Полумягкие иммуностимулирующие олигонуклеотиды с-класса

Полумягкие иммуностимулирующие олигонуклеотиды с-класса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение в целом относится к иммуностимулирующим олигонуклеотидам со сниженным воспалительным эффектом в отношении почек, к их композициям и способам использования иммуностимулирующих олигонуклеотидов. В частности, иммуностимулирующие олигонуклеотиды относятся к полумягким олигонуклеотидам С-класса, которые особенно эффективны для лечения аллергии, астмы, рака и инфекционных заболеваний.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Бактериальная ДНК оказывает иммуностимулирующее воздействие, активируя В-клетки и природные клетки-киллеры, тогда как ДНК позвоночных животных таким эффектом не обладает (Tokunaga, T., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79: 682-686; Tokunaga, T., et al., 1984. JNCI 72: 955-962; Messina, J.P., et al., 1991, J. Immunol. 147: 1759-1764; и обзор (Krig, 1998, In: Applied Oligonucleotide Technology, C. A. Stein and A. M. Krig, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448)). В настоящее время известно, что такие иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК являются результатом наличия неметилированных динуклеотидов CpG в определенных положениях оснований (CpG мотивы), которые часто встречаются в бактериальной ДНК, но которые метилируются и в меньшей степени представлены в ДНК позвоночных организмов (Krig et al., 1995 Nature 374:546-549; Krig, 1999 Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10). Иммуностимулирующие эффекты бактериальной ДНК могут повторять синтетические олигодезоксинуклеотиды (ODN), содержащие такие CpG мотивы. Указанные CpG ODN обладают высокоэффективным стимулирующим воздействием на лейкоциты человека и мышей, в том числе на пролиферацию В-клеток; секрецию цитокинов и иммуноглобулинов; литическую активность природных клеток-киллеров (NK) и на секрецию IFN-γ, а также на активацию дендритных клеток (ДК) и других антиген-презентирующих клеток, экспрессирующих ко-стимулирующие молекулы и секретируемые цитокины, особенно Тh1, которые важны для запуска развития Th1-подобных Т-клеточных ответов. Указанные иммуностимулирующие эффекты нативного фосфодиэфирного скелета CpG ODN высоко специфичны в отношении CpG в том смысле, что указанные эффекты резко снижаются, если CpG мотив метилируется, изменяется на GpC или устраняется или изменяется иным образом (Krig et al., 1995 Nature 374: 546-549; Hartmann et al., 1999. Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10).

В проведенных ранее исследованиях полагали, что иммуностимулирующий мотив CpG описывается формулой пурин-пурин-CpG-пиримидин-пиримидин (Krig et al., 1995 Nature 374:546-549; Pisetsky, 1996 J. Immunol. 156: 421-423; Hacker et al., 1998 ЕMBO J. 17: 6230-6240; Lipford et al., 1998 Trends in Microbiol. 6: 496-500). Однако в настоящее время известно, что лимфоциты мышей отвечают также хорошо на фосфодиэфирные CpG мотивы, которые имеют другую «формулу» (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160: 5898-5906) и то же самое справедливо для В-клеток и дендритных клеток человека (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98: 1119-1129).

В последнее время было описано несколько разных классов CpG олигонуклеотидов. Один класс CpG эффективен для активации В-клеток, но обладает относительно слабой активностью в отношении индукции IFN-α и активации NK-клеток; этот класс был назван В-классом. CpG олигонуклеотиды В-класса, как правило, полностью стабилизированы и включают неметилированный CpG динуклеотид с определенным предпочтительным сочетанием оснований. См., например, патенты США 6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116 и 6339068. Представители другого класса CpG олигонуклеотидов активируют В-клетки и NK-клетки и индуцируют IFN-α; этот класс был обозначен как С-класс. CpG олигонуклеотиды C-класса, который был охарактеризован первым, как правило, полностью стабилизированы, включают последовательность В-класса и GC-обогащенный палиндром или близкую к палиндрому структуру. Этот класс был описан в совместно рассматриваемой заявке на патент США US 10/224523, поданной 19 августа 2002 года, и в родственной PCT заявке на патент PCT/US02/26468, опубликованной под номером международной публикации WO 03/015711.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы обнаружили, что иммуностимулирующие свойства определенных CpG олигонуклеотидов С-класса, содержащих селективное включение одной или нескольких нестабилизированных связей между определенными нуклеотидами, обладают выраженной активностью и особенно эффективны для лечения аллергии и астмы. Нестабилизированные связи предпочтительно представляют собой природные связи, то есть фосфодиэфирные связи или связи, подобные фосфодиэфирным связям. Обычно нестабилизированная связь, хотя и необязательно, относительно чувствительна к расщеплению нуклеазами. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению включают по меньшей мере одну нестабилизированную связь, расположенную между 5'C и примыкающим 3'G, где и 5'C, и 3'G представляют собой внутренние нуклеотиды.

Иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут использоваться для индукции Тh1 иммунного ответа. Соответственно иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут использоваться в качестве адъювантов для проведения вакцинации, а также могут использоваться для лечения заболеваний, включая рак, инфекционные заболевания, аллергию и астму. Считается, что они особенно эффективны при тех состояниях, когда требуется пролонгированное или повторное введение иммуностимулирующего олигонуклеотида для любой цели, но особенно эффективны для лечения астмы и аллергических заболеваний, таких как аллергический ринит.

Настоящее изобретение также относится к иммуностимулирующим олигонуклеотидам, содержащим CpG. В одном из аспектов настоящее изобретение представляет собой олигонуклеотид формулы: 5' TC_GX₁C_GX₂N₁X₃C_GN₂CG 3' (SEQ ID NO: 26). Этот олигонуклеотид включает по меньшей мере две стабилизированных межнуклеотидных связи. Символ «_» обозначает фосфодиэфирную межнуклеотидную связь или межнуклеотидную связь фосфодиэфирного типа. N₁ представляет собой последовательность длиной 0-3 нуклеотида, N₂ представляет собой последовательность длиной 0-9 нуклеотидов, и N относится к любому нуклеотиду. X₁, X₂ и X₃ представляют собой любой нуклеотид. В некоторых вариантах X₁, X₂ и X₃ представляют собой Т.

В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотид может содержать 5' TC_GTC_GTN₁TC_GGCGCN₁GCCG 3' (SEQ ID NO: 27). В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид может содержать 5' T*C_G*T*C_G*T*N₁*T*C_G*G*C*G*CN₁G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах N₁ имеет длину из 3 или 2 нуклеотидов. В других вариантах N₁ имеет длину из 0 нуклеотидов.

Иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать 5' T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*С*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 2), где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь. Необязательно, в том случае, когда это особо оговаривается, 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.

В других вариантах осуществления иммуностимулирующий олигонуклеотид может содержать 5' T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 3), где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь. Необязательно, в том случае, когда это особо оговаривается, 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.

В другом аспекте иммуностимулирующий олигонуклеотид имеет следующую формулу: TC_GX₁C_GX₂C_GX₃TC_GGCGC_GN₃ 3' (SEQ ID NO: 28).

N₃ представляет собой 1-5 нуклеотидов в длину, где N относится к любому нуклеотиду. В одном из вариантов осуществления N₃ представляет собой 5 нуклеотидов. X₁, X₂ и X₃ обозначает любой нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления X₁ и X₃ представляют собой T.

В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид может содержать: 5' TC_GTC_GAC_GATC_GGCGC_GCGCCG 3' (SEQ ID NO: 4), где олигонуклеотид включает по меньшей мере две стабилизированных межнуклеотидные связи и символ «_» обозначает межнуклеотидную фосфодиэфирную связь или связь типа фосфодиэфирной. В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид может содержать 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 4). Необязательно, в том случае, когда это особо оговорено, 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения иммуностимулирующий олигонуклеотид описывается следующей формулой: 5' TTC_GX₂C_GN₁X₁_GX₃C_GTT 3' (SEQ ID NO: 24). Олигонуклеотид включает по меньшей мере две стабилизированных межнуклеотидных связи и символ «_» обозначает межнуклеотидную фосфодиэфирную связь или связь типа фосфодиэфирной. N₁ представляет собой 1-3 нуклеотида в длину и N относится к любому нуклеотиду. Х₁ представляет собой пиримидин. X₂ и X₃ представляют собой любой нуклеотид. В некоторых вариантах осуществления X₁ и X₃ представляют собой T.

В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид может содержать 5' TTC_GTC_GTTTX₁_GTC_GTT 3' (SEQ ID NO: 25). В другом варианте осуществления олигонуклеотид может содержать 5' T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*Х₁_G*T*C_G*T*T 3' (SEQ ID NO: 25). В некоторых вариантах осуществления X₁ представляет собой T или С.

Олигонуклеотид может содержать 5' T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T 3' (SEQ ID NO: 5), где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь. Необязательно, в том случае, когда это особо оговаривается, 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.

Олигонуклеотид может содержать 5' T*T*T*C_G*T*C_G*T*T*T*C_G*T*C_G*T*T 3' (SEQ ID NO: 6), где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь. Необязательно, в том случае, когда это особо оговаривается, 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.

В некоторых аспектах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотиды описываются одной из приведенных ниже формул: TCGTCGTTCGGCGCGCCG (SEQ ID NO: 3), TCGGTCGTCGTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 2), TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 4), TTCGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 5) или TTTCGTCGTTTCGTCGTT (SEQ ID NO: 6).

В других аспектах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид описывается одной из следующих формул: TCGTCGTC, CGTCGTCG, GTCGTCGT, TCGTCGTT, CGTCGTTC, GTCGTTCG, TCGTTCGG, CGTTCGGC, GTTCGGCG, TTCGGCGC, TCGGCGCG, CGGCGCGC, GGCGCGCG, GCGCGCGC, CGCGCGCC или GCGCGCCG.

В других аспектах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид описывается одной из следующих формул: T*C_G*T*C_G*T*C, C_G*T*C_G*T*C_G, G*T*C_G*T*C_G*T, T*C_G*T*C_G*T*T, C-G*T*C_G*T*T*C, G*T*C_G*T*T*C_G, T*C_G*T*T*C_-G*G, C_G*T*T*C_G*G*C, G*T*T*C_G*G*C*G, T*T*C_-G*G*C*G*C, T*C_G*G*C*G*C_G, C_G*G*C*G*C_G*C, G*G*C*G*C_G*C*G, G*C*G*C_ G*C*G*C, C*G*C_G*C*G*C*C или G*C*_G*C*G*C*C*G.

В других аспектах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид, содержащий: T*C_G*T*C_G*T*C, где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь и символ «_» обозначает межнуклеотидную фосфодиэфирную связь или межнуклеотидную связь типа фосфодиэфирной. Необязательно олигонуклеотид может представлять собой 5' T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C 3' (SEQ ID NO: 21), 5' T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C 3' (SEQ ID NO: 22) или 5' T*C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C 3' (SEQ ID NO: 23), где 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.

В других аспектах осуществления настоящего изобретения описывается олигонуклеотид, содержащий: T*C_G*T*T*C_G*G*, где символ «*» обозначает стабилизированную межнуклеотидную связь и символ «_» обозначает фосфодиэфирную межнуклеотидную связь или межнуклеотидную связь типа фосфодиэфирной. Необязательно указанный олигонуклеотид может представлять собой: 5' C-G*T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 15), 5' G*T*С-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 16), 5' T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 17), 5' С-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 18), 5' G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 19) или 5' T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO: 20), где 5' может относиться к свободному 5' концу олигонуклеотида и 3' может относиться к свободному 3' концу олигонуклеотида.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления композиция входит в состав небулайзера или ингалятора. Ингалятор может представлять собой ингалятор с отмеряемой дозой. Альтернативно, ингалятор представляет собой порошковый ингалятор.

В других вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать химиотерапевтическое средство. В других вариантах композиция может содержать противовирусное средство.

Фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель, введенный в состав композиции для подкожного введения, перорального введения или интраназального введения.

В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид находится в составе фармацевтической композиции, необязательно содержащей фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах олигонуклеотид входит в состав аэрозольной формы препарата.

В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид также содержит адъювант или цитокин.

В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид также содержит антиген, где указанный олигонуклеотид представляет собой адъювант для вакцины.

В одном из вариантов осуществления антиген выбран из группы, состоящей из вирусного антигена, бактериального антигена, грибкового антигена, паразитарного антигена и опухолевого антигена. В одном из вариантов осуществления антиген кодируется нуклеиновой кислотой вектора. В другом варианте осуществления антиген представляет собой пептидный антиген. В одном из вариантов осуществления антиген ковалентно связан с олигонуклеотидом или иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты. В другом варианте осуществления антиген не связан ковалентной связью с олигонуклеотидом или иммуностимулирующей молекулой нуклеиновой кислоты.

В одном из вариантов осуществления фосфодиэфирная связь или связь типа фосфодиэфирной представляет собой фосфодиэфирную связь. В одном из вариантов осуществления связь, подобная фосфодиэфирной, представляет собой боранофосфонатную или диастереомерно чистую Rp фосфоротиоатную связь.

В одном из вариантов осуществления стабилизированный скелет содержит множество межнуклеотидных связей, выбранных из группы, состоящей из фосфоротиоата, фосфородитиоата, метилфосфоната, метилфосфоротиоата и любого их сочетания. В одном из вариантов осуществления стабилизированный скелет содержит множество фосфоротиоатных межнуклеотидных связей.

В одном из вариантов осуществления длина иммуностимулирующей молекулы нуклеиновой кислоты составляет 4-100 нуклеотидов.

В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения астмы путем введения индивидууму с риском развития астмы олигонуклеотида по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения астмы.

В других аспектах настоящее изобретение относится к способу лечения аллергии путем введения индивидууму, страдающему аллергией или имеющему риск ее развития, олигонуклеотида по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения аллергии. В еще одном из вариантов осуществления указанный индивидуум страдает аллергическим ринитом. В одном из вариантов осуществления олигонуклеотид наносят на поверхность слизистой. В других вариантах осуществления олигонуклеотид вводят в виде аэрозольной композиции. Необязательно, олигонуклеотид вводят интраназально.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу индукции образования цитокинов. Этот способ осуществляют путем введения индивидууму CpG олигонуклеотида по настоящему описанию в количестве, эффективном для индукции цитокина, выбранного из группы, состоящей из IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, хемокинов и IFN-γ.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции на основе CpG иммуностимулирующих олигонуклеотидов по настоящему описанию, в сочетании с антигеном или другим терапевтическим соединением, таким как противомикробное средство. Противомикробное средство может представлять собой, например, противовирусное средство, противопаразитарное средство, противобактериальное средство или противогрибковое средство.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к композиции с пролонгированным высвобождением, содержащей CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды по настоящему изобретению.

В составе композиции может необязательно присутствовать фармацевтический носитель, и/или композиция может быть введена в состав средства для доставки. В некоторых вариантах осуществления устройство для доставки выбрано из группы, состоящей из катионных липидов, проникающих в клетку белков, и средств с пролонгированным высвобождением. В одном из вариантов осуществления средство с пролонгированным высвобождением представляет биодеградируемый полимер или микрочастицу.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу стимуляции иммунного ответа. Этот способ включает введение индивидууму CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа у индивидуума. Предпочтительно CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид вводят перорально, применяют местно, вводят в составе средства для пролонгированного высвобождения, наносят на поверхность слизистой, применяют системно, вводят парентерально или внутримышечно. В том случае когда CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид наносят на поверхность слизистой, он может доставляться в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа на слизистой или для индукции системного иммунного ответа. В предпочтительных вариантах осуществления поверхность слизистой выбрана из группы, состоящей из поверхности ротовой полости, назальной, ректальной, вагинальной и глазной поверхности.

В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению включает воздействие на индивидуума антигеном, где иммунный ответ представляет собой антиген-специфический иммунный ответ. В некоторых вариантах антиген выбран из группы, состоящей из опухолевого антигена, вирусного антигена, бактериального антигена, паразитарного антигена и пептидного антигена.

CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды способны провоцировать широкий спектр иммунных ответов. Например, эти CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут использоваться для переадресации иммунного ответа с Th2 на Th1 вариант. CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды могут также использоваться для активации иммунной клетки, такой как лимфоцит (например, В- и Т-клетки), дендритная клетка и NK-клетка. Активация может быть осуществлена in vivo, in vitro или ex vivo, например, путем выделения иммунной клетки из организма индивидуума, приведения указанной иммунной клетки в контакт с эффективным количеством CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида для активации иммунной клетки и повторного введения активированной иммунной клетки индивидууму. В некоторых вариантах осуществления дендритная клетка презентирует раковый антиген. На дендритную клетку можно воздействовать раковым антигеном ex vivo.

Иммунный ответ, продуцируемый CpG иммуностимулирующими олигонуклеотидами, также может привести к индукции образования цитокинов, например, к продукции IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-α, хемокинов и IFN-γ.

В еще одном варианте осуществления CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды применяются для лечения рака. CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды также могут использоваться, в соответствии с другими аспектами настоящего изобретения, для профилактики рака (например, для снижения риска развития рака) у индивидуума, имеющего риск возникновения рака. Рак может быть выбран из группы, состоящей из рака желчных путей, рака молочной железы, рака шейки матки, хориокарциномы, рака толстой кишки, рака эндометрия, рака желудка, внутриэпителиальных неоплазм, лимфом, рака печени, рака легкого (например, многоклеточного и немелкоклеточного рака), меланомы, нейробластом, рака ротовой полости, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака прямой кишки, саркомы, рака щитовидной железы и рака почки, а также из других видов карцином и сарком. В некоторых важных аспектах осуществления настоящего изобретения рак выбран из группы, состоящей из рака кости, рака мозга и ЦНС, рака соединительной ткани, эзофагеального рака, рака глаза, лимфомы Ходжкина, рака гортани, рака ротовой полости, рака кожи и рака яичек.

CpG иммуностимулирующие олигонуклеотиды также могут использоваться для повышения чувствительности раковой клетки на терапию рака (например, противораковую терапию) в том случае, когда CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид вводят в составе курса противораковой терапии. Противораковая терапия может представлять собой химиотерапию, вакцинотерапию (например, при использовании вакцины на основе примированных in vitro дендритных клеток или вакцины на основе ракового антигена) или терапию антителами. Последний вид терапии может также включать введение антитела, специфичного для антигена клеточной поверхности, например, раковой клетки, где указанный иммунный ответ приводит к антителозависимой клеточной токсичности (ADCC). В одном из вариантов осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из Ributaxin, Herceptin, Quadrament, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, анти-VEGF, Zenаpax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, анти-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab и ImmuRAIT-CEA.

Таким образом, в соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения индивидууму, страдающему раком или имеющему риск развития рака, вводят CpG иммуностимулирующий олигонуклеотид и проводят противораковую терапию. В некоторых вариантах осуществления препарат для проведения противораковой терапии выбран из группы, состоящей из химиотерапевтического средства, иммунотерапевтического средства и противораковой вакцины. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство для лечения рака представляет собой таксол или сочетание карбоплатины и паклитаксела.

В другом варианте осуществления способов, направленных на профилактику или лечение рака, индивидууму может также вводиться интерферон-α.

В других аспектах настоящее изобретение относится к способам профилактики заболевания у индивидуума. Этот способ включает введение индивидууму CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида на регулярной основе для усиления чувствительности иммунной системы с целью предупреждения заболевания у индивидуума. Примеры заболеваний или состояний, профилактика которых может проводиться при использовании профилактических способов по настоящему изобретению, включают микробные инфекции (например, болезни, передаваемые половым путем) и анафилактический шок, развивающийся в результате пищевой аллергии.

В других аспектах настоящее изобретение относится к способу индукции врожденного иммунного ответа путем введения индивидууму CpG иммуностимулирующего олигонуклеотида в количестве, эффективном для активации врожденного иммунного ответа.

В соответствии с другим аспектом осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики вирусной или ретровирусной инфекции. Указанный способ включает введение индивидууму с вирусной или ретровирусной инфекцией или имеющему риск ее развития любой композиции по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или профилактики вирусной или ретровирусной инфекции. В некоторых вариантах вирусное заболевание вызвано вирусом гепатита, например гепатита В, гепатита С, HIV, вирусом герпеса или папилломавирусом.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения бактериальной инфекции. Этот способ включает введение индивидууму с бактериальной инфекцией или имеющему риск ее развития любой композиции по настоящему изобретению в количестве, эффективном для предупреждения бактериальной инфекции. В одном из вариантов осуществления бактериальная инфекция развивается за счет внутриклеточных бактерий.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики паразитарной инфекции путем введения индивидууму, страдающему паразитарной инфекцией или имеющим риск ее развития, любой композиции по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или предупреждения паразитарной инфекции. В одном из вариантов осуществления паразитарная инфекция развивается за счет внутриклеточного паразита. В другом варианте паразитарная инфекция развивается за счет паразита негельминтной природы.

В некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека, и в других вариантах указанный индивидуум представляет собой позвоночный организм, отличный от человека, выбранный из группы, состоящей из собаки, кошки, лошади, коровы, свиньи, индейки, козы, рыбы, обезьяны, курицы, крысы, мыши и овцы.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу индукции Th1 иммунного ответа путем введения индивидууму любой композиции по настоящему изобретению в количестве, эффективном для продукции Th1 иммунного ответа.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения аутоиммунного заболевания путем введения индивидууму, страдающему аутоиммунным заболеванием или имеющему риск его развития, любой композиции по настоящему изобретению в количестве, эффективном для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид вводят индивидууму в количестве, эффективном для индукции экспрессии цитокинов. Цитокин необязательно может быть выбран из группы, состоящей из IL-6, TNFα, IFNα, IFNγ и IP-10. В других вариантах осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид вводят индивидууму в количестве, эффективном для сдвига иммунного ответа в направлении Th1 от Тh2 ответа.

В некоторых аспектах изобретение относится к способу лечения путем ремоделирования дыхательных путей, включающего введение индивидууму олигонуклеотида, включающего CG динуклеотид в количестве, эффективном для ремоделирования дыхательных путей у индивидуума. В одном из вариантов осуществления указанный пациент имеет астму, хроническую обструктивную болезнь легких или является курильщиком. В других вариантах осуществления указанный индивидуум не имеет симптомов астмы.

В качестве одного из аспектов настоящего изобретения предлагается использование олигонуклеотида по изобретению для стимуляции иммунного ответа.

Предлагается также использование олигонуклеотида по настоящему изобретению для производства лекарственного средства для стимуляции иммунного ответа и осуществления любого из способов по настоящему изобретению.

Каждый ограничивающий пункт изобретения может иметь различные варианты осуществления изобретения. В этой связи понятно, что каждое такое ограничение изобретения, включающее любой элемент или сочетание элементов, может относиться к каждому из аспектов настоящего изобретения.

Краткое описание чережей

На фиг.1 показана серия графиков, отражающих индукцию INF-альфа РВМС человека, обработанных CpG ODN.

На фиг.2 показана серия графиков, отражающих эффекты CpG олигодезоксинуклеотида SEQ ID NO: 7 против антиген-индуцированного повышения назальной резистентности у морских свинок при введении дозы (А) 1 мг/кг и (В) (0,03 мг/кг). Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО ((A)=n=5-8; (B)=n=14-15). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой, которой после провокации антигеном вводили исследуемый носитель (t-тест).

На фиг.3 показана серия графиков, отражающих эффекты CpG олигодезоксинуклеотида SEQ ID NO: 7 на антиген-индуцированный насморк (3А) и заложенность носа (3В) на модели мышей с аллергическим ринитом. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=10). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой, которой вводили носитель (тест Манн-Уитни).

На фиг.4 показан график, демонстрирующий результаты титрования вируса гриппа и определения временных параметров развития инфекции. Показанное количество клеток бронхоальвеолярного лаважа. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=5). Мышей, инфицированных дозой 500 EID₅₀, умерщвляют через 6 дней из-за потери веса.

На фиг.5 показан график, демонстрирующий защитные эффекты CpG ODN на вирусную нагрузку в легких. Вирусную нагрузку оценивают методом ферментативного иммуноанализа. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=5-10). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой В (тест Крускала-Валлиса (Kruskal-Wallis), пост-тест Данна (Dunn)). n.d = нет данных.

На фиг.6 показана серия графиков, отражающих защитные эффекты CpG ODN на индуцируемое вирусом воспаление дыхательных путей, по результатам определения общего числа лейкоцитов (6А), общего числа нейтрофилов (6В) и общего числа мононуклеарных клеток (6С). Показано число клеток в бронхоальвеолярном лаваже. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=10). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой В (тест Крускала-Валлиса, пост-тест Данна).

На фиг.7 показана серия графиков, отражающих защитные эффекты CpG ODN на число клеток при антиген-индуцированном воспалении дыхательных путей, по числу эозинофилов (7А) и нейтрофилов (7В). Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=10-14). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой, которой после провокации антигеном вводили носитель (множественный тест сравнения Крускала-Валлиса, пост-тест Данна).

На фиг.8 показана серия графиков, отражающих защитные эффекты CpG ODN на число клеток CD3⁺ (8A) и СD3⁺СD4⁺ (8В) при воспалении дыхательных путей, индуцированном антигеном. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=8). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой, которой после провокации антигеном вводили носитель (множественный тест сравнения Крускала-Валлиса, пост-тест Данна).

На фиг.9 показана серия графиков, отражающих число клеток в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (9А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (9В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (9С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (9D). Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=10).

На фиг.10 показана серия графиков, отражающих концентрации IFN-альфа в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (10А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (10В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (10С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (10D).

На фиг.11 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IFN-гамма в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (11А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (11В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (11С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (11D).

На фиг.12 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IP-10 в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (12А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (12В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (12С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (12D).

На фиг.13 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IL-12p40 в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (13А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (13В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (13С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (13D).

На фиг.14 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IL-6 в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (14А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (14В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (14С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (14D).

На фиг.15 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации TNF-альфа в бронхоальвеолярном лаваже через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (15А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (15В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (15С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (15D).

На фиг.16 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IFN-гамма в сыворотке крови через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (16А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (16В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (16С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (16D).

На фиг.17 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации IL-6 в сыворотке крови через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (17А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (17В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (17С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (17D).

На фиг.18 показана серия графиков, демонстрирующих концентрации TNF-альфа в сыворотке крови после через 8 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (18А); через 15 часов после введения дозы 0,1 мг/кг ODN (18В); через 8 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (18С); и через 15 часов после введения дозы 1 мг/кг ODN (18D).

На фиг.19 показана серия графиков, демонстрирующих эффекты CpG олигодезоксинуклеотидов ODN SEQ ID NO: 2 и ODN SEQ ID NO: 7 на продукцию антиген-индуцированного IgE (19A) и IgG2a (19B) у мыши. Результаты представлены в виде среднего значения ±СКО (n=10). Значение *P<0,05 дано в сравнении с группой животных, которых подвергли сенсибилизации антигеном и лечению носителем (тест Крускала-Валлиса (Kruskal-Wallis) с пост-тестом Данна (Dunn)).

На фиг.20 показана серия графиков, демонстрирующих эффекты ODN SEQ ID NO: 2 против обострения аллергического воспаления дыхательных путей у мышей, индуцированного гриппом, по общему числу лейкоцитов (20А), эозинофилов (20В), нейтрофилов (20С), мононуклеарных клеток (20D) и по весу тела (20Е).

На фиг.21 описан протокол AHR, использованный в экспериментах на морских свинках.

На фиг.22 показана серия графиков, демонстрирующих эффект SEQ ID NO: 7 на резистентность дыхательных путей и эластичность легких. Для каждого животного построена кривая зависимости доза-ответ, и реактивность дыхательных путей оценивается количественно в виде площади под кривой. Морским свинкам вводят внутриназально либо носитель (солевой раствор), либо один OVA, либо в/т SEQ ID NO: 7 в дозах 10 мкл/кг, 30 мкл/кг, 100 мкл/кг или 300 мкл/кг. Приведенные данные показывают, что SEQ ID NO: 7 вызывает зависимое от дозы снижение AUC-резистентности. На фиг. 22А и 22В показано высвобождение гистамина в виде функции повышенной резистентности дыхательных путей (22А) или снижения эластичности легких (22B). На фиг. 22С и 22D показаны диаграммы, демонстрирующие повышение резистентности дыхательных путей (22С) или снижение эластичности легких (22В) в результате лечения солевым раствором, OVA или SEQ ID NO: 7 в указанных дозировках.

На фиг.23 приведено краткое описание протокола статистического анализа, примененного в настоящем изобретении (фиг.22) для оценки резистентности дыхательных путей (23А) и эластичности легких (23В).

На фиг.24 показана серия графиков, демонстрирующих эффект SEQ ID NO: 2 на резистентность дыхательных путей и эластичность легких. Для каждого животного построен график зависимости доза-ответ, и реактивность дыхательных путей оценивают количественно в виде площади под кривой. Морским свинкам вводят интраназально либо носитель (солевой раствор), либо один OVA, либо в/т SEQ ID NO: 2 в дозах 10 мкл/кг, 30 мкл/кг, 100 мкл/кг или 300 мкл/кг. Приведенные данные показывают, что SEQ ID NO: 2 вызывает зависимое от дозы снижение AUC-резистентности. На фиг. 24А и 24В показано высвобождение гистамина в виде функции повышенной резистентности дыхательных путей (24А) или снижения эластичности легких (24B). На фиг. 24С и 24D показаны диаграммы, демонстрирующие повышение резистентности дыхательных путей (24С) или снижение эластичности легких (24D) в результате лечения солевым раствором, OVA или SEQ ID NO: 2 в указанных дозировках.

На фиг.25 приведено краткое описание использованного в данном изобретении статистического анализа (фиг.24) для оценки резистентности дыхательных путей (25А) и эластичности легких (25В).

На фиг.26 приведено краткое описание графиков на фиг. 22 и 24. Фиг. 26A и 26B соответствуют фиг. 22C и 22D. Фиг. 26C 26D соответствуют фиг. 24C и 24D.

На фиг.27 показана серия графиков, демонстрирующих уровни IL-10 (пг/мл) секретированных из человеческих РВМС (3 донора) после экспонирования этих клеток в течение 48 часов с олигонуклеотидами, перечисленными как SEQ ID NO внизу на оси Х графика (приведенные данные для 3 доноров обозначены как ▲, ■ и x). Исследованные олигонуклеотиды, показанные на фиг.27, включают SEQ ID NO: 10, 9, 13, 14, 1 и 2. Концентрация олигонуклеотида, соответствующ