см. фиг.3). Далее, известно, что соответствие аминокислот между транс-сиалидазами трипаносом и известными сиалидазами и транс-сиалидазами бактерий и вирусов составляет только 20%-30% (Chuenkova et al., 1999, Montagna et al., 2002).

В случае описанных здесь ферментов речь идет, следовательно, о новых охарактеризованных веществах (ферментах), соответствие (идентичность) которых относительно соответствующих ДНК- и аминокислотных последовательностей других известных ферментов со сходной функцией составляет менее 60%.

v) Дополнительные пояснения в отношении настоящего изобретения

а) Полипептиды и функциональные эквиваленты

«Полипептиды» в контексте изобретения включают в себя характерные частичные фрагменты аминокислотных последовательностей по изобретению, а также аминокислотные последовательности ферментов по изобретению и их функциональные эквиваленты.

Таким образом, в соответствии с изобретением “функциональные эквиваленты” или “гомологи” включают в себя также конкретно раскрытые новые полипептиды или ферменты.

“Функциональные эквиваленты” или аналоги конкретно раскрытых полипептидов являются в пределах изобретения отличающимися от них полипептидами, которые, кроме того, обладают желаемой биологической активностью в соответствии с вышеуказанным определением (например, субстратной специфичностью).

Под “функциональными эквивалентами” в соответствии с изобретением понимают, в частности, мутанты, которые по меньшей мере в одном из вышеупомянутых положений последовательности обнаруживают другую аминокислоту, чем конкретно названная аминокислота, но, несмотря на это, обладают указанной здесь биологической активностью. “Функциональные эквиваленты” включают в себя, следовательно, мутанты, полученные посредством одного или нескольких добавлений, одной или нескольких замен, делеций и/или инверсий аминокислот, причем вышеупомянутые изменения могут обнаруживаться в любом положении последовательности, пока они приводят к мутанту с профилем свойств в соответствии с изобретением. Функциональная эквивалентность имеется, в частности, также в том случае, если картина реактивности между мутантом и неизмененным полипептидом качественно согласуется, т.е., например, превращаются одинаковые субстраты с различной скоростью.

«Функциональными эквивалентами» в вышеупомянутом смысле являются также предшественники описанных полипептидов, а также функциональные производные и соли этих полипептидов. Под термином «соли» понимают как соли карбоксильных групп, так и кислотно-аддитивные соли аминогрупп белковых молекул по изобретению. Соли карбоксильных групп могут быть получены известным per se способом и включают в себя неорганические соли, такие как, например, соли натрия, кальция, аммония, железа и цинка, а также соли с органическими основаниями, такими как, например, амины, например, триэтаноламин, аргинин, лизин, пиперидин и т.п. Кислотно-аддитивные соли, такие как, например, соли с минеральными кислотами, такими как соляная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, такими как уксусная кислота и щавелевая кислота, также являются предметом изобретения.

“Функциональные производные” полипептидов по изобретению могут быть также получены на функциональных боковых группах аминокислот или на их N- или С-концевых сторонах с использованием известных способов. Подобные производные включают в себя, например, алифатические эфиры групп карбоновых кислот, амиды групп карбоновых кислот, полученные превращением с аммиаком или с первичным или вторичным амином; N-ацилпроизводные свободных аминогрупп, полученные превращением с ацильными группами; или О-ацилпроизводные свободных гидроксигрупп, полученные превращением с ацильными группами.

«Функциональные эквиваленты» включают в себя, конечно, также полипептиды, которые доступны из других организмов, а также природно встречающиеся варианты. Например, посредством сравнения последовательностей могут быть установлены участки гомологичных районов последовательностей и в приложении к конкретным задачам изобретения могут быть получены эквивалентные ферменты.

«Функциональные эквиваленты» включают в себя также фрагменты, предпочтительно отдельные домены или мотивы последовательности, полипептидов данного изобретения, которые, например, обнаруживают желаемую биологическую функцию.

«Функциональными эквивалентами» являются, кроме того, слитые белки, которые обнаруживают одну из вышеупомянутых полипептидных последовательностей или произведенные из нее функциональные эквиваленты и по меньшей мере одну дополнительную функционально от нее отличающуюся, гетерологичную последовательность в функциональном N- или С-концевом связывании (т.е. без взаимного значимого функционального ухудшения частей слитого белка). Неограничительными примерами подобных гетерологичных последовательностей являются, например, сигнальные пептиды, ферменты, иммуноглобулины, поверхностные антигены, рецепторы или лиганды рецепторов.

“Функциональными эквивалентами” транс-сиалидаз по изобретению являются, в частности, ферменты, аминокислотные последовательности или аминокислотые частичные последовательности которых обнаруживают относительно соответствующей аминокислотной последовательности или аминокислотной частичной последовательности согласно SEQ ID NO:2 или 4 идентичность последовательности (гомологию последовательности) по меньшей мере 60%, в частности, по меньшей мере 70%, например, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%, рассчитанную в соответствии с алгоритмом Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448.

В случае возможного гликозилирования белка эквиваленты согласно изобретению включают в себя белки вышеупомянутого типа в дегликозилированной или гликозилированной форме, а также полученные изменением картины гликозилирования измененные формы.

Гомологи белков и полипептидов по изобретению могут быть получены при помощи мутагенеза, например, посредством точковой мутации, удлинения или укорочения белка. Понятие “гомолог” относится в данном контексте также к вариантной форме белка, которая действует в качестве агониста или антагониста активности белка.

Гомологи белков по изобретению могут быть идентифицированы посредством скрининга комбинаторных банков мутантов, например, укороченных мутантов. Например, может быть создан мозаичный банк белков-вариантов при помощи комбинаторного мутагенеза на уровне нуклеиновых кислот, например, посредством ферментативного лигирования смеси синтетических олигонуклеотидов. Имеется множество способов, которые могут быть использованы для получения банков потенциальных гомологов из одной вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Химический синтез вырожденной последовательности гена может выполняться в автоматизированном ДНК-синтезаторе, и синтетический ген может быть затем лигирован в подходящий экспрессирующий вектор. Применение вырожденного набора генов позволяет обеспечение всех последовательностей в одной смеси, которые кодируют желаемый набор потенциальных белковых последовательностей. Способы синтеза вырожденных олигонуклеотидов известны специалисту в данной области (например, Narang, S.A. (1982) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem, 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).

b) Полинуклеотиды

«Полинуклеотиды» в контексте изобретения включают в себя характерные частичные фрагменты последовательностей нуклеиновых кислот по изобретению, которые кодируют частичные аминокислотные последовательности ферментов по изобретению, а также последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют ферменты и их функциональные эквиваленты. Предпочтительно, полинуклеотиды включают в себя более приблизительно 20, в частности, более приблизительно 30, например, более приблизительно 45 или более приблизительно 60 остатков нуклеиновых кислот.

«Олигонуклеотиды» включают в себя, в частности, последовательность менее чем приблизительно 60, предпочтительно, менее чем приблизительно 45, в частности, менее чем приблизительно 30, или менее чем приблизительно 20 остатков нуклеиновых кислот.

Все упомянутые здесь «последовательности нуклеиновых кислот» могут быть получены известным per se образом при помощи химического синтеза из нуклеотидных элементарных звеньев, как, например, посредством конденсации фрагментов отдельных перекрывающихся, комплементарных элементарных звеньев нуклеиновых кислот двойной спирали. Химический синтез олигонуклеотидов может происходить, например, известным образом, в соответствии с фосфороамидитным способом (Voet, Voet, 2. Aufgabe, Wiley Press New York, Seiten 896-897). Присоединение синтетических олигонуклеотидов и заполнение гэпов с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы и реакций лигирования, а также общие способы клонирования описаны в Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratоry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Предметом изобретения являются также пос