Полипептиды с противомикробной активностью и кодирующие их полинуклеотиды

Полипептиды с противомикробной активностью и кодирующие их полинуклеотиды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам с противомикробной активностью и к выделенным полинуклеотидам, кодирующим полипептиды. Это изобретение относится также к конструкциям нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды, а также к способам получения и применения полипептидов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является предоставление полипептидов с противомикробной активностью и кодирующих полипептиды полинуклеотидов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам с противомикробной активностью, выбранным из группы, состоящей из

(a) полипептида с аминокислотной последовательностью, которая имеет по меньшей мере 60% идентичность аминокислотам 1-42 последовательности SEQ ID NO:2;

(b) полипептида, который кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в условиях по меньшей мере умеренной жесткости (i) с нуклеотидами 145-270 последовательности SEQ ID NO:1, (ii) с последовательностью кДНК, которая содержится в нуклеотидах 1-270 в последовательности SEQ ID NO:1, или (iii) с цепью, комплементарной (i) или (ii); и

(c) варианта, содержащего консервативную замену, делецию, и/или вставку одной или нескольких аминокислот в аминокислотах 1-42 в последовательности SEQ ID NO:2.

Настоящее изобретение относится также к выделенным полинуклеотидам, кодирующим полипептиды с противомикробной активностью, выбранным из группы, состоящей из

(a) полинуклеотида, кодирующего полипептид с аминокислотной последовательностью, которая имеет меньшей мере 60% идентичность аминокислотам 1-42 последовательности SEQ ID NO:2;

(b) полинуклеотида, имеющего по меньшей мере 60% идентичность нуклеотидам 145-270 последовательности SEQ ID NO:1; и

(c) полинуклеотида, который гибридизуется в условиях по меньшей мере умеренной жесткости (i) с нуклеотидами 145-270 последовательности SEQ ID NO:1, (ii) с последовательностью кДНК, которая содержится в нуклеотидах 1-270 последовательности SEQ ID NO:1, или (iii) с цепью, комплементарной (i) или (ii).

Настоящее изобретение относится также к конструкциям нуклеиновых кислот, рекомбинантным экспрессирующим векторам и рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды.

Настоящее изобретение относится также к способам получения таких полипептидов с противомикробной активностью, включающим в себя (a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид, в условиях, способствующих продукции полипептида; и (b) выделение полипептида.

Настоящее изобретение относится также к способам применения полипептидов и полинуклеотидов согласно изобретению.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Противомикробная активность: В настоящем описании термин "противомикробная активность" определяют как активность, которая способна вызывать гибель или ингибировать рост микробных клеток. В контексте настоящего изобретения подразумевают, что термин "противомикробный" означает существование бактерицидного и/или бактериостатического, и/или фунгицидного и/или фунгистатического, и/или вироцидного эффекта, где термин "бактерицидный" следует понимать, как способный убивать бактериальные клетки. Термин "бактериостатический" следует понимать, как способный ингибировать рост бактерий, т.е. ингибирующий рост бактериальных клеток. Термин "фунгицидный" следует понимать, как способный убивать клетки грибов. Термин "фунгистатический" следует понимать, как способный ингибировать рост грибов, т.е. ингибирующий рост клеток грибов. Термин "вироцидный" следует понимать, как способный инактивировать вирус. Термином "микробные клетки" обозначают бактериальные клетки или клетки грибов (включая дрожжи).

В контексте настоящего изобретения подразумевают, что термин "ингибирующий рост микробных клеток" означает, что клетки находятся в нерастущем состоянии, т.е., что они не способны размножаться. Для целей настоящего изобретения противомикробную активность можно определять в соответствии со способом, описанным Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991). Альтернативно противомикробную активность можно определять в соответствии с руководствами NCCLS из CLSI (Институт клинических и лабораторных стандартов; ранее известный как Национальный комитет по клиническим и лабораторным стандартам).

Полипептиды с противомикробной активностью могут обладать способностью снижать количество живых клеток Escherichia coli (DSM 1576) до 1/100 через 8 часов (предпочтительно через 4 часа, более предпочтительно через 2 часа, наиболее предпочтительно через 1 час, и, особенно, через 30 минут) инкубации при 20°C в водном растворе 25% (масс./масс.); предпочтительно в водном растворе 10% (масс./масс.); более предпочтительно в водном растворе 5% (масс./масс.); более предпочтительно в водном растворе 1% (масс./масс.); наиболее предпочтительно в водном растворе 0,5% (масс./масс.); и, особенно, в водном растворе 0,1% (масс./масс.) полипептидов с противомикробной активностью.

Полипептиды с противомикробной активностью также могут обладать способностью ингибировать рост Escherichia coli (DSM 1576) в течение 24 часов при 25°C в субстрате для микробного роста при добавлении в концентрации 1000 миллионных долей; предпочтительно при добавлении в концентрации 500 миллионных долей; более предпочтительно при добавлении в концентрации 250 миллионных долей; более предпочтительно при добавлении в концентрации 100 миллионных долей; наиболее предпочтительно при добавлении в концентрации 50 миллионных долей; и, особенно, при добавлении в концентрации 25 миллионных долей.

Полипептиды с противомикробной активностью могут обладать способностью снижать количество живых клеток Bacillus subtilis (ATCC 6633) до 1/100 через 8 часов (предпочтительно через 4 часа, более предпочтительно через 2 часа, наиболее предпочтительно через 1 час, и, особенно, через 30 минут) инкубации при 20°C в водном растворе 25% (масс./масс.); предпочтительно в водном растворе 10% (масс./масс.); более предпочтительно в водном растворе 5% (масс./масс.); более предпочтительно в водном растворе 1% (масс./масс.); наиболее предпочтительно в водном растворе 0,5% (масс./масс.); и, особенно, в водном растворе 0,1% (масс./масс.) полипептидов с противомикробной активностью.

Полипептиды с противомикробной активностью также могут обладать способностью ингибировать рост Bacillus subtilis (ATCC 6633) в течение 24 часов при 25°C в субстрате для микробного роста, при добавлении в концентрации 1000 миллионных долей; предпочтительно при добавлении в концентрации 500 миллионных долей; более предпочтительно при добавлении в концентрации 250 миллионных долей; более предпочтительно при добавлении в концентрации 100 миллионных долей; наиболее предпочтительно при добавлении в концентрации 50 миллионных долей; и, особенно, при добавлении в концентрации 25 миллионных долей.

Полипептиды согласно изобретению имеют по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 100% противомикробную активность полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в качестве аминокислот 1-42 последовательности SEQ ID NO:2.

Дефензин: Как используют в настоящем описании, термин "дефензин" относится к полипептидам, известным специалистам в данной области, которые принадлежат к классу противомикробных пептидов дефензинов. Для того чтобы определить, является ли полипептид дефензином в соответствии с этим изобретением, аминокислотную последовательность предпочтительно сравнивают с профилями скрытых марковских моделей (профилями HMM) базы данных PFAM с использованием общедоступного программного обеспечения HMMER (см. пример 6).

Семейства дефензина PFAM включают дефензин_1 или "дефензин млекопитающих" (регистрационный no. PF00323), дефензин_2 или "дефензин членистоногих" (регистрационный no. PF01097), дефензин_бета или "бета-дефензин" (регистрационный no. PF00711), дефензин_propep или "пропептид дефензина" (регистрационный no. PF00879) и гамма-тионин или "семейство гамма-тионинов" (регистрационный no. PF00304).

Дефензины могут относиться к классу альфа-дефензина, к классу бета-дефензина, к классу тета-дефензина, к классу дефензина насекомых (членистоногих), к классу дефензина растений, к классу дефензина двустворчатых моллюсков или к другим классам дефензина, где аминокислотная последовательность содержит 6 или 8 цистеинов, и которые обладают структурным сходством с любым из упомянутых ранее классов дефензина. Дефензины также могут представлять собой синтетические дефензины, обладающие общими с любым из классов дефензина характерными свойствами.

Примеры таких дефензинов включают, но не ограничиваются ими, α-дефензин HNP-1 (пептид нейтрофилов человека) HNP-2 и HNP-3; β-дефензин-12, дрозомицин, гелиомицин, γ1-пуротионин, дефензин насекомых A и дефензины, описанные в заявках PCT WO 99/53053, WO 02/085934 и WO 03/044049.

Выделенный полипептид: Как используют в настоящем описании, термин "выделенный полипептид" относится к полипептиду, который является по меньшей мере на 20% чистым, предпочтительно по меньшей мере на 40% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 60% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 80% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 90% чистым, и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% чистым, как определяют посредством SDS-PAGE.

По существу чистый полипептид: В настоящем описании термин "по существу чистый полипептид" означает препарат полипептида, который содержит не более 10%, предпочтительно не более 8%, более предпочтительно не более 6%, более предпочтительно не более 5%, более предпочтительно не более 4%, не более 3%, более предпочтительно не более 2%, более предпочтительно не более 1%, и наиболее предпочтительно не более 0,5% по массе других полипептидных веществ, с которыми он ассоциирован в природе. Таким образом, предпочтительно, чтобы по существу чистый полипептид являлся по меньшей мере на 92% чистым, предпочтительно по меньшей мере на 94% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 95% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 96% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 96% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 97% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 98% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5% чистым, и наиболее предпочтительно на 100% чистым по массе от общего полипептидного вещества, находящегося в препарате.

Полипептиды согласно изобретению предпочтительно находятся по существу в чистой форме. В частности, предпочтительно, чтобы полипептиды находились "по существу в чистой форме", т.е., чтобы препарат полипептида по существу не содержал других полипептидных веществ, с которыми он ассоциирован в природе. Этого можно достигать, например, посредством получения полипептида посредством хорошо известных рекомбинантных способов или классических способов очистки.

В настоящем описании термин "по существу чистый полипептид" является синонимом терминов "выделенный полипептид" и "полипептид в выделенной форме".

Идентичность: Сходство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывают посредством параметра "идентичность".

Для целей настоящего изобретения степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определять с использованием программы FASTA, которая включена в версию 2.0x пакета программ FASTA (см. W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; и W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). Используемая оценочная матрица представляла собой BLOSUM50, штраф за делецию составлял -12, и штраф за продолжение делеции составлял -2.

Степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием указанного алгоритма и комплекта программного обеспечения, как описано выше. Используемая оценочная матрица представляла собой матрицу идентичности, штраф за делецию составлял -16, и штраф за продолжение делеции составлял -4.

Альтернативно выравнивание двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием программы Needle из пакета EMBOSS (http://emboss.org) версии 2.8.0. Программа Needle выполняет алгоритм общего выравнивания, описанный в Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. Используемая подстановочная матрица представляет собой BLOSUM62, штраф за внесение делеции составляет 10, и штраф за продолжение делеции составляет 0,5.

Степень идентичности между аминокислотной последовательностью по настоящему изобретению ("последовательностью согласно изобретению"; например, аминокислоты 1-42 последовательности SEQ ID NO:2) и другой аминокислотной последовательностью ("чужеродной последовательностью") вычисляют как количество точных совпадений при выравнивании двух последовательностей, разделенное на длину "последовательности согласно изобретению" или на длину "чужеродной последовательности", исходя из того, какая из них короче. Результаты выражают в виде процентной идентичности.

Точное совпадение происходит, если "последовательность согласно изобретению" и "чужеродная последовательность" обладают идентичными аминокислотными остатками в одинаковых положениях перекрывающегося участка (в примере выравнивания, представленном ниже, они изображены посредством "|"). Длина последовательности представляет собой количество аминокислотных остатков в последовательности (например, длина для аминокислот 1-42 в последовательности SEQ ID NO:2 составляет 42).

В примере выравнивания, представленном ниже, перекрывающийся участок представляет собой аминокислотную последовательность "HTWGER-NL" последовательности 1; или аминокислотную последовательность "HGWGEDANL" последовательности 2. В примере делеция обозначена посредством "-".

Пример выравнивания

Фрагмент полипептида: В настоящем описании термин "фрагмент полипептида" определяют, как полипептид, обладающий одной или несколькими аминокислотами, удаленными с N-конца и/или C-конца SEQ ID NO:2 или гомологичной ей последовательности, где фрагмент обладает противомикробной активностью. Предпочтительно фрагмент полипептида согласно изобретению сохраняет все остатки цистеина и аминокислотные остатки между остатками цистеина.

Подпоследовательность: В настоящем описании термин "подпоследовательность" определяют как нуклеотидную последовательность, обладающую одним или несколькими нуклеотидами, удаленными с 5'-конца и/или 3'-конца SEQ ID NO:1 или гомологичной ей последовательности, где подпоследовательность кодирует фрагмент полипептида, обладающий противомикробной активностью.

Аллельный вариант: В настоящем описании термин "аллельный вариант" означает любые две или более альтернативные формы гена, занимающие один и тот же локус на хромосоме. Аллельное разнообразие возникает в природе вследствие мутации и может приводить к полиморфизму в популяциях. Мутации генов могут быть молчащими (нет изменений в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, обладающие измененными аминокислотными последовательностями. Аллельный вариант полипептида представляет собой полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.

По существу чистый полинуклеотид: В настоящем описании термин "по существу чистый полинуклеотид" относится к препарату полинуклеотида, не содержащему других посторонних или ненужных нуклеотидов и находящемуся в форме, пригодной для применения в системах продукции белков способами генетической инженерии. Таким образом, по существу чистый полинуклеотид содержит не более 10%, предпочтительно не более 8%, более предпочтительно не более 6%, более предпочтительно не более 5%, более предпочтительно не более 4%, более предпочтительно не более 3%, более предпочтительно не более 2%, более предпочтительно не более 1%, и наиболее предпочтительно не более 0,5% по массе других полинуклеотидных веществ, с которыми он ассоциирован в природе. По существу чистый полинуклеотид может, однако, включать природные 5'- и 3'-нетранслируемые области, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительно, чтобы по существу чистый полинуклеотид являлся по меньшей мере на 90% чистым, предпочтительно по меньшей мере на 92% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 94% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 95% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 96% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 97% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 98% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 99% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99,5% чистым по массе. Полинуклеотиды согласно изобретению предпочтительно находятся по существу в чистой форме. В частности, предпочтительно, чтобы полинуклеотиды, описанные в настоящем описании, находились "по существу в чистой форме", т.е., чтобы препарат полинуклеотида по существу не содержал других полинуклеотидных веществ, с которыми он ассоциирован в природе. В настоящем описании термин "по существу чистый полинуклеотид" является синонимом терминов "выделенный полинуклеотид" и "полинуклеотид в выделенной форме". Полинуклеотиды могут представлять собой полинуклеотиды геномного происхождения, полинуклеотиды из кДНК, из РНК, полусинтетического, синтетического происхождения или любые их сочетания.

кДНК: В настоящем описании термин "кДНК" определяют как молекулу ДНК, которую можно получать посредством обратной транскрипции из зрелой сплайсированной молекулы мРНК, полученной из эукариотической клетки. В кДНК отсутствуют последовательности интронов, которые обычно представлены в соответствующей геномной ДНК. Исходный первичный транскрипт РНК представляет собой предшественник мРНК, который подвергается процессингу посредством ряда стадий перед образованием зрелой сплайсированной мРНК. Эти стадии включают удаление последовательностей интронов в процессе, называемом сплайсингом. Источником кДНК является мРНК, в которой, таким образом, отсутствуют какие-либо последовательности интронов.

Конструкция нуклеиновой кислоты: В настоящем описании термин "конструкция нуклеиновой кислоты" относится к молекуле нуклеиновой кислоты либо одноцепочечной, либо двухцепочечной, которая выделена из природного гена или которая модифицирована, чтобы содержать сегменты нуклеиновых кислот, способом, который в ином случае не встречается в природе. Термин конструкция нуклеиновой кислоты является синонимом термина "экспрессирующая кассета", когда конструкция нуклеиновой кислоты содержит контролирующие последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности согласно изобретению.

Контролирующая последовательность: В настоящем описании термин "контролирующие последовательности" определяют, как включающие все компоненты, которые необходимы для экспрессии или способствуют экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид согласно изобретению. Каждая контролирующая последовательность может представлять собой собственную или чужеродную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид. Такие контролирующие последовательности включают, но не ограничиваются ими, лидерную последовательность, последовательность полиаденилирования, последовательность пропептида, промотор, последовательность сигнального пептида, и терминатор транскрипции. Контролирующие последовательности включают, по меньшей мере, промотор и транскрипционный и трансляционный стоп-сигналы. В целях введения конкретных участков рестрикции, облегчающих лигирование контролирующих последовательностей с кодирующей областью нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, в контролирующих последовательностях могут быть предусмотрены линкеры.

Функционально связанный: В настоящем описании термин "функционально связанный" означает конфигурацию, в которой контролирующая последовательность помещена в соответствующем положении относительно кодирующей последовательности полинуклеотидной последовательности, чтобы контролирующая последовательность управляла экспрессией кодирующей последовательности полипептида.

Кодирующая последовательность: В настоящем описании термин "кодирующая последовательность" означает нуклеотидную последовательность, которая непосредственно определяет аминокислотную последовательность ее белкового продукта. Границы кодирующей последовательности, как правило, определяют по открытой рамке считывания, которая, как правило, начинается с инициирующего кодона ATG или альтернативных инициирующих кодонов, таких как GTG и TTG. Кодирующая последовательность может представлять собой ДНК, кДНК или рекомбинантную нуклеотидную последовательность.

Экспрессия: Термин "экспрессия" включает в себя любую стадию, вовлеченную в продукцию полипептида, включая, но не ограничиваясь ими, транскрипцию, посттранскрипционную модификацию, трансляцию, посттрансляционную модификацию и секрецию.

Экспрессирующий вектор: В настоящем описании термин "экспрессирующий вектор" определяют как линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид согласно изобретению, и которая функционально связана с дополнительными нуклеотидами, которые обеспечивают экспрессию.

Клетка-хозяин: В настоящем описании термин "клетка-хозяин" включает в себя клетку любого типа, поддающуюся трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п. конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид согласно изобретению.

Модификация: В настоящем описании термин "модификация" означает любую химическую модификацию полипептида, состоящего из аминокислот 1-42 последовательности SEQ ID NO:2, а также генетическое воздействие на ДНК, кодирующую этот полипептид. Модификация(и) могут представлять собой замену(ы), делецию(и) и/или вставку(и) аминокислоты(аминокислот), а также перестановку(и) боковой цепи(ей) аминокислот; или использование в аминокислотной последовательности неприродных аминокислот со сходными свойствами. В частности, модификация(и) может представлять собой амидирование, такое как C-концевое амидирование.

Искусственный вариант: В настоящем описании термин "искусственный вариант" означает полипептид, обладающий противомикробной активностью, продуцируемый организмом, экспрессирующим модифицированную нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1. Модифицированную нуклеотидную последовательность получают путем модификации нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO:1, посредством вмешательства человека.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полипептиды с противомикробной активностью

В первом аспекте настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим аминокислотной последовательностью, которая обладает степенью идентичности с аминокислотами 1-42 последовательности SEQ ID NO:2 (т.е. со зрелым полипептидом) по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 95%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 97%, которые имеют противомикробную активность (в дальнейшем "гомологичные полипептиды"). В предпочтительном аспекте гомологичные полипептиды обладают аминокислотной последовательностью, которая отличается на десять аминокислот, предпочтительно на пять аминокислот, более предпочтительно, на четыре аминокислоты, более предпочтительно, на три аминокислоты, более предпочтительно, на две аминокислоты, и наиболее предпочтительно, на одну аминокислоту от аминокислот 1-42 последовательности SEQ ID NO:2.

Полипептид согласно изобретению предпочтительно содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее аллельный вариант; или ее фрагмент, который обладает противомикробной активностью. В предпочтительном аспекте полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте, полипептид содержит аминокислоты 1-42 последовательности SEQ ID NO:2, или ее аллельный вариант; или ее фрагмент, который обладает противомикробной активностью. В другом предпочтительном аспекте полипептид содержит аминокислоты 1-42 последовательности SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или ее аллельного варианта; или ее фрагмента, который обладает противомикробной активностью. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 1-42 последовательности SEQ ID NO:2 или ее аллельного варианта; или ее фрагмента, который обладает противомикробной активностью. В другом предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот 1-42 последовательности SEQ ID NO:2.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам с противомикробной активностью, которые кодируются полинуклеотидами, которые гибридизуются в условиях очень низкой жесткости, предпочтительно в условиях низкой жесткости, более предпочтительно, в условиях умеренной жесткости, более предпочтительно, в условий средневысокой жесткости, более предпочтительно, в условиях высокой жесткости, и наиболее предпочтительно, в условиях очень высокой жесткости, (i) с нуклеотидами 145-270 последовательности SEQ ID NO:1, (ii) с последовательностью кДНК, содержащейся между нуклеотидами 1-270 последовательности SEQ ID NO:1, (iii) с подпоследовательностью (i) или (ii), или (iv) комплементарной (i), (ii), или (iii) цепью (J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). Подпоследовательность SEQ ID NO:1 содержит по меньшей мере 100 смежных нуклеотидов или предпочтительно по меньшей мере 200 смежных нуклеотидов. Более того, подпоследовательность может кодировать фрагмент полипептида, который обладает противомикробной активностью. Нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или ее подпоследовательность, а также аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или ее фрагмент можно использовать для создания зонда нуклеиновой кислоты для выявления и клонирования ДНК, кодирующей полипептиды с противомикробной активностью, в штаммах различных родов или видов в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. В частности, такие зонды можно использовать для гибридизации с геномной или кДНК представляющего интерес рода или вида, с последующим стандартным способом саузерн-блоттинга, в целях выявления и выделения из них соответствующего гена. Такие зонды могут быть значительно короче полной последовательности, но их длина должна составлять по меньшей мере 14, предпочтительно по меньшей мере 25, более предпочтительно по меньшей мере 35 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 70 нуклеотидов. Однако предпочтительно, чтобы длина зонда нуклеиновой кислоты составляла по меньшей мере 100 нуклеотидов. Например, зонд нуклеиновой кислоты может составлять по меньшей мере 200 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 270 нуклеотидов. Можно использовать как ДНК, так и РНК зонды. Для выявления соответствующего гена зонды, как правило, являются мечеными (например, ³²P, ³H, ³⁵S, биотином или авидином). Такие зонды охватываются настоящим изобретением.

Для геномных библиотек ДНК или кДНК, полученных из таких других организмов, можно, таким образом, проводить скрининг на ДНК, которая гибридизуется с зондами, описанными выше, и которая кодирует полипептид с противомикробной активностью. Геномную или другую ДНК из таких других организмов можно выделять посредством гель-электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, или посредством других способов выделения. ДНК из библиотек или выделенную ДНК можно переносить и иммобилизовывать на нитроцеллюлозе или другом пригодном носителе. В целях выявления клона или ДНК, которая является гомологичной SEQ ID NO:1 или ее подпоследовательности, носитель используют в саузерн-блоте.

Для целей настоящего изобретения гибридизация показывает, что нуклеотидная последовательность гибридизуется с меченым зондом нуклеиновой кислоты, соответствующим нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, с комплементарной ей цепью, или с ее подпоследовательностью, в условиях очень от очень низкой до очень высокой жесткости. Молекулы, с которыми зонд нуклеиновой кислоты гибридизуется в этих условиях, можно определять с использованием рентгеновской пленки.

В предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид SEQ ID NO:2 или его подпоследовательность. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой SEQ ID NO:1. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты представляет собой участок SEQ ID NO:1, кодирующий зрелый полипептид.

Для длинных зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов, условия от очень низкой до очень высокой жесткости, определяются как предгибридизация и гибридизация при 42°C в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 мкг/мл расщепленной и денатурированной ДНК спермы лосося, и либо 25% формамид для очень низкой и низкой жесткости, 35% формамид для средней и средневысокой жесткости, или 50% формамид для высокой и очень высокой жесткости, с последующим процессом саузерн-блоттинга оптимально в течение от 12 до 24 часов.

Для длинных зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов, носитель в конце промывают три раза, каждый по 15 минут, с использованием 2X SSC, 0,2% SDS предпочтительно по меньшей мере при 45°C (очень низкая жесткость), более предпочтительно по меньшей мере при 50°C (низкая жесткость), более предпочтительно по меньшей мере при 55°C (средняя жесткость), более предпочтительно по меньшей мере при 60°C (средневысокая жесткость), более предпочтительно по меньшей мере при 65°C (высокая жесткость), и наиболее предпочтительно по меньшей мере при 70°C (очень высокая жесткость).

Для коротких зондов, длина которых составляет от приблизительно 15 нуклеотидов до приблизительно 70 нуклеотидов, условия жесткости определяются как предгибридизация, гибридизация, и промывание после гибридизации при температуре, которая на от приблизительно 5°C до приблизительно 10°C ниже Tm, вычисленной с использованием вычисления в соответствии Bolton and McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390), в 0,9 M NaCl, 0,09 M Трис-HCl pH 7,6, 6 мМ ЭДТА, 0,5% NP-40, 1X растворе Денхарда, 1 мМ пирофосфате натрия, 1 мМ одноосновном фосфате натрия, 0,1 мМ ATP, и 0,2 мг РНК дрожжей на мл в соответствии со стандартным способом саузерн-блоттинга. Для коротких зондов, длина которых составляет от приблизительно 15 нуклеотидов до приблизительно 70 нуклеотидов, носитель промывают однократно в 6X SCC плюс 0,1% SDS в течение 15 минут и дважды в течение 15 с использованием 6X SSC при температуре, ниже вычисленной Tm на от 5°C до 10°C.

В третьем аспекте настоящее изобретение относится к искусственным вариантам, содержащим консервативную замену, делецию и/или вставку одной или нескольких аминокислот SEQ ID NO:2 или ее зрелого полипептида. Предпочтительно, аминокислотные изменения по своей природе представляют собой незначительные изменения, а именно, консервативные аминокислотные замены или вставки, которые не влияют значительно на сворачивание и/или активность белка; небольшие делеции, как правило, от одной до приблизительно 30 аминокислот; небольшие N- или C-концевые удлинения, такие как N-концевой остаток метионина; небольшой линкерный пептид из вплоть до приблизительно 20-25 остатков; или небольшое удлинение, которое упрощает очистку посредством изменения суммарного заряда или другой функции, такое как полигистидиновый участок, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Примерами консервативных замен являются замены в группе основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин), и небольших аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Аминокислотные замены, которые, как правило, не изменяют определенной активности, известны в данной области и описаны, например, H. Neurath and R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Наиболее часто встречающиеся замены представляют собой Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

В дополнение к 20 стандартным аминокислотам, остатки дикого типа могут быть заменены нестандартными аминокислотами (такими как 4-гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и альфа-метилсерин). Аминокислотные остатки могут быть заменены ограниченным количеством неконсервативных аминокислот, аминокислот, которые не кодируются генетическим кодом, и неприродных аминокислот. "Неприродные аминокислоты" модифицируются после синтеза белка и/или обладают химической структурой в их боковой цепи(ях), которая отличается от химической структуры стандартных аминокислот. Неприродные аминокислоты можно химически синтезировать, и, предпочтительно, они являются коммерчески доступными и включают в себя пипеколиновую кислоту, карбоновую кислоту тиазолидина, дегидропролин, 3- и 4-метилпролин, и 3,3-диметилпролин.

Альтернативно аминокислотные изменения представляют собой изменения такого характера, которые изменяют физико-химические свойства полипептидов. Например, аминокислотные изменения могут повышать термическую стабильность полипептида, изменять специфичность в отношении субстрата, изменять оптимальное значение pH и т.п.

Основные аминокислоты в исходном полипептиде можно выявлять в соответствии со способами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез или сканирующий аланином мутагенез (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последнем способе, для выявления аминокислотных остатков, которые являются ответственными за активность молекулы, в каждый остаток молекулы вводят единичные мутации аланином, и полученные мутантные молекулы анализируют на биологическую активность (т.е., противомикробную активность). См. также, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Активный участок фермента или другое биологическое взаимодействие также можно определять посредством анализа структуры, как определяют посредством таких способов, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронография или фотоаффинное мечение, совместно с мутацией предполагаемых аминокислот области контакта. См., например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64. Принадлежность к необходимым аминокислотам также можно установить, исходя из анализа идентичности с полипептидами, которые сходны с полипептидом в соответствии с этим изобретением.

Единичные или множественные аминокислотные замены можно проводить и анализировать с использованием известных способов мутагенеза, рекомбинации и/или перетасовки, с последующим пригодным способом скрининга, таким как способы, описанные Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; или WO 95/22625. Другие способы, которые можно использовать, включают ПЦР с пониженной точностью, фаговый дисплей (например, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; патент США № 5223409; WO 92/06204), и сайт-направленный мутагенез (Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).

Способы мутагенеза/перетасовки можно объединять с высокопроизводительными автоматизированными способами скрининга для выявления активности клонированных мутантных полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами. Мутантные молекулы ДНК, которые кодируют активные полипептиды, можно получать из клеток-хозяев и быстро секвенировать с использованием стандартных в данной области способов. Эти способы дают возможность быстрого определени