Полипептиды с направленным действием

Полипептиды с направленным действием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОПИСАНИЕ

По настоящему изобретению испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США, серийный номер 60/649478, поданной 1 февраля 2005 года, которая приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится, по меньшей мере, к области клеточной биологии, молекулярной биологии, биологии рака и к медицине. Более конкретно настоящее изобретение относится к композициям, содержащим полипептид BLyS, конъюгированный с цитотоксическим агентом, и к применению таких композиций в терапии.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В-лимфоцитарный стимулятор является представителем суперсемейства фактора некроза опухоли (TNF), который индуцирует пролиферацию и дифференциацию В-клеток in vivo и in vitro (Moore et al., Science 285: 260-263 (1999)). BLyS отличается от других В-клеточных факторов пролиферации и дифференциации, таких как IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-13, IL-15, CD40L или CD27L (CD70), своим геном, специфичным для моноцитов, и по характеру экспрессии белка, а также по специфическому распределению рецептора и по биологической активности в отношении В-лимфоцитов. Экспрессия BLyS не обнаружена в естественных клетках-киллерах (NK), Т-клетках или B-клетках, а ограничена клетками миеломного происхождения. Экспрессия BLyS на покоящихся моноцитах подвергается положительной регуляции интерфероном-гамма (IFN-гамма). Ген, кодирующий BLyS, был картирован на хромосоме 13q34.

BLyS человека экспрессируется в виде связанного с мембраной полипептида типа II, состоящего из 285 аминокислот, и растворимого полипептида, состоящего из 152 аминокислот (Moore et al., 1999, supra). Связанная с мембраной форма BLyS имеет трансмембранный домен между аминокислотными остатками 47 и 73. NH₂-конец растворимой формы BLyS начинается от Ala¹³⁴, связанной с мембраной формы BLyS. Было показано, что растворимый рекомбинантный BLyS индуцирует пролиферацию В-клеток селезенки мыши in vitro и связывается с рецептором клеточной поверхности на указанных клетках (Moore et al., 1999, supra). Было также показано, что введение растворимого BLyS мышам приводит к повышению доли CD45R^dull, Ly6D^bright (так же известного, как ThB) B-клеток и к повышению сывороточных уровней IgM и IgA (Moore et al., 1999 supra). Таким образом, BLyS демонстрирует В-клеточный тропизм как по распределению его рецептора, так и по биологической активности.

Успешная разработка терапевтических средств, направленных на опухоль, зависит частично от возможностей сайт-специфичной доставки терапевтических средств, а также от биологической активности доставляемого агента. Моноклональные антитела используют для придания селективности цитотоксическим агентам, которые в противном случае не отличаются избирательностью, таким как токсины, радионуклиды и факторы роста (Williams et al., 1990; Rowlinson-Busza et al., 1992; Wahl, 1994). Одна такая молекула представляет собой гелонин, инактивирующий рибосому растительный токсин размером 29 кДа, обладающий эффективностью и механизмом действия, аналогичными А-цепи рицина (RTA), но имеет повышенную стабильность и сниженную токсичность (Stirpe et al., 1992; Rosenblum et al., 1995). В предшествующих работах удалось идентифицировать и исследовать биологические свойства различных химических конъюгатов растительного токсина гелонина и различных антител (Boyle et al., 1995; Xu et al., 1996; Rosenblum et al., 1999). В предшествующих исследованиях антитело ZME-018 подвергали химическому связыванию с очищенным гелонином, и указанный иммуноконъюгат демонстрировал специфическую цитотоксичность в отношении антиген-позитивных клеток меланомы в культуре ткани на моделях с ксенотрансплантатом опухоли человека (Rosenblum et al., 1991; Mujoo et al., 1995).

Таким образом, существует потребность в разработке усовершенствованных терапевтических средств, обладающих специфичностью для аномально пролиферирующих В-клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам получения и применения молекул, которые обладают мишеневой активностью в отношении, например, раковых клеток, входящих в состав опухоли, и цитотоксической активностью. Указанная молекула может включать, например, конъюгированный полипептид. Настоящее изобретение также относится к композициям, которые получают на основе указанных конгъюгированных полипептидов. Так, например, белоксодержащиее конъюгаты по настоящему изобретению относятся к соединению, которое включает как токсин, так и полипептид BLyS. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгированные полипептиды конструируют с помощью рекомбинантных методик с получением слитого белка. Конъюгированные соединения могут быть также присоединены друг к другу, например, через линкер.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения мишенивая и цитотоксическая активности придаются молекуле за счет отдельного фрагмента молекулы, хотя альтернативно один фрагмент может обладать частично или полностью как мишеневой, так и цитотоксической активностью.

Для специалистов в настоящей области понятно, что термин BlyS может использоваться взаимозаменяемо с терминами полинуклеотиды или полипептиды BAFF, BLYS, TALL1, THANK, ZTNF4, TALL-1, TNFSF20 и дельта BAFF, хотя в альтернативных вариантах они могут не быть взаимозаменяемыми. Кроме того, специалисту в настоящей области известно, как определить являются ли конкретные молекулы, которые потенциально могут быть взаимозаменяемы с BLyS, настолько подходящими, чтобы использовать их в соответствии с настоящим изобретением и/или в соответствии с доступными в настоящее время способами. Как было показано в настоящем изобретении, SEQ ID NO: 1 относится к полипептиду BlyS человека полной длины из 285 аминокислот. SEQ ID NO: 20 относится к полинуклеотидной последовательности BlyS человека. Аминокислотные остатки 134-285 в SEQ ID NO: 1 включают растворимую изоформу полипептида BLyS, который в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения представляет собой изоформу, используемую в конъюгированных полипептидах по настоящему изобретению. BLyS мыши (полипептид SEQ ID NO: 2; нуклеотид SEQ ID NO: 3) или другие ортологи BLyS также входят в область настоящего изобретения. Функциональные эквиваленты BLyS также могут использоваться в сочетании конъюгированными полипептидами с направленным действием по настоящему изобретению. Например, в настоящем изобретении рассматриваются полипептиды, сохраняющие BLyS активность, которые характеризуются по меньшей мере 80%-ной гомологией последовательности, по меньшей мере 85%-ной гомологией последовательности, по меньшей мере 90%-ной гомологией последовательности с любой из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотная последовательность BLyS включает по меньшей мере примерно 40, по меньшей мере примерно 50, по меньшей мере примерно 75, по меньшей мере примерно 100, по меньшей мере примерно 125, по меньшей мере примерно 150, по меньшей мере примерно 175, по меньшей мере примерно 200, по меньшей мере примерно 225, по меньшей мере примерно 250 или по меньшей мере примерно 275 последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В других вариантах функциональные эквиваленты включают по меньшей мере D-Е петлю, вовлекаемую в распознавание рецептора (см. Oren et al., Nat Struct Biol. 2002 Apr; 9(4): 288-92).

В некоторых вариантах может использоваться BLyS дикого типа, а в других вариантах может использоваться мутантный BLyS. Примеры мутантов BLyS включают мутант с мутацией по Cys146 (Chen et al., 2002; 2004; 2005) и в конкретных вариантах мутация может иметь место в аланине или в валине. Мутанты BLyS, используемые в настоящем изобретении, также сохраняют способность достигать В-клетки, в частности сохраняют способность связываться по меньшей мере с одним рецептором BLyS. Мутантный BLyS может обладать повышенной любой активностью в сравнении с BLyS дикого типа, включая способность связываться с В-клеткой, такой как способность связываться с рецептором BLyS.

Полипептиды BLyS с направленным действием по настоящему изобретению направлены на клетки, которые экспрессируют рецептор BLyS, такой как TNFRSF13B/TACI (SEQ ID NO: 4), TNFRSF17/BCMA (SEQ ID NO: 5) и TNFRSF13C/BAFFR (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгированные полипептиды по настоящему изобретению могут специфически связываться с клеткой, экспрессирующей функциональный эквивалент SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полагают, что клетки, экспрессирующие рецептор BLyS, могут быть связаны с аномальной пролиферацией В-клеток. Для любого специалиста в настоящей области со средним уровнем знаний понятно, что BLyS может формировать димеры или тримеры, с тем чтобы участвовать в распознавании рецептора. Также следует понимать, что белоксодержащие композиции конъюгированных полипептидов, рассматриваемые в настоящем описании, также будут способствовать образованию димеров BLyS, тримеров или любых других мультимерных белковых комплексов.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полипептид BLyS присоединяется к молекуле. В предпочтительных вариантах присоединение является ковалентным. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанная молекула представляет собой, например, цитотоксический агент, лекарственное средство, химиотерапевтический агент, радиоактивный изотоп, про-апоптозный агент, антиангиогенный агент, гормон, цитокин, фактор роста, пептид, белок, антибиотик, фермент (такой, например, как Granzyme B или Granzyme A), антитело, Fab-фрагмент антитела, визуализующий агент, нуклеиновую кислоту или антиген. Указанные молекулы приведены лишь в качестве примеров. Молекулы, входящие в область настоящего изобретения, включают фактически любую молекулу, которая может быть присоединена к полипептиду BLyS и затем может быть введена в организм человека. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения про-апоптозный агент представляет собой, например, грамицидин, магаинин, меллитин, дефензин или цекропин. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения антиангиогенный агент представляет собой тромбоспондин, ангиостатин, эндостатин или фактор, полученный из пигментного эпителия. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный цитокин представляет собой, например, интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-5, IL-10, IL-11, IL-12, IL-18, интерферон-γ (IF-γ), IF-α, IF-β, фактор некроза опухоли-α (TNF-α) или ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор). Указанные примеры приведены только для иллюстрации и никоим образом не исключают другие про-апоптозные агенты, антиангиогенный агенты или цитокины, известные в данной области.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к рекомбинантному пептидному токсину гелонина (показан как SEQ ID NO: 7), который описан в патенте США No.5631348 и который включен в настоящее описание в качестве ссылки. Рекомбинантный токсин гелонин по настоящему изобретению может представлять любую часть или фрагмент SEQ ID NO: 7, который сохраняет токсиновую активность. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гелонин включает остатки 110-210 из SEQ ID NO: 7. В других конкретных вариантах аминокислотная последовательность r-гелонина включает по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 75, по меньшей мере 100, по меньшей мере 125, по меньшей мере 150, по меньшей мере 175, по меньшей мере 200, по меньшей мере 225 или по меньшей мере 250 последовательных аминокислот из SEQ ID NO: 7. Другие соединения по настоящему изобретению включают рекомбинантный токсин гелонин, который сохраняет ядерный участок токсина, кроме того, что он содержит по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более последовательных аминокислотных остатков SEQ ID NO: 7 в дополнение к указанному ядерному участку токсина. В других вариантах осуществления настоящего изобретения гелонин включает SEQ ID NO: 21 (номер доступа в GenBank No.P33186). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения может использоваться rGel дикого типа, а в других вариантах может использоваться мутантный rGel. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения молекулу rGel получают в соответствии с заявкой на патент США No: 10/074 596, поданной 12 февраля 2002 года, которая приведена в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения репрезентативный конъюгированный полипептид имеет последовательность SEQ ID NO: 8. Приведенный в качестве примера полинуклеотид, кодирующий указанный конъюгированный полипептид, показан как SEQ ID NO: 9. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к репрезентативному конъюгированному полипептиду с последовательностью SEQ ID NO: 10. Полинуклеотид, кодирующий указанный конъюгированный полипептид, показан как SEQ ID NO: 11.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относится к цитотоксическому агенту, который может представлять собой, например, абрин, додекандрин, трикозантин, трикокирин, бриодин, антивирусный белок из Mirabilis, белок, инактивирующий рибосомы ячменя (BRIP), антивирусные белки из лаконоса (PAP), сапорины, люффины и/или момордины.

В некоторых аспектах настоящего изобретения полипептиды по настоящему изобретению могут быть конъюгированы. В основном указанные конъюгированные полипептиды содержат по меньшей мере пять аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгированные полипептиды имеют в длину, например, от примерно 5 до примерно 10 аминокислот, от примерно 5 до примерно 50 аминокислот, от примерно 5 до примерно 100 аминокислот, от примерно 5 до примерно 150 аминокислот, от примерно 5 до примерно 500 аминокислот, от примерно 5 до примерно 1000 аминокислот или от примерно 5 до примерно 5000 аминокислот.

Конъюгация полипептидов по настоящему изобретению может быть достигнута с использованием подходящих способов, включающих, например, как химическую конъюгацию, так и «генетическую конъюгацию», в соответствии с которой рекомбинантные слитые белки, включающие полипептид BLyS, функционально связываются с цитотоксическим пептидом. Рассматриваемая конъюгация с полипептидом BLyS включает конъюгацию N-концевого участка белка (в пределах первых 100 аминокислот), внутреннего участка (между N-концевым и C-концевым участками) и/или С-концевого участка белка (в пределах последних 100 аминокислот). Далее подробно описаны методики конъюгации, рассматриваемые для использования в настоящем изобретении.

Конъюгированные полипептиды по настоящему изобретению могут быть экспрессированы в экзогенном режиме. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид включает слитый полипептид или химерный полипептид. Химерный полипептид содержит весь или дискретную часть двух или более полипептидов. Дискретная часть полипептида относится к аминокислотному участку, который содержит идентифицируемую функцию или активность. Слитый белок представляет собой тип химерного белка, в котором первый полипептид или часть первого полипептида связана по типу конец-с-концом со вторым полипептидом или частью второго полипептида.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения индивидуума с В-клеточным пролиферативный расстройством, включающим введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества одной или нескольких молекул по настоящему изобретению, включая конъюгированные полипептиды. Термин «В-клеточное пролиферативное расстройство» обозначает злокачественные, а также незлокачественные популяции клеток, которые зачастую отличаются от окружающей ткани как морфологически, так и генотипически. Цитотоксический полипептид может быть соединен с полипептидом BLyS множеством способов, известных специалистам в данной области и описанных далее более подробно.

Примеры В-клеточных пролиферативных расстройств, лечение которых может проводиться в соответствии с настоящим изобретением, включают по меньшей мере следующие: В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз/малую лимфоцитарную лимфому при пролимфоцитарном лейкозе В-клеток, иммуноцитому/лимфоплазмацитарную лимфому (+/- макроглобулинемию Валденштрома), лимфому клеток мантии, лимфому В-клеток пограничной зоны в лимфоидной ткани, связанной со слизистой (MALT типа), лимфому В-клеток пограничной зоны селезенки (+/- ворсинчатые лимфоциты), лейкемический ретикулез, диффузную лимфому крупных В-клеток, медиастинальную (вилочковую) лимфому крупных В-клеток, внутрисосудистую лимфому крупных В-клеток, лимфому Буркитта, миелому плазматических клеток (множественную миелому), моноклональную гаммопатию или гаммопатию неясного генеза (MGUS), индолентную миелому, миелому Смолдеринга, остеосклеротическую миелому (POEMS синдром), лейкоз плазматических клеток, несекретирующую миелому, плазмацитому, солитарную плазмоцитому кости, экстрамедуллярную плазмацитому, макроглобулинемию Валденштрома, болезнь, вызванную патологией тяжелой цепи (HCD), заболевание, связанное с осаждением иммуноглобулина, системную патологию легкой цепи и первичный амилоидоз.

В некоторых аспектах настоящего изобретения композиции и способы относятся к В-клеточным пролиферативным расстройствам, которые устойчивы к лечению. Указанное расстройство может быть изначально устойчивым к лечению или указанное расстройство может стать устойчивым к лечению в результате первичного или последующего лечения.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к композициям по настоящему изобретению для профилактики и/или лечения по меньшей мере одного симптома В-клеточного пролиферативного расстройства. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композицию по настоящему изобретению используют для профилактики и/или лечения аутоиммунного расстройства, такого как, например, артрит или системная красная волчанка. Что касается профилактического применения, то можно достигнуть полного предупреждения развития симптома или его появление может быть задержано. Что касается применения для лечения, то симптом может быть полностью устранен или частично уменьшен.

В других аспектах осуществления настоящего изобретения описанные способы и композиции используют применительно к индивидууму, который проходит другое лечение по поводу такого же В-клеточного пролиферативного расстройства и который будет проходить другое лечение или который уже проходит данное лечение. Может рассматриваться любая дополнительная терапия, где в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительная терапия включает облучение, химиотерапию, хирургическое вмешательство, генную терапию, иммунотерапию, гормональную терапию или их сочетание.

В конкретных вариантах осуществления изобретения предлагается способ лечения индивидуума с В-клеточным пролиферативным расстройством, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества композиции, такой как конъюгированный полипептид, включающий полипептид BLyS, конъюгированный с цитотоксическим полипептидом, в конкретных вариантах указанный способ также включает введение индивидууму средства, которое повышает экспрессию рецептора BLyS.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения рецептор BLyS может быть введен в клетку-хозяин и экспрессирован в клетке-хозяине, что позволяет BLyS воздействовать на клетки за пределами его природного тропизма. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессия полинуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует конъюгат BLyS (такой как слитый белок) по настоящему изобретению, регулируется тканеспецифичным промотором. Например, молекулу рецептора BLyS, такую как SEQ ID NO: 4 (генная последовательность SEQ ID NO: 12), вводят с помощью подходящего вектора в клетку-хозяин печени. Экспрессия рецептора BLyS контролируется промотором, специфичным для гепатомы. Таким образом, действие BLyS-конъюгированных полипептидов может быть направлено на клетки гепатомы для лечения. В других вариантах осуществления настоящего изобретения конъюгированные полипептиды могут быть связаны с визуализирующим агентом для отслеживания прогресса направленного воздействия полипептида в организме пациента.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается способ селективного направленного воздействия на клетку, экспрессирующую рецептор BLyS, включающий контактирование указанной клетки с конъюгированным полипептидом, содержащим полипептид BLyS, конъюгированный с цитотоксическим пептидом.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ мониторинга терапии В-клеточного пролиферативного расстройства, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества конъюгированного полипептида, содержащего полипептид BLyS, конъюгированный с цитотоксическим полипептидом и визуализирующим агентом.

Настоящее изобретение относится к мультиполипептидным композициям, в которых более чем один полипептид присутствует в виде конкретного отдельного соединения. Таким образом, белок BLyS может быть, например, присоединен к токсину гелонин, например ко второму, третьему, четвертому, пятому, шестому, седьмому или более полипептиду.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаются наборы для лечения и/или профилактики В-клеточных пролиферативных расстройств, содержащие композицию, содержащую полипептид BLyS, конъюгированный с другой молекулой, такой как, например, цитотоксический агент или фармацевтический агент. В конкретных вариантах осуществления композиция содержит слитый белок rGel и BLyS и/или полинуклеотид, его кодирующий.

Таким образом, в вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, содержащая полипептид BLyS, конъюгированный с дополнительной молекулой, включающей молекулу, которая не идентична полипептиду BLyS. В конкретных аспектах дополнительная молекула не является гомологом BlyS. В конкретных аспектах настоящего изобретения дополнительная молекула содержит, например, фармацевтический агент, хелат или цитотоксический агент. Компоненты композиции могут быть включены в состав слитого белка или могут быть, например, химически конъюгированы. Композиция по настоящему изобретению может содержать рекомбинантный полипептид и/или полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный полипептид. В конкретных аспектах композиция также содержит радиоактивный агент, клеточный визуализирующий агент или оба агента. Указанная композиция может быть включена в состав фармацевтически приемлемого носителя.

В конкретных аспектах полипептида BlyS полипептид включает В-клеточный направленный домен, который содержит петлю D-E для распознавания рецептора, включает всю или только функциональную часть последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 и/или содержит функциональный эквивалент BLyS, где последовательность указанного функционального эквивалента обладает по меньшей мере 80% гомологией к SEQ ID NO: 1 или к SEQ ID NO: 2.

В тех вариантах осуществления настоящего изобретения, где используют цитотоксический агент, указанный цитотоксический агент может быть любого подходящего вида, тогда как в некоторых вариантах цитотоксический агент включает пептид, полипептид или, например, малую молекулу. В конкретных аспектах цитотоксический пептид включает пептид гелонина, который в вариантах осуществления, приведенных в качестве примера, находится в 5' положении по отношению к полипептиду BLyS. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения пептид гелонин содержит SEQ ID NO: 7. В других конкретных вариантах осуществления изобретения пептид гелонин содержит аминокислотные остатки 110-210

последовательности SEQ ID NO: 7.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения цитотоксический агент выбран из группы, состоящей, например, из рицина А, дифтерийного токсина, абрина, додекандрина, трикозантина, трикокирина, бриодина, антивирусного агента из Mirabilis, белка, инактивирующего рибосомы ячменя (BRIP), антивирусного белка из лаконоса (PAP), сапорина, люффина, экзотоксина Pseudomonas и момордина.

В некоторых аспектах осуществления настоящего изобретения указанная композиция содержит, например, SEQ ID NO: 8 и/или SEQ ID NO: 10.

В конкретных аспектах настоящего изобретения рассматривается клетка-хозяин, содержащая композицию по настоящему изобретению. В других конкретных аспектах настоящего изобретения предлагается выделенный полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере часть композиции по настоящему изобретению, включая всю композицию. В конкретных вариантах осуществления полинуклеотид содержит SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается способ лечения индивидуума с В-клеточным пролиферативным расстройством, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей полипептид BLyS, конъюгированный с дополнительной молекулой, такой как, например, цитотоксический агент. Данный способ может также включать введение индивидууму агента, который, например, повышает экспрессию рецептора BLyS. В конкретных аспектах осуществления настоящего изобретения BLyS выбран из группы, состоящей из TNFRSF13B/TACI (SEQ ID NO: 4), TNFRSF17/BCMA (SEQ ID NO: 5) и TNFRSF13C/BAFFR (SEQ ID NO: 6).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается способ селективного направленного воздействия на клетку, экспрессирующую рецептор BLyS, включающий контактирование данной клетки с композицией, содержащей полипептид BLyS, конъюгированный с цитотоксическим агентом.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается способ мониторинга терапии индивидуума с В-клеточным пролиферативным расстройством, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей полипептид BLyS, конъюгированный с цитотоксическим агентом, и визуализирующий агент.

Приведенное выше в общих чертах описывает признаки и технические преимущества настоящего изобретения для большей ясности приведенного ниже подробного описания настоящего изобретения. Дополнительные признаки и преимущества настоящего изобретения описаны и формируют ниже заявляемые по настоящему изобретению объекты. Специалистам в данной области понятно, что концепция и конкретные описанные варианты осуществления могут быть использованы в качестве основы для последующего изменения или разработки других структур для достижения тех же целей, что и цели настоящего изобретения. Для специалистов в настоящей области также очевидно, что такие эквивалентные по строению конструкции не будут выходить за рамки и менять сущность настоящего изобретения, приведенного в настоящем описании. Новые признаки, которые, как полагают, будут характерны для настоящего изобретения как с точки зрения организации, так и способов осуществления, в сочетании с другими дополнительными объектами и признаками могут быть лучше поняты из приведенного ниже описания, которое наиболее полно представит изобретение в сочетании с приведенными фигурами. Указанные особенности приведены в явном виде, однако каждая из предлагаемых фигур дана с целью иллюстрации и описательной целью и их не следует рассматривать как ограничивающие область настоящего изобретения.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Для более полного понимания настоящего изобретения ниже приведено описание фигур для лучшего понимания описания изобретения.

На фиг.1 показана примерная ориентация BLyS и rGel.

На фиг. 2 показана репрезентативная последовательность ДНК (SEQ ID NO: 9) и последовательность белка (SEQ ID NO: 8) слитого токсина BLyS/rGel.

На фиг.3 показана репрезентативная последовательность ДНК (SEQ ID NO: 11) и последовательность белка (SEQ ID NO: 10) слитого токсина rGel/BLyS.

На фиг.4 проиллюстрирована конструкция репрезентативного слитого токсина rGel/BLyS. Получен слитый токсин rGel/BLyS, содержащий rGel на N-конце, за которым следует пептид G4S, присоединенный к молекуле BLyS с использованием ПЦР по методу перекрывающегося сплайсинг-расширения. Рекомбинантную конструкцию ДНК rGel/BLyS вводят в сайты рестрикции ферментов Kpn I и Xho I в векторе pET-32a с получением вектора экспрессии pET32rGel/BLyS.

На фиг.5 показана процедура очистки слитого токсина rGel/BLyS. По результатам окрашивания Кумасси-блю при проведении электрофореза в SDS-PAGE слитого токсина rGel/BLyS показатель M _r для rGel/BLyS имеет значение 45кДа, демонстрируя молярное соотношение 1:1 BLyS и rGel (левая панель). Результаты вестерн-блоттинга с использованием антигелонинового антитела или анти-BLyS антитела показывают, что слитый токсин rGel/BLyS содержит токсин и BLyS в слитом токсине (правая панель).

На фиг.6 продемонстрирована ингибирующая активность в бесклеточной системе белкового синтеза слитого токсина rGel/BLyS. Для определения n-гликозидазной активности компонента rGel в слитом токсине rGel/BLyS этот материал добавляют к тесту для трансляции in vitro с использованием теста для оценки включения [³H]-лейцинами, изолированными ретикулоцитами кролика. Сравнивают кривые ингибирования для слитого токсина rGel/BLyS и нативного rGel.

На фиг. 7 продемонстрированы результаты сравнения rGel/BLyS и слитого токсина BLyS/rGel против клеточной линии клеток мантии JEKO. Клетки линии клеток мантии JEKO высевают (с плотностью 5·10³/лунку) в лунки 96-луночных микротитрационных планшетов с плоским дном и добавляют в лунки в четырехкратном повторе rGel, rGel/BLyS или BLyS/rGel. Через 96 часов к каждой лунке добавляют по 75 мкл ХТТ-меченой смеси, после чего клетки инкубируют еще в течение 4 часов. Определяют поглощение на спектрофотометре при длине волны 450 нм с использованием счетчика для ELISA.

На фиг. 8А-8М показаны кривые зависимости доза-ответ для слитого токсина rGel/BLyS против различных опухолевых клеточных линий: Jurkat (8A), KBM-5 (8B), THP-1 (8C), HL-60 (8D), IM-9 (8E), MM1.S (8F), ММ1.R (8G), RPMI18226 (8H), 8226/LR-5 (8I), JEKO (8J), SP53 (8K), Mino (8L) и Granta (8M). Клетки тринадцати опухолевых клеточных линий высевают (с плотностью 5·10³/лунку) в лунки 96-луночных микротитрационных планшетов с плоским дном и добавляют в лунки в четырехкратном повторе rGel или rGel/BLyS. Через 96 часов к каждой лунке добавляют по 75 мкл ХТТ-меченой смеси, после чего клетки инкубируют еще в течение 4 часов. Определяют поглощение на спектрофотометре при длине волны 450 нм с использованием счетчика для ELISA.

На фиг. 9 продемонстрирована специфичность слитого токсина rGel/BLyS для клеточной линии клеток мантии JEKO, экспрессирующих рецепторы BLyS. Клетки линии клеток мантии JEKO высевают (с плотностью 5·10³/лунку) в лунки 96-луночных микротитрационных планшетов с плоским дном и добавляют в лунки в четырехкратном повторе BLyS, rGel, CTP/rGel и rGel/BLyS. Через 96 часов к каждой лунке добавляют по 75 мкл ХТТ-меченой смеси, после чего клетки инкубируют еще в течение 4 часов. Определяют поглощение на спектрофотометре при длине волны 450 нм с использованием счетчика для ELISA.

На фиг. 10 представлены кривые зависимости доза-ответ для слитого токсина rGel/BLyS против различных дексаметазон-чувствительных (MM1.S) и дексаметазон-резистентных (MM1.R) клеток клеточной линии множественной миеломы. Клетки клеточных линий MM1.S и MM1.R высевают (с плотностью 5·10³/лунку) в лунки 96-луночных микротитрационных планшетов с плоским дном и добавляют в лунки в четырехкратном повторе rGel, Dex или rGel/BLyS. Через 96 часов к каждой лунке добавляют по 75 мкл ХТТ-меченой смеси, после чего клетки инкубируют еще в течение 4 часов. Определяют поглощение на спектрофотометре при длине волны 450 нм с использованием счетчика для ELISA.

На фиг. 11 проиллюстрирована максимальная переносимая доза (MTD) для rGel/BLyS. Для получения значения MTD для rGel/BLyS различные концентрации rGel/BLyS инъецируют мышам Balb/C в течение 5 последовательных дней внутривенно в хвостовую вену и определяют массу тела и количество выживших мышей.

На фиг. 12 продемонстрирована специфичность rGel/BLyS к клеткам, экспрессирующим рецептор BLyS (фиг. 14А). Активность по связыванию с рецептором фрагмента BLyS компонента в rGel/BLyS определяют по методу ELISA с использованием интактных клеток JeKo-1 и HL-60 (фиг. 14B). Для определения удельной активности rGel/BLyS против трех клеточных линий лимфомы клеток мантии (MCL), экспрессирующих один или несколько рецепторов BLyS, клетки клеточной линии JeKo-1 MCL высевают (с плотностью 5·10³/лунку) в лунки 96-луночных микротитрационных планшетов с плоским дном и добавляют в лунки в четырехкратном повторе BLyS, rGel, CTP/rGel или rGel/BLyS. Через 96 часов к каждой лунке добавляют по 50 мкл ХТТ-меченой смеси, после чего клетки инкубируют еще в течение 4 часов или в течение ночи. Определяют поглощение на спектрофотометре при длине волны 450 нм с использованием счетчика для ELISA.

На фиг. 13A-13B проиллюстрировано конкурентное ингибирование под действием rGel/BLyS на клетках JeKo-1. Для проведения теста на конкурентное ингибирование клетки JeKo-1 высевают (с плотностью 5×10³/лунку) в лунки 96-луночных микротитрационных планшетов с плоским дном (Becton Dickinson) и проводят предварительную обработку с использованием 1 нМ BLyS, 50 нМ BLyS (фиг. 15А), 10 мкг/мл BAFF-R:Fc, 10 мкг/мл TACI:Fc или 10 мкг/мл BCMA:Fc (фиг. 15В) в течение 2 часов и затем добавляют в лунки в четырехкратном повторе rGel, BLyS или rGel/BLyS. Через 96 часов к каждой лунке добавляют по 50 мкл ХТТ-меченой смеси (Roche), после чего клетки инкубируют еще в течение 4 часов или в течение ночи. На спектрофотометре определяют поглощение при длине волны 450 нм с использованием счетчика для ELISA.

На фиг. 14А-14С показаны эффекты rGel/BLyS на апоптоз (14А) и вид клеток JeKo-1 под микроскопом после обработки. Клетки JeKo-1 обрабатывают с использованием 100 пМ BLyS, 100 пМ rGel или 100 пМ rGel/BLyS. Через 96 часов оценивают наличие в клетках JeKo-1 апоптоза при проведении окрашивания по методу TUNEL (фиг. 14В). Количество апоптозных клеток подсчитывают в случайно выбранных полях (увеличение × 200) и выражают в процентах. Для выявления эффекта rGel/BLyS на апоптоз клетки JeKo-1 или Granta 519 высевают с плотностью 5×10⁵/клеток в лунки 24-луночного планшета и затем обрабатывают с использованием 100 пМ BLyS, 100 пМ rGel или 100 пМ rGel/BLyS. После обработки клетки собирают, промывают и лизируют в 0,2 мл буфера для лизирования. Клеточные лизаты (50 мкг) фракционируют при проведении электрофореза в 8-15% SDS-PAGE и электрофоретически переносят на нитроцеллюлозные мембраны Immobilon-P. Мембраны блокируют и затем зондируют различными антителами (фиг. 14С). Используют вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, для визуализации иммунореактивных белков с использованием выявляющего реагента ECL. Актин используют в качестве контроля на белковую нагрузку.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В контексте настоящего описания термин «другой» может обозначать по меньшей мере второй или еще больше. Несколько вариантов осуществления настоящего изобретения могут состоять или состоять, по существу, из одного или большего числа элементов, стадий осуществления методики и/или методик по настоящему изобретению. Считается, что любой способ или композиция, приведенные в настоящем описании, могут быть осуществлены применительно к любому другому способу или композиции, приведенных в настоящем тексте.

I. Определения

Термин «конъюгированный» в контексте настоящего описания относится к некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения, в которых имеет место присоединение BLyS молекулы к молекуле цитотоксического агента. Указанное присоединение может осуществляться любыми подходящими методиками из числа известных в данной области, тогда как в некоторых аспектах присоединение происходит путем рекомбинации, с помощью линкера и т.п. В конкретных аспектах используется ионная ассоциация, такая как, например, с использованием авидин-биотиновой связи.

II. Настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям, которые направленно воздействуют на аномально пролиферирующие В-клетки, которые демонстрируют пристутствие рецепторов для полипептидов BLyS. Нормально пролиферирующем B-клетки, а также другие типы клеток, не экспрессируют рецепторы BLyS. Полипептиды по настоящему изобретению включают полипептид BLyS, который служит в качестве направленного домена, и цитотоксический пептид, который снижает или устраняет пролиферацию одной и