Болезнеустойчивые растения

Болезнеустойчивые растения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям и к растительным клеткам, которые включают ген, кодирующий белок NRC1 (NB-LRR, необходимый для HR-ассоциированной гибели клеток 1), интегрированный в геном, и к способам получения таких растений и растительных клеток. В особенности, в настоящем изобретении рассматриваются растения из семейства Solanaceae и части таких растений (семена, плоды, листья и т.п.) с повышенной устойчивостью к заболеваниям. Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют белки NRC1 согласно настоящему изобретению, к включающим их векторам, а также к выделенным белкам NRC1. Кроме того, в изобретении рассматриваются растительные клетки и растения, включающие одну или несколько мутаций в эндогенной аллели NRC1, где указанные одна или несколько мутаций придают растениям и растительным клеткам повышенную устойчивость к заболеваниям.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Активная система защиты растений, запускаемая при распознавании авирулентного фактора патогена, опосредованная геном устойчивости, соответствует модели ген-на-ген (Dangl and Jones, 2001, Nature 411, 826-833). К настоящему времени были клонированы несколько генов устойчивости из растений (R гены), и на основании структуры белков, которые они кодируют, указанные гены были разделены на несколько групп (Hammond-Kosack and Jones, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 48, 575-607). Большинство R генов кодирует цитоплазматические белки NB-LRR, содержащие сайт связывания нуклеотидов (NB) и обогащенные лейцином повторы (LRR). Данная группа состоит из генов, кодирующих белки CC-NB-LRR, содержащие суперскрученные домены, и генов, которые кодируют белки, содержащие домен, аналогичный рецепторам Toll и интерлейкина (IL) у млекопитающих, так называемые белки TIR-NB-LRR (Hammond-Kosack and Jones, 1997, выше).

Использование таких специфических генов устойчивости в стратегиях разведения с целью достижения длительной устойчивости встречает множество проблем, поскольку патогены легко уходят от распознавания за счет мутаций в своих факторов авирулентности, что препятствует индукции активной системы защиты (Westerink et al., 2004, Mol. Microbiol. 54, 533-545). Аналогично, предполагается существование среди этих белков общих путей, определяющих резистентность (R белки) (Shirasu and Schulze-Lefert, 2000, Plant Mol. Biol. 44, 371-385). В этой связи, идентификация дополнительных генов, необходимых для достижения резистентности, не только дает информацию, как функционируют такие сигнальные пути, но также может позволить идентифицировать гены, которые играют более глобальную роль в резистентности. Так, например, в случае индуцированного вирусом молчания гена (VIGS) в Nicotiana benthamiana было показано, что SGT1 вовлекается в пути реализации множественной устойчивости, такие как N-, Rx- и Pto-опосредованные HR и резистентность, и Cf-4- и Cf-9-опосредованные HR (Peart et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 10865-10869; Zhang et al., 2004, Plant J. 40, 213-224). SGT1 представляет собой компонент, функционирующий вместе с SKP1, в виде части SCF E3-лигазного комплекса, который вовлекается в убихитинирование белков, модификацию, запускающую их деградацию (Schwechheimer и Schwager, 2004, Plant Cell Reports 23, 353-364). Была высказана гипотеза, что молчание эссенциального гена в данной системе деградации белков препятствует проведению процесса убихитинирования, что ингибирует деградацию отрицательных регуляторов, которые необходимы для активации защитных механизмов (Azevedo et al., 2002, Science 295, 2073-2076).

Некоторые механизмы резистентности связаны с активацией MAPK (митоген-активированные протеинкиназы) (Zhang and Klessig, 2001, Trends Plant Sci. 6, 520-527; Pedley and Martin, 2005, Curr. Opin. Plant Biol. 8, 541-547). В Cf-9-содержащих растениях табака и клеточных культурах, которые были провоцированы Avr9, активируются NtWIPK (индуцированная повреждением протеинкиназа) и NtSIPK (индуцированная салициловой кислотой протеинкиназа) (Romeis et al., 1999, Plant Cell 11, 273-287). VIGS применительно к NtCDPK (кальций-зависимая протеинкиназа) в N. benthamiana ингибируют Cf-9/Avr9- и Cf-4/Avr4-зависимые HR (Romeis et al., 2001, EMBO J. 20, 5556-5567), а VIGS для LeACIK1 (Avr/Cf-индуцированная каназа 1) в растениях томатов приводит к снижению резистентности к C. fulvum (Rowland et al., 2005, Plant Cell 17, 295-310). Активация киназ при реализации защитных механизмов и сниженная резистентность при «выключении» соответствующих кодирующих генов подтверждают важность их функций в активации системы защиты.

В рамках двунаправленного варианта исследования использовали 21 ген применительно к VIGS в растениях томатов, в отношении которых было известно, что они вовлекаются в сигнальный процесс, связанный с защитой, и было показано, что девять из них вовлекаются в Pto-опосредованную резистентность. Среди них были выявлены два гена, кодирующие MAPKK (LeMEK1 и LeMEK2), и два гена, кодирующие MAPK (LeNTF6 и LeWIPK) (Ekengren et al., 2003, Plant J. 36, 905-917). В рамках другого исследования были клонированы свыше 2400 кДНК из нормализованной библиотеки кДНК N. benthamiana в Х-векторе вируса картофеля и далее они были использованы для VIGS в N. benthamiana. Примерно 3% кДНК оказывали воздействие на Pto-зависимую HR при молчании. В их числе был идентифицирован MAPKKKα в качестве позитивного регулятора резистентности и заболевания (Del Pozo et al., 2004, EMBO J. 23, 3072-3082).

Лу с соавт. (Lu et al. 2003, EMBO J. 22, 5690-5699) получили VIGS с использованием 4992 кДНК из нормализованной библиотеки кДНК N. benthamiana при клонировании в PVX векторе. В числе этих кДНК 79 (1,6%) соответствовали генам, необходимым для Pto-опосредованного HR, при этом молчание только шести из них также нарушало Pto-опосредованную резистентность против Pseudomonas syringae. Состояние VIGS с использованием кДНК, соответствующей HSP90, устраняло не только Pto-опосредованный HR, но также Pto-, Rx- и N-опосредованную резистентность, что указывало на то, что HSP90 необходим для функционирования путей реализации множественной резистентности к заболеваниям. Тот же набор кДНК был использован для достижения VIGS в N-трансгенных N. benthamiana, после чего в растения был инокулирован штамм TMV с GFP-меткой. Резистентность против TMV сильнее всего подавлялась в случае достижения молчания с использованием фрагмента кДНК, полученного из гена, кодирующего CC-NB-LRR, известного как NRG1 (ген 1 требования N) (Peart et al., 2005, Curr. Biol. 15, 968-973). Было показано, что NRG1 специфически необходим для функционирования N гена, то есть белки CC-NB-LRR не только действуют в качестве белков резистентности, вовлекаемых в процесс распознавания факторов авирулентности, но также участвуют в сигнальном пути, инициируемом TIR-NB-LRR белком N, который в итоге приводит к достижению резистентности (Peart et al., 2005, см. выше). Таким образом, несмотря на то, что функции белка NRG1 из растений табака по пути считывания информации в каскаде сигнальной системы защиты растений инициируются белком резистентности, этот путь сопряжен с недостатками, связанными с тем, что он специфически вовлекается в N-опосредованную резистентность против мозаичного вируса табака (TMV) и данный белок не является кофактором резистентности к заболеванию (Rx- и Pto-опосредованная резистентность против PVX и Pseudomonas syringae не затрагиваются при молчании NRG1), что может быть неприемлемо для целей достижения общей системы резистентности к патогенам в культурах, таких как томаты.

Несмотря на возрастающий поток информации о путях достижения болезнеустойчивости растений все еще имеется потребность в идентификации генов и белков, которые могут использоваться для создания растений, обладающих пролонгированной системой резистентности к заболеваниям широкого спектра действия. Целью настоящего изобретения является получение таких нуклеиновых кислот, белков и способов создания растений, в особенности растений, относящихся к семейству Solanaceae, с повышенной резистентностью к заболеваниям.

ОСНОВНЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин "HR" относится к гиперчувствительному ответу, то есть к локальной гибели клеток растений, которая проявляется либо как повреждения, видимые под микроскопом (например, описанные Rivas и Thomas, 2005, Ann Rev Phytopath 43: 395-436), и/или в виде макроскопических повреждений. Гибель гиперчувствительных клеток обычно ассоциирована с другими ответами растений, такими как образование реакционно-активных видов кислорода и активация генов, связанных с системой защиты в клетках, окружающих HR повреждения.

Термин «патогены растений» относится к биотическим агентам, которые способны вызывать заболевание у растений, таким как патогенные грибы, бактерии, вирусы, оомицеты, микоплазменные организмы, нематоды, белокрылки, тли и т.п. В основном, все штаммы, расы или патогенные варианты того вида патогена, который способен вызывать заболевание ткани организма-хозяина, включаются в область настоящего изобретения.

Термин «биотрофные патогены растений» или «биотрофы» относится к патогену, который сохраняет клетки растений организма-хозяина в живом состоянии и существует на живых клетках, нужных для роста и колонизации в ткани.

Термин «хемибиотрофный патоген растений» или «хемибиотроф» относится к растительному патогену, который поддерживают клетки организма-хозяина в живом состоянии в течение по меньшей мере части его жизненного цикла.

Термин «некробиотрофный патоген растения» относится к растительному патогену, который активно уничтожает растительные клетки при колонизации в ткани за счет образования токсичных ферментов, белков или метаболитов, которые уничтожают клетки хозяйского организма.

Термин «элиситор-независимый HR» относится к реакции гиперчувствительности, которая развивается без патогена или патогенного элиситора (например, грибного белка Avr).

В случае растений, экспрессирующих NRC1 белок согласно настоящему изобретению (например, конститутивно активный NRC1 белок), следует также провести разграничение между «конститутивным» HR, в случае которого имеется в виду развитие HR-повреждений в отсутствие патогенов или белков патогенного элиситора, и «индуцированным» HR, где подразумевается развитие HR-повреждений после воздействия индуцирующего стимула (например, после индукции промотора, который запускает экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей NRC1 белок или его вариант).

Термин «Solanaceae» относится к роду, виду и сортам растений, принадлежащих к семейству Solanaceae. Они включают виды, относящиеся к роду Solanum (включая Solanum lycopersicum, который известен также как Lycopersicon esculentum), Nicotiana, Capsicum, Petunia, и к другим родам.

Термин «резистентность к заболеванию» в контексте настоящего описания относится к различной степени резистентности или толерантности растения к заболеванию, включая умеренную резистентность и повышенную резистентность или полную резистентность к одному или нескольким патогенам. Указанная резистентность может быть определена и необязательно количественно выражена при сравнении с симптомами, вызванными патогеном (такими как чистота и/или размер HR повреждений, поражений грибным мицелием и т.п.), в сравнении с соответствующими симптомами, выявленными у чувствительных контрольных растений, растущих в идентичных условиях воздействия патогенов. Такие биотесты на заболеваемость могут быть проведены с использованием известных способов. Резистентность к заболеванию может быть измерена опосредованно как повышенный уровень резистентности растений в сравнении с чувствительными растениями, растущими в условиях давления болезнетворного фактора.

Термин «повышенная резистентность к заболеванию» относится к любому статистически значимому повышению болезнеустойчивости растения или растительной ткани в сравнении с соответствующим контролем. В контексте настоящего описания данный термин относится как к качественному (например, переход от чувствительного варианта к резистентному растению), так и к количественному повышению. Также рассматривается снижение частоты заболеваемости (процент инфицированных растений) и/или тяжести заболевания. Предпочтительно, растение, обладающее повышенной болезнеустойчивостью по меньшей мере к одному патогену, представляет собой растение, характеризующееся повышенным по меньшей мере на 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% или даже на 100% уровнем резистентности к патогену, в сравнении с контрольным растением при сравнении соответствующих результатов, полученных в тестах и/или полевых испытаниях, проводимых для оценки болезнеустойчивости растений.

Термин «широкий спектр» применительно к болезнеустойчивости относится к повышенной резистентности против по меньшей мере двух, трех, четырех или более патогенов разных видов. Так, например, растение-хозяин, обладающее повышенной резистентностью к нескольким биотропным и/или хемибиотропным, и/или некротропным патогенным видам, рассматривается как обладающее широким спектром резистентности.

Термин «симптомы, вызванные патогеном» обозначает любые симптомы заболевания, такие как рост биомассы мицелия на/или внутри хозяйской ткани, рост бактерий/биомассы бактерий, размер и/или частота некротических или хлоротических повреждений растительной ткани, размер и/или частота изъязвлений ткани и т.п.

Термин «последовательность нуклеиновой кислоты» (или молекулы нуклеиновой кислоты) относится к молекуле ДНК или РНК в одноцепочечной или двуцепочечной форме, в частности ДНК, кодирующей белок или белковый фрагмент согласно настоящему изобретению. Термин «выделенная последовательность нуклеиновой кислоты» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая не будет длиннее, чем в природном среде, из которой она выделена, то есть которая не будет длиннее последовательности нуклеиновой кислоты в бактериальной хозяйской клетке или в ядерном или пластидном геноме растения.

Термины «белок» или «полипептид» используются взаимозаменяемо и относятся к молекулам, состоящим из аминокислотной цепи, независимо от конкретного характера действия, размера, трехмерной структуры или происхождения. Термин «фрагмент» или «часть» применительно к белку может, таким образом, рассматриваться как «белок». Термин «выделенный белок» в контексте настоящего описания относится к белку, который не длиннее, чем в своем природном окружении, например, in vitro или в рекомбинантной бактериальной или растительной хозяйской клетке.

Термин «функциональный» применительно к белкам NRC1 (или вариантам, таким как ортологи или мутанты и фрагменты) относится к способности модифицировать (в количественном и/или качественном отношении) развитие HR-повреждений и/или степень болезнеустойчивости за счет модификации уровня экспрессии гена, кодирующего NRC1 (например, за счет сверхэкспрессии или молчания) в растении. Так, например, функциональность предполагаемого белка NRC1, полученного из растения вида Х, может быть протестирована различными способами. Если белок является функциональным, молчание NRC1 гена, кодирующего данный белок в растении вида Х, при использовании, например, VIGS или векторов с молчащими генами, будет приводить к снижению или супрессии HR-повреждений, индуцированных патогеном или элиситором, и/или к снижению резистентности к патогену, как показано в примерах, относящихся к томату. Кроме того, внесение функционального NRC1 белка способно восстановить связанные с HR повреждения и/или устойчивость к патогенам. Альтернативно, временная или стабильная (супер)экспрессия в растении вида Х гена, кодирующего NRC1 белок (необязательно вместе с посттранскрипционным ингибитором молчания гена), будет приводить к развитию элиситор-независимых HR повреждений и/или к повышению болезнеустойчивости, в особенности против биотрофных и/или хемибиотрофных патогенов. См. также описание, приведенное в разделе «Примеры».

Термин «ген» относится к последовательности ДНК, включающей участок (транскрибированный участок), который транскрибируется c образованием молекулы РНК (например, мРНК) в клетке, оперативно связанной с соответствующими регуляторными участками (например, с промотором). Таким образом, ген может включать несколько оперативно связанных последовательностей, таких как промотор, 5'-лидерная последовательность, включающих, например, последовательности, вовлекаемые в инициацию трансляции, кодирующий участок (для белка) (например, кДНК или геномная ДНК) и 3'-нетранслируемая последовательность, которая включает, например, сайты терминации транскрипции.

Термин «химерный ген» (или рекомбинантный ген) относится к любому гену, который в природном состоянии в норме не обнаруживается в данном виде, в частности ген, в котором присутствует одна или несколько частей последовательности нуклеиновой кислоты, которые не ассоциированы друг с другом в природе. Так, например, промотор не ассоциирован в природе с частью или полностью с транскрибированным участком или с другим регуляторным участком. Термин «химерный ген» относится конструкциям экспрессии, в которых промоторная последовательность или регуляторная последовательность транскрипции оперативно связана с одной или несколькими кодирующими последовательностями, или с антисмысловой последовательностью (последовательность, представляющая собой обратный комплемент смысловой цепи), или с инвертированной повторяющейся последовательностью (смысловая и антисмысловая последовательность, за счет которых РНК транскрипт формирует двуцепочечную РНК при транскрипции).

Термин «3' UTR» или «3'-нетранслируемая последовательность» (также называемая как 3'-нетранслируемый участок или 3'-конец) относится к последовательности нуклеиновой кислоты в направлении считывания информации с кодирующей последовательности гена, которая включает, например, сайт терминации транскрипции и (в большинстве, но не во всех эукариотических мРНК) сигнал полиаденилирования (такой, как, например, AAUAAA или его варианты). После завершения стадии терминации транскрипции транскрипт мРНК может быть расщеплен в направлении считывания информации для сигнала полиаденилирования и может быть добавлен поли(А)фрагмент, который вовлекается в транспортировку мРНК в цитоплазму (где происходит трансляция).

Выражение «экспрессия гена» относится к процессу, в рамках которого участок ДНК, который оперативно связан с соответствующими регуляторными участками, в частности с промотором, транскрибируется в РНК, которая является биологически активной, то есть которая способна транслироваться в биологически активный белок или пептид (или в активный пептидный фрагмент) или которая сама по себе является активной (то есть, например, при посттранскрипционном молчании гена или в случае РНКи). В некоторых вариантах под активным белком понимают белок, который является конститутивно активным. Кодирующая последовательность предпочтительно имеет смысловую ориентацию и кодирует желательный биологически активный белок или пептид или активный пептидный фрагмент. В стратегиях, основанных на молчащих генах, последовательность ДНК предпочтительно присутствует в форме антисмысловой ДНК или в виде инвертированных повторов ДНК, включающих короткую последовательность целевого гена в антисмысловой или в смысловой и антисмысловой ориентации. Термин «эктопическая экспрессия» относится к экспрессии в ткани, в которой данный ген в норме не экспрессируется.

Выражение «регуляторная последовательность транскрипции» в контексте настоящего описания относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая способна регулировать уровень транскрипции (кодирующей) последовательности, оперативно связанной с регуляторной последовательностью транскрипции. Регуляторная последовательность транскрипции в контексте настоящего описания включает все элементы последовательности, необходимые для инициации транскрипции (промоторные элементы), для поддержания и для регуляции транскрипции, включая, например, аттенуаторы или энхансеры. Хотя рассматриваются в основном регуляторные последовательности транскрипции, функционирующие против (в 5'-направлении) направления считывания информации кодирующей последовательности, данное определение относится также к регуляторным последовательностям, локализованным в направлении (в 3'-направлении) считывания информации кодирующей последовательности.

В контексте настоящего описания термин «промотор» относится к фрагментам нуклеиновой кислоты, функция которых связана с контролем транскрипции одного или нескольких генов, расположенных против направления считывания информации относительно направления транскрипции сайта инициации транскрипции гена, и структурно идентифицируется наличием сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и любых других последовательностей ДНК, включающих, без ограничения, сайты связывания фактора транскрипции, сайты связывания белка-репрессора и активатора, а также любые другие нуклеотидные последовательности, известные специалистам в данной области как действующие, непосредственно или опосредованно, в направлении регуляции уровня транскрипции от промотора. Термин «конститутивный» применительно к промотору обозначает промотор, который является активным в большинстве тканей в обычных физиологических условиях и условиях развития. Термин «индуцибельный» применительно к промотору обозначает промотор, который является физиологически регулируемым (например, за счет внешнего внесения некоторых соединений) в ходе развития. «Тканеспецифическим» промотором является промотор, который активен только в специфических типах тканей или в специфических клетках. Выражение «промотор, активный в растениях или растительных клетках» относится к общей способности промотора осуществлять транскрипцию в растении или растительной клетке. При этом не делается никаких ссылок на пространственно-временную активность промотора.

В контексте настоящего описания термин «оперативно связанный» относится к связи полинуклеотидных элементов, находящихся в функциональном родстве. Нуклеиновая кислота рассматривается как «оперативно связанная», когда она находится в функциональной взаимосвязи с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, промотор или, скорее, регуляторная последовательность транскрипции оперативно связаны с кодирующей последовательностью, если он/она оказывает эффект на транскрипцию кодирующей последовательности. Выражение «оперативно связанный» означает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются в типичном случае непрерывными и, когда это необходимо для соединения участков, кодирующих два белка, непрерывными и в рамке считывания, с тем чтобы создавался «химерный белок». Термин «химерный белок» или «гибридный белок» представляет собой белок, состоящий из различных белковых «доменов» (или мотивов), которые не встречаются как таковые в природе, но которые объединяются с образованием функционального белка, демонстрирующего функции объединенных доменов (например, могут быть объединены сверхскрученный домен (CC), домен связывания нуклеотидов (NB-ARC) и участок, обогащенный лейциновыми повторами (LRR)). Химерный белок может также представлять собой белок слияния двух или более природных белков. Термин «домен» в контексте настоящего описания относится к одной или нескольким частям или одному или нескольким доменам белка со специфической структурой или функцией, которые могут быть перенесены на другой белок с получением нового гибридного белка, обладающего по меньшей мере функциональными характеристиками данного домена. Специфические домены могут также использоваться для идентификации других NRC1 белков, таких как NRC1 ортологи из растений другого вида.

Термин «целевой пептид» относится к аминокислотным последовательностям, которые направляют белок или белковый фрагмент на внутриклеточные органеллы, такие как пластиды, предпочтительно, хлоропласты, митохондрии, или во внеклеточное пространство или апопласт (сигнальный пептид секреции). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая целевой пептид, может быть слита (в рамке считывания) с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей амино-конец (N-терминальную часть) белка или белкового фрагмента, или может использоваться с целью замены нативного целевого пептида.

Термин «конструкция нуклеиновой кислоты» или «вектор» в контексте настоящего описания обозначает сконструированную человеком молекулу нуклеиновой кислоты, которую получают по стратегии рекомбинантных ДНК и которая применяется для доставки экзогенной ДНК в хозяйскую клетку. Векторный скелет может представлять собой, например, бинарный или супербинарный вектор (см., например, US 5591616, US 2002138879 и WO95/06722), ко-интегрированный вектор или вектор Т-ДНК, известный в данной области и приведенный в настоящем описании, в который встраивают с последующей интеграцией химерный ген или, если уже имеется подходящая регуляторная последовательность транскрипции, встраивают только нужную последовательность нуклеиновой кислоты (например, кодирующую последовательность, антисмысловую последовательность или инвертированную повторяющуюся последовательность) для интеграции в направлении считывания информации регуляторной последовательности транскрипции. Векторы обычно включают другие генетические элементы, облегчающие их использование при молекулярном клонировании, такие как, например, селектируемые маркеры, сайты множественного клонирования и т.п. (см. приведенное ниже описание).

Термин «хозяйская клетка», или «рекомбинантная хозяйская клетка», или «трансформированная клетка» используется применительно к новой индивидуальной клетке (или организму), которая возникает на основе по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты и которая, в особенности, включает химерный ген, кодирующий желательный белок или последовательность нуклеиновой кислоты, которая при транскрипции дает антисмысловую РНК или инвертированный повтор РНК (или шпилечную РНК) для достижения молчания целевого гена/генного семейства, вводимых в указанную клетку. Хозяйская клетка представляет собой предпочтительно растительную клетку или бактериальную клетку. Указанная хозяйская клетка может содержать конструкцию нуклеиновой кислоты, такую как внехромосомная (эписомальная) реплицирующаяся молекула, или, более предпочтительно, включает химерный ген, интегрированный в ядерный или пластидный геном хозяйской клетки. В тексте настоящего описания термин «хозяйский» относится также к виду растения-хозяина, который патогеноспособен инфицировать или в который он может внедриться, что должно быть ясно из контекста. Растение рассматриваемого вида классифицируют как «хозяйский» или «нехозяйский» вид относительно патогена. «Нехозяйские» виды являются полностью иммунными для инфекции патогеном всех вариантов или штаммов патогена, даже в условиях, оптимальных для развития заболевания. «Хозяйские» виды также описываются «перечнем хозяйских организмов» для патогена и являются иммунным к некоторым (но не ко всем) вариантам патогена.

«Селектируемый маркер» представляет собой термин, известный специалистам в данной области и применяемый для описания любой генетической единицы, которая при экспрессии может использоваться для селекции одной или нескольких клеток, содержащих такой селектируемый маркер. Продукты селектируемого маркерного гена придают, например, резистентность к антибиотикам или, более предпочтительно, устойчивость к гербициду или другому выявляемому и отбираемому признаку, такому как фенотипический признак (например, изменение пигментации) или пищевые потребности. Термин «репортер» в основном используется применительно к визуализируемым маркерам, таким как зеленый флуоресцентный белок (GFP), eGFP, люцифераза, GUS и т.п.

Термин «ортолог» гена или белка в контексте настоящего описания относится к гомологичному гену или белку, обнаруженному в организме другого вида, который имеет ту же функцию, что данный ген или белок, но (обычно) отличается от последовательности за счет дивергенции с того момента времени, когда вид, содержащий данные гены, начал дивергировать (то есть, это гены, возникшие от общего предка путем видообразования).

Ортологи гена томатов NRC1 могут быть, таким образом, идентифицированы в других видах растений на основании сравнения последовательностей (например, при определении процента идентичности последовательностей по всей их длине или по специфическим доменам) и по результатам функционального анализа.

Термины «гомологичный» и «гетерологичный» относятся к родству, имеющемуся между последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательностью и соответствующей хозяйской клеткой или хозяйским организмом, в особенности в контексте трансгенных организмов. Гомологичная последовательность представляет собой последовательность, которая в природном состоянии содержится в хозяйском организме того или иного вида (например, в растении томатов, трансформированном геном томатов), тогда как гетерологичная последовательность в природе не встречается в данной хозяйской клетке (например, в случае растения томатов, трансформированного последовательностью, взятой из растений картофеля). В зависимости от контекста термин «гомолог» или «гомологичный» может альтернативно относиться к последовательностям, которые происходят от общей последовательности растения-предка (то есть, они могут быть ортологами).

Термин «жесткие условия гибридизации» может использоваться для идентификации нуклеотидных последовательностей, которые по существу идентичны данной нуклеотидной последовательности. Жесткие условия зависят от используемой последовательности и различаются в разных ситуациях. В основном, жесткие условия выбирают таким образом, чтобы температура поддерживалась примерно на 5°C ниже, чем точка плавления (Т_пл) для конкретных последовательностей при заданной ионной силе и заданном значении pH. Показатель Т_пл представляет собой температуру (при определенных значениях ионной силы и pH), при которой 50% целевой последовательности гибридизуется с идеально подходящим зондом. В типичном случае жесткие условия выбирают таким образом, чтобы концентрация соли составляла примерно 0,02 моль при pH 7 и температура составляла по меньшей мере 60°C. Снижение концентрации соли и/или повышение температуры усиливают условия жесткости. Жесткие условия для гибридизации РНК-ДНК (нозерн-блоттинг с использованием зонда из примерно 100 нуклеотидов) представляют собой пример таких условий, которые включают по меньшей мере одну промывку в 0,2×SSC при температуре 63°C в течение 20 мин или в эквивалентных условиях. Жесткие условия для гибридизации ДНК-ДНК (саузерн-блоттинг с использованием зонда из примерно 100 нуклеотидов) представляют собой пример таких условий, которые включают по меньшей мере одну промывку (обычно две) в 0,2×SSC при температуре, равной по меньшей мере 50°C, обычно примерно 55°C, в течение 20 минут или в эквивалентных условиях. См. также руководство Самбрука с соавт. (Sambrook et al. (1989) и Sambrook and Russell (2001)).

Параметры «идентичность по последовательности» и «сходство по последовательности» могут быть определены при сопоставлении двух пептидных или двух нуклеотидных последовательностей с использованием алгоритма общего или локального выравнивания. Последовательности могут быть оценены как «по существу идентичные» или «по существу сходные», если они (при проведении оптимального сопоставления, например, с использованием программ GAP или BESTFIT, включающих заданные по умолчанию параметры), характеризуются по меньшей мере некоторым минимальным процентом идентичности по последовательности (см. приведенные ниже определения). В программе GAP используется алгоритм глобального сопоставления Нидлмана и Вунша (Needleman and Wunsch) для сопоставления двух последовательностей по всей длине, максимизации числа спариваний и минимизации числа брешей. В основном, используются в программе GAP заданные по умолчанию параметры, где штраф за образование брешей = 50 (нуклеотидов)/8 (белков) и штраф за расширение брешей = 3 (нуклеотида)/2 (белка). Для нуклеотидов используемая по умолчанию балльная матрица представляет собой nwsgapdna, а для белков заданной по умолчанию балльной матрицей является Blosum 62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Выравнивание последовательностей и определение балльных показателей для оценки процента идентичности по последовательности могут быть проведены с использованием компьютерных программ, таких как GCG Wisconsin Package, версия 10.3, доступных от Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA, или EmbossWin, версия 2.10.0 (с использованием программы «needle»). Альтернативно, процент сходства или идентичности может быть определен путем поиска в соответствующих базах данных с использованием алгоритмов, таких как FASTA, BLAST и т.п.

В приведенном документе и в прилагаемой формуле изобретения глагол «включать» и его варианты используются в неограничительном смысле для обозначения того, что охватываются позиции, следующие за данным словом, однако при этом не исключаются позиции, которые конкретно не указаны. Кроме того, ссылка на элемент с использованием единственного числа не исключает возможность того, что может присутствовать более чем один такой элемент, если из контекста явно не следует, что должен быть один и только один такой элемент. Таким образом, единственное число обычно соответствует ситуации «по меньшей мере один». Следует также понимать, что ссылка на «последовательности» в контексте настоящего описания означает в основном ссылку на фактические физические молекулы с определенной последовательностью субъединиц (например, аминокислот).

В контексте настоящего описания термин «растение» включает растительные клетки, растительные ткани или органы, протопласты растений, культуры тканей на основе растительных клеток, из которых данные растения могут быть регенерированы, каллюсы растений, объединения растительных клеток и растительные клетки, которые являются интактными в растениях, или части растений, такие как эмбрионы, пыльца, семяпочки, плоды (например, собранные томаты), цветы, листья, семена, корни, корневые волоски и т.п.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения использовали анализ кДНК-AFLP в сочетании с VIGS (вирус-индуцированное молчание гена) для идентификации генов, которые вовлекаются в Cf-4/Avr4-зависимый HR и резистентность к заболеванию. В числе генов, в случае которых VIGS приводит к подавлению Avr4-индуцированного HR, был идентифицирован один ген из томатов (названный как NRC1), кодирующий аналог белка резистентности типа CC-NB-LRR (обозначаемый в настоящем описании как NRC1 для белка NB-LRR, требуемого для HR-ассоциированной гибели клеток 1). Молчание NRC1 в томатах ухудшает не только развитие Avr4-индуцированного HR, на также резистентность к патогену томатов Cladosporium fulvum. Это указывает на то, что для белка резистентности томатов Cf-4 (внеклеточный белок рецепторного типа) требуется, чтобы цитоплазматический белок NB-LRR был функциональным.

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что NRC1 вовлекается в реакцию множественного HR и процесс множественной резистентности к заболеваниям/сигнальные пути клеточной гибели, такие как Cf-9/Avr-9-, LeEix2/Eix-, Pto/AvrPto- и Rx/CP-инициированные HR (см. примеры). Другие тесты проводят для определения, вовлекается ли NRC1 также в другие HR, такие как Mi-опосредованные HR (HR, индуцированные нематодами, белокрылками и тлей; см. US 6613962 и EP0937155B1). Таким образом, NRC1 вовлекается в HR пути, запускаемые как внеклеточными, так и внутриклеточными белками резистентности к заболеваниям, которые принадлежат к различным классам: внеклеточные белки рецепторного типа (RLP, такие как Cf-4, Cf-9 и LeEix2), Ser/Thr протеинкиназы, такие как Pto, и белок CC-NB-LRR (Rx), которые придают резистентность, соответственно, к грибам (Cladosporium fulvum и Trichoderma viride), бактерии (Pseudomonas syringae pv tomato) или вирусу (PVX).

Белок NRC1 (и кодирующий его ген NRC1) может использоваться для придания растениям резистентности или усиления резистентности против множества патогенов, в особенности биотрофных и хемибиотрофных растительных патогенов, а также применительно к некротропным растительным патогенам, таким как виды Botrytis. В особенности, экспрессия NRC1 (или его вариантов или фрагментов, определенных в да