Производные 4,6-диметил-2,3-дигидро-1н-пиразоло[4,3-c]пиридин-3-онов и эфиры 2,6-диметил-4-фенил-гидразиноникотиновых кислот в качестве промежуточных продуктов для их синтеза, обладающие антидепрессантной и анксиолитической активностью

Производные 4,6-диметил-2,3-дигидро-1н-пиразоло[4,3-c]пиридин-3-онов и эфиры 2,6-диметил-4-фенил-гидразиноникотиновых кислот в качестве промежуточных продуктов для их синтеза, обладающие антидепрессантной и анксиолитической активностью

Реферат

Изобретение относится к химии биологически активных соединений, конкретно к производным 4,6-диметил-2-(n-R-фенил)-2/3-дигидро-1Н-пиразоло[4,3-с]пиридин-3-онов (соединения 1а-б):

а также к эфирам 2,6-диметил-4(n-R-фенилгидразино) никотиновой кислоты (соединения II), служащим промежуточными соединениями в синтезе соединений I

При изучении фармакологической активности обеих групп соединений было установлено, что они обладают антидепрессантным и анксиолитическим действием.

Известно, что некоторые производные пиразоло[С]пиридинов, а также производные пиразоло[b]пиридинов проявляют разнообразную биологическую активность, в частности анксиолитическую, противосудорожную, антидепрессантную [J.Kitaura et al., J. Med. Chem., 1982, Vol.25, № 4, pp.337-339; S.Takada et al., J. Med. Chem., 1988, Vol.31, № 9, pp.1738-45; M.S.Allen et al., J. Med. Chem., 1992, Vol.35, pp.368-374; J.T.Forbes et al., J. Amer. Chem., 1990, Vol.33, № 9, pp.2640-45; M.Williams, J. Med. Chem., 1983, Vol.26, № 5, pp.619-628].

В ряду производных пиразоло[b]пиридинов известны вещества с антидепрессантной и анксиолитической активностью (тракозолат, картазолат), но в медицинской практике они нашли ограниченное применение в качестве анксиолитиков [Lecci, A., Borsini, F., Gragnani, L., Volterra, G. and Meli, A., Effect of psychotomimetics and some putative anxiolytics on stress-induced hyperthermia. Journal of Neural Transmission General Section, 83 (1991) 67-76; VonVoigtlander, P.F. and Lewis, R.A., A rapid screening method for the assessment of benzodiazepine receptor-related physical dependence in mice. Evaluation of benzodiazepine-related agonists and partial agonists. Journal of Pharmacologlcal Methods, 26 (1991) 1-5].

Среди пиразоло[с]пиридинов веществ, проявивших достоверную антидепрессантную активность, до настоящего времени описано не было.

Тревожно-депрессивные расстройства - одна из наиболее распространенных форм психической патологии. По данным Всемирной организации здравоохранения, заболеваемость депрессиями на сегодняшний день приближается к 3%, то есть ежегодно около 180 миллионов жителей нашей планеты обнаруживают признаки депрессии и нуждаются в адекватной медицинской помощи. При сочетании тревожных и депрессивных расстройств отмечается уменьшение эффективности лечения, ухудшение прогноза заболевания.

В настоящее время для лечения депрессий используется целый ряд лекарственных препаратов. Это трициклические антидепрессанты, прежде всего амитриптилин и имизин, ингибиторы МАО, пиразидол и моклобемид, неселективные ингибиторы обратного захвата норадреналина, дезипрамин, нортриптилин, мапротилин. Эти вещества оказывают мощное антидепрессантное действие и наиболее эффективны при лечении тяжелой депрессии. Однако они имеют выраженные побочные эффекты, кардиотоксический и антихолинергический, высокую летальность при передозировке, что ограничивает их использование. Поэтому их относят к так называемым «старым антидепрессантам» и стараются использовать «новые антидепрессанты». Это избирательные ингибиторы обратного захвата серотонина (СИОЗС), такие как флуоксетин, пароксетин, сертралин, флувоксамин, циталопрам, селективные ингибиторы обратного захвата норадреналина (ребокситин), ингибиторы обратного захвата медиаторов двойного или смешанного действия (венлафаксин, милнаципран, бупропион, дулоксетин). Эти препараты по мощности эффекта уступают «старым» или типичным антидепрессантам, но оказывают незначительное кардиотоксическое и антихолинергическое действие, имеют низкую или умеренную летальность при передозировке. Поэтому «новые антидепрессанты» имеют благоприятное соотношение «польза/риск» и рассматриваются в качестве препаратов выбора у большинства больных с нетяжелой депрессией, особенно в общесоматической практике [А.В.Ушкалова. Современные антидепрессанты: проблемы рационального выбора. Фарматека, 2006, специальный выпуск «Психиатрия/Неврология», с.9-19]. Этим обусловлен выбор в качестве эталонного препарата флуоксетина (Fluoxetine (±)-N-метил-гамма-[4-(трифторметил)фенокси]бензол пропанамин (и в виде гидрохлорида); рацемическая (50/50) смесь R и S-энантиомеров). Флуоксетин Ланнахер, фирма Lannacher Heilmittel (Австрия). См.: Регистр лекарственных средств России РЛС Энциклопедия лекарств. - 14-й вып. / Гл. ред. Г.Л.Вышковский. - М.: РЛС-2006, 2005. - С.862-864. Фармгруппа 9.2), наиболее изученного представителя группы СИОЗС [Prescrire. Int.; 10 (51): 25-31, (2001)], широко применяемого в клинической практике.

Однако и этим антидепрессантам свойственны недостатки. Их применение может вызывать нарушения сна, аппетита, тошноту, рвоту, диарею, снижение половой функции. Одним из наиболее типичных побочных эффектов СИОЗС является усиление тревоги в первые дни приема, что осложняет применение препаратов при лечении сочетанных тревожно-депрессивных расстройств.

Поэтому поиск новых антидепрессантов, менее токсичных, лишенных побочных эффектов и оказывающих противотревожное действие, остается актуальным.

Заявляемые вещества (соединения I и II) обладают выраженным антидепрессантным эффектом, который при сравнении с эффектом наиболее изученного и широко применяемого флуоксетина более выражен при изучении на модели вынужденного плавания, не сопровождается признаками возбуждения при введении высоких доз. Соединение I имеет более низкую токсичность (LD₅₀ флуоксетина у крыс составляет 452 мг/кг, для соединения Ia - 825,3 мг/кг).

Технический результат заявляемого изобретения заключается в синтезе 2-х новых групп соединений, одна из которых (соединения IIa-б) служат промежуточными для получения гетероциклических (соединения Ia-б) пиразоло[4,3-с]пиридинов, у которых при их фармакологическом изучении была обнаружена высокая антидепрессантная активность, превосходящая активность флуоксетина. При этом их антидепрессантные свойства сочетаются с анксиолитическим действием, что позволяет использовать вышеуказанные соединения для лечения тревожно-депрессивных расстройств.

Заявляемые соединения I и II были синтезированы по схеме:

где а) R=Cl, б) R=COOC₂H₅

При алкилировании этилового эфира 4-хлор-2,6-диметил-никотиновой кислоты III 1 молем соответствующего фенилгидразина (IVa-б) в кипящем спирте образуются эфиры IIa-б, а при нагревании соединения III с 2 молями гидразина (IVa-б) при 140-150°С без растворителя, или в ДМФА, или в ксилоле получаются пиразоло[с]пиридины Ia-б. Для улучшения выхода продукта и его чистоты соединение Ia получают щелочным гидролизом соединения IIa.

Экспериментальная химическая часть

ИК-спектры получены на спектрометре «Perkin-Elmer 580» в KBr. ПМР и ЯМР ¹³С спектры сняты на приборе «Bruker-AC 250», внутренний стандарт - ТМС.

Данные о физико-химических свойствах приведены в таблицах 1 и 2.

Пример 1.

Этиловый эфир 2,6-диметил-4-(4-хлорфенилгидразино) никотиновой кислоты, гидрохлорид (соединение II а).

Смесь 1 г (5 ммоль) этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорникотиновой кислоты (III) и 0,73 г (5,1 ммоль) 4-хлорфенилгидразина (IVa) в 15 мл этанола кипятят 4 ч, реакционную массу упаривают досуха, остаток обрабатывают эфиром и получают 1,45 г соединения IIa.

Этиловый эфир 2,6-диметил-4-(4-этоксикарбонилфенилгидразино)никотиновой кислоты, гидрохлорид (соединение IIб) получают аналогично соединению IIa из соединений III и IVб.

Пример 2.

4,6-диметил-2-(4-хлорфенил)-2,3-дигидро-1Н-пиразоло[4,3-с]пиридин-3-он, гидрохлорид (соединение Ia).

А) Смесь 1 г (5 ммоль) этилового эфира 4-хлор-2,6-диметилникотиновой кислоты (III) и 1,42 г (10 ммоль) 4-хлорфенилгидразина (IIa) нагревают 4 ч при 150°С, к реакционной массе добавляют 70 мл ацетона, нагревают до кипения и оставляют на 1 ч. Осадок отфильтровывают, промывают эфиром и получают 0,8 г основания соединения Ia, которое растворяют в 150 мл спирта, добавляют эфирный хлористый водород и получают 0,8 г гидрохлорида Ia.

Б) Смесь 16 г (50 ммоль) основания соединения IIa и 5,6 г (100 ммоль) калия гидроксида в 160 мл воды кипятят 5 ч, образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают водой, уксусной кислотой, водой и получают 2,5 г основания соединения 1. Из щелочного раствора подкислением уксусной кислотой выделяют 9,07 г основания соединения Ia. Общий выход Ia 11,57 г (84,4%), температура плавления 300°С (разл. из ацетона). Основание переводят действием эфирного HCl в соединение Ia, выход 11,5 г.

Пример 3.

4,6-диметил-4(п-этоксикарбонилфенил)-2,3-дигидро-1H-пиразоло[4,3-с]пиридин-3-он, гидрохлорид (соединение Iб).

Смесь 3,18 г (15 ммоль) этилового эфира 4-хлор-2,6-диметилникотиновой кислоты (III) и 3,24 г (18 ммоль) 4-этоксикарбонилфенилгидразина (IVб) в 15 мл сухого диметилформамида нагревают 10 ч при 120-130°С, фильтруют и получают 1,95 г основания соединения 1б. Из фильтрата добавлением эфира высаживают дополнительно 1 г основания. Общий выход основания соединения Iб - 2,95 г (63,5%), которое действием эфирного HCl переводят в гидрохлорид и получают 2,90 г соединения Iб.

Фармаколотческое изучение заявляемых соединений.

Изучение антидепрессивной активности соединений.

Антидепрессивную активность соединений изучали с помощью модели вынужденного плавания у крыс - теста отчаяния (Андреева Н.И. Методические указания по изучению антидепрессантной активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (до клиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Издание второе, переработанное и дополненное. /Гл. ред. Р.У.Хабриев. - М., 2005. - С.244-252) по методикам Porsolt et al. (Eur. J. Pharmacol., Vol.47, P.379-391, 1978) и S.Nomura et al. (Eur. J. Pharmacol. - Vol.83, № 3-4. - P.171-175, 1982). Исследования проводили на белых беспородных крысах-самцах возраста 2-2,5 месяца и массой 220-250 г.

Для оценки антидепрессивного эффекта соединений по методу Nomura et al. (1984) в тесте вынужденного плавания у крыс в сосуде с водой и свободно вращающимися колесами была использована четырехканальная установка, разработанная в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН (Молодавкин Г.М., Воронина Т.А., Мдзинаришвили А.Л. Особенности влияния фармакологических веществ разных классов на вынужденное плавание у крыс. Эксперим. и клин. фармакол., 1994, т.57, № 1, с.3-5). Установка представляет собой сосуд размером 64×30×42 см, разделенный на 4 равных отсека. В отсеках находятся колеса шириной 11 см с 12 лопастями шириной 2 см, наружный диаметр колес 10 см. На краях каждого колеса укреплены магниты, а над колесами - герконы, которые срабатывают каждый раз, когда магнит проходит под ними. Так происходит автоматическая регистрация оборотов колес, которая является объективной мерой активности животных. Сосуд заполняли водой с температурой 25°С до середины колес. Крыс помещали в каждый отсек мордой от колеса и регистрировали число оборотов колес в течение 10 мин с помощью электромеханических счетчиков.

Эффект каждого соединения изучали на 10 животных, вещества суспендировали с помощью твина-80 и вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг за 40 мин до опыта. Сравнение проводили с антидепрессантом флуоксетином.

Установлено, что соединение Ia, соединения IIa-б достоверно увеличивают число оборотов колес по сравнению с контрольной группой (Таблица 3). Максимальный эффект, превышающий эффект флуоксетина, отмечен у соединения Ia.

Исследованные соединения проявляли также высокую эффективность и в тесте вынужденного плавания у крыс по методике Porsolt. Оценку эффекта соединений проводили в сравнении с флуоксетином.

Через 40 мин после введения препаратов животных помещали в сосуд с водой диаметром 40 см и глубиной 60 см, так чтобы крыса не могла ни выбраться из сосуда, ни найти в нем опору. В такой ситуации животное вынуждено совершать активные плавательные движения, чтобы выбраться, или зависнуть в воде и совершать незначительные гребущие движения для поддержания морды над поверхностью воды. Температура воды поддерживалась на уровне 25°С. Состояние иммобилизации оценивали визуально с определением ее длительности в течение 10 мин наблюдения.

Установлено, что соединения Ia, б и IIa-б достоверно уменьшают время неподвижности крыс по сравнению с контрольной группой (Таблица 4). Также обнаружено, что эффект соединения Ia сопоставим с эффектом флуоксетина в тесте вынужденного плавания у крыс по Porsolt.

Изучение анксиолитической активности соединений.

Анксиолитическую активность соединений Ia-б и IIa-б изучали в тесте конфликтной ситуации, основанной на столкновении питьевой и оборонительной мотивации (Воронина Т.А., Середенин С.Б. Методические указания по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Издание второе, переработанное и дополненное. /Гл. ред. Р.У.Хабриев. - М., 2005. - С.253-262). Исследования проводили на белых беспородных крысах-самцах возраста 2-2,5 месяца и массой 220-250 г.

Предварительно животных лишали воды и сочных кормов на 24 ч, а затем вырабатывали навык взятия воды из поилки, помещая крысу в камеру, где она находила поилку с водой и начинала пить. Камера имеет размер 275×275×450 мм, электродный пол и поилку с водой (сосуд с соском на стене), расположенную на высоте 5 см от пола. Для проведения конфликтной ситуации использована четырехкамерная установка, разработанная в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН (Молодавкин Г.М., Воронина Т.А. Многоканальная установка для поиска транквилизаторов и изучения механизмов их действия по методу конфликтной ситуации. Эксперим. и клин фармакол., 1995 т.58, №2, с.54-56).

Тренировку проводили в течение 5 мин, что позволяло развить навык взятий воды у крыс и не дать животным напиться перед опытом, т.е. сохранить питьевую мотивацию. На следующий день крысу помещали в камеру на 10 мин и через 10 секунд после начала питья каждое взятие воды наказывается электроболевым раздражением. В эксперименте используется ток силой 0,5 мА, позволяющий обнаружить анксиолитики средней силы. В результате, чтобы удовлетворить питьевую мотивацию, крыса должна преодолеть чувство страха перед наказанием. Число наказуемых взятий воды за 10 мин нахождения в камере является мерой анксиогенного состояния. Транквилизаторы устраняют чувство тревоги и страха и увеличивают число наказуемых взятий воды.

Анксиолитический эффект соединения Ia исследовали в дозах 5, 10 и 20 мг/кг, остальных соединений - в дозе 20 мг/кг. Эффект соединений в каждой дозе изучали на 10 животных. Вещества суспендировали с помощью твина-80 и вводили внутрибрюшинно за 40 мин до опыта. В качестве препарата сравнения использован диазепам в дозе 5 мг/кг и флуоксетин в дозе 20 мг/кг.

Установлено, что анксиолитические эффекты соединения Ia в дозах 10 и 20 мг/кг, соединения 11б достоверно превышают эффект контрольной группы в тесте конфликтной ситуации. Соединение Ia проявляет максимальный анксиолитический эффект в дозе 20 мг/кг, превышающий эффект диазепама и флуоксетина (Таблица 5).

Изучение острой токсичности и возможных побочных эффектов соединения Ia.

Острая токсичность соединения Ia при его внутрибрюшинном введении в возрастающих дозах 300, 400, 500, 600, 800 и 900 мг/кг оценивалась в опытах на беспородных белых крысах-самцах массой 220-250 г при постоянной температуре окружающей среды (20-21°С) (Арзамасцев Е.В., Гуськова Т.А., Березовская И.В. и др. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Издание второе, переработанное и дополненное. /Гл. ред. Р.У.Хабриев. - М.:2005. - С.41-53). Гибель животных регистрировали через 24 часа после введения соединения Ia. Установлено, что ЛД₅₀ при внутрибрюшинном введении крысам составляет 825,3 мг/кг.

При оценке миорелаксантного действия соединения Ia обнаружено, что животные, которым предварительно вводили соединение Ia в дозе 150 мг/кг, легко удерживаются на вращающемся стержне, проявляя при этом выраженную исследовательскую активность. Все крысы данной группы легко восстанавливают рефлекс подтягивания на горизонтальной перекладине и не уступают животным контрольной группы. Таким образом, соединение Ia при внутрибрюшинном введении доз, в 7,5 раз превышающих терапевтические (180 мг/кг), не вызывает миорелаксации в отличие от диазепама. Установлено, что ED₅₀ миорелаксантного эффекта вещества 1а при внутрибрюшинном введении крысам составляет 243,6 мг/кг.

При оценке седативного эффекта соединения Ia путем исследования его влияния на горизонтальную активность крыс установлено, что соединение Ia в дозе 20 мг/кг не обладает седативным эффектом, характерным для диазепама.

Заключение

Выполненные исследования выявили выраженный антидепрессивный эффект соединений Ia-б, IIa-б. При этом эффект наиболее активного соединения Ia превышает эффект флуоксетина.

В отличие от флуоксетина, повышающего тревожность, у соединений предложенного ряда обнаружен анксиолитический эффект. Установлено, что соединение Ia проявляет анксиолитический эффект, превышающий эффект диазепама.

Наряду с вышесказанным, соединение 1а имеет низкую токсичность и не вызывает миорелаксантного и седативного эффектов, характерных для диазепама.

Токсичность флуоксетина по литературе составляет 452 мг/кг у крыс (для соединения Ia этот показатель равен 825,3 мг/кг).

Заявленные соединения не вызывают побочных эффектов, свойственных флуоксетину: повышение тревожности, нарушения сна, аппетита, тошноту, рвоту, диарею.

Таблица 1
Характеристика синтезированных соединений
Соединение	Выход в %	Тплавл. в °С Растворитель	Брутто-формула	ИК-спектр νmax см-1	ПМР-спектр (ДМСО-d6), δ т.д.
1	2	3	4	5	6
Ia	А) 55,0	>320 этанол	C14H12ClN3O·HCl	-	2,40 с (3Н, 6-СН3), 2,74 с (3Н, 2-СН3), 6,84 с (1Н, 5-Н Рy), 7,49 и 8,08 м (4Н АА 'хх', ArH), 12,95 шир с (1Н, N+H)
Б) 74,2
Iб	55,9	237-238 этанол	C17H17N3O3·HCl		1,30 (3Н, т, СН3-эт), 2,33 (3Н, С, 6-СН3), 2,68 (3Н, С, 2-СН3), 4,28 (2Н, кв, СН2-этил), 6,75 (1Н, С 5-Н Рy), 7,98 и 8,24 (4Н, м, Ar), 12,43 (ш.с., NH+ Рy)
IIa	86,9	198-199	C16H18ClN3O2·HCl	3170 и 3073 (С, шир. νNH) 1647 (νco) 1615	1,33 (3Н, Т, СН3-эт), 2,63 (2,38 2-й изомер), (6Н, С, 2-СН3), 4,38 (2Н, кв.,СН2 эт), 6,76 и 7,27 (4Н, м, ArH), 7,04 (6,89 2-й изомер) (1Н, с, РyН), 8,73 (8,61 - 2-й изомер) и 10,02 (10,69 2-й изомер (2Н, два c, NH-NH), 14,27 (1H, м.c., NH кольца)
IIб	87,3	197-198 (разл.) абсолютный этанол	C19H23N3O4 ·HCl	3560 и 3290 (С, шир. νNH) 1690 (νco) 1610 и 1598 (дублет)	1,29б и 1,34м (6Н, два т от 2-х изомеров, СН3-эт), 2,50б и 2,63м (6Н по 2С, 2СН3), 4,25б и 4,40м (4Н, два кв. СН2-эт), 6,82 и 7,85 (4Н, два д AR-H), 6,95м и 7,01б (1Н, два с, NH), 10,12б и 10,87м (1Н, два с, NH), 14,4 (1Н, оч.м. С N+H-кольца)

Таблица 2
Данные элементного анализа
Соединение	Найдено, %	Вычислено, %
С	Н	Cl	N	С	Н	Cl	N
Ia	54,21	4,15	22,79	13,45	54,20	4,22	22,86	13,55
Iб	58,28	5,14	10,08	12,34	58,70	5,21	10,19	12,08
IIa	53,88	5,35	19,92	11,77	53,94	5,38	19,90	11,80
IIб	57,86	6,13	8,99	10,46	57,93	6,14	9,00	10,66

Таблица 3
Антидепрессивный эффект соединений в тесте вынужденного плавания у крыс по методике S.Nomura
Группа	Доза, мг/кг/кг	Число оборотов колес
Контроль	-	94,3±15,6
Соединение Ia	20	189,5±34,9*
Соединение Iб	20	89,1±17,5
Соединение IIa	20	162,8±35,2*
Соединение IIб	20	128,7±17,9*
Флуоксетин	20	130,6±7,4*
Примечание: * - различие с контрольной группой достоверно при Р<0,05.

Таблица 4
Антидепрессивное действие соединений в тесте вынужденного плавания по методике Porsolt
Группа	Доза, мг/кг/кг	Время неподвижности, (с)
Контроль	-	462,4±29,4
Соединение Ia	20	378,2±21,1*
Соединение Iб	20	459,7±24,6
Соединение IIa	20	405,3±19,9*
Соединение IIб	20	389,7±22,3*
Флуоксетин	20	396,4±20,9*
Примечание: * - различие с контрольной группой достоверно при Р<0,05.

Таблица 5
Анксиолитическое действие соединений в тесте конфликтной ситуации
Группа	Доза, мг/кг/кг	Число наказуемых взятий воды
Контроль	-	13,29±4,2
Соединение Ia	5	13,5±7,3
Соединение Ia	10	41,7±19,8*
Соединение Ia	20	83,5±25,1*
Соединение Iб	20	29,2±5,9
Соединение IIa	20	8,7±3,6
Соединение IIб	20	42,6±9,6*
Диазепам	5	26,3±5,8*
Флуоксетин	20	6,4±2,2*
Примечание: * - различие с контрольной группой достоверно при Р<0,05.

1. Производные 4,6-диметил-2,3-дигидро-1Н-пиразоло[4,3-с]пиридин-3-онов общей формулы: где производное с R'=Cl - соединение 1а,производное с R'=СООС₂Н₅ - соединение 1б.

2. Соединение 1а по п.1, представляющее собой 4,6-диметил-2-(пара-хлорфенил)-2,3-дигидро-1Н-пиразоло[4,3-с]пиридин-3-он.

3. Соединение по пп.1 и 2, обладающее антидепрессивной и анксиолитической активностью.

4. Эфиры 2,6-диметил-4-(пара-R'-фенилгидразино)-никотиновой кислоты общей формулы: где при R=СООС₂Н₅; R'=Cl - соединение 2а,при R=R'=СООС₂Н₅ - соединение 2б,в качестве промежуточных веществ в синтезе соединений 1а, б по п.1.

5. Соединения по п.4, обладающие антидепрессивной и анксиолитической активностью.