Производные кобаламина, предназначенные для диагностики и лечения аномальной пролиферации клеток

Производные кобаламина, предназначенные для диагностики и лечения аномальной пролиферации клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам визуализации и подавления нежелательных, быстро пролиферирующих клеток в многоклеточных организмах.

Предпосылки создания изобретения

Аномальная пролиферация клеток, прежде всего гиперпролиферация, является источником множества заболеваний, из которых наиболее тяжелым является рак. Только в США каждый год диагноз рака зарегистрирован приблизительно у 1,5 млн человек и летальный исход от рака у 0,5 млн человек. В настоящее время, несмотря на значительный прогресс в лечении рака, способы лечения характеризуются множеством недостатков. Основные проблемы связаны с тяжелыми побочными действиями противоопухолевых средств и с развитием поколения устойчивых раковых клеток, а также ранняя локализация, точная локализация опухоли и метастазирование.

Гиперпролиферативные клетки, как многие типы раковых клеток, зависят от повышенного притока питательных веществ, ростовых факторов, энергии и витаминов. В связи с этим существует возможность доставлять лекарственные средства в такие нежелательные клетки с использованием пути транспорта витаминов, которые являются незаменимыми для клеточного роста и в большинстве случаев запас которых ограничен.

Кобаламин (Cbl), известный также как витамин В12, присутствующий в виде цианокобаламина (CN-Cbl), гидроксикобаламина (OH-Cbl) или аквакобаламина (Н₂О-Cbl), является жизненно необходимым, а его концентрация в организме чрезвычайно мала. Высшие организмы, включая человека, вынуждены получать витамин из пищевых продуктов. Биосинтез кобаламина осуществляется только у некоторых прокариотов, таких как анаэробные бактерии. Кобаламин незаменим для нормальной функции нервной системы и необходим для нормального метаболизма углеводов, белков и жиров. Кобаламин утилизируется в нескольких жизненно важных внутриклеточных метаболических путях. В виде метилкобаламина (Ме-Cbl) он используется в качестве кофактора для метионинсинтазы. В виде 5'-дезоксиаденозилкобаламина (Ado-Cbl) он действует совместно с метилмалонил-СоА-мутазой при превращении метилмалонил-СоА в сукцинил-СоА. Недостаток кобаламина может привести к пернициозной анемии. Кобаламин включен также в процесс восстановительного превращения рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды при образовании ДНК.

В организме млекопитающих в большинстве случаев поглощение клетками кобаламина регулируется сывороточными транспортными белками и клеточными мембранными рецепторами. Существует два типа кобаламин-связывающих белков в плазме: негликозилированный белок транскобаламин II (ТСII) и гликозилированные белки транскобаламин I и III (TCI и TCIII), также называемые R-связывающими белками или гаптокорринами. TCI и TCIII характеризуются иммуноперекрестной реакцией и возможно отличаются только углеводным составом. TCI является первичным R-связывающим белком, найденным в кровотоке. Для простоты термин TCI используют для обозначения обоих типов R-связывающих белков TCI и TCIII. Оба типа транспортных белков (векторов) TCI и TCII циркулируют в кровотоке млекопитающих в виде частично насыщенных (голобелки) или частично ненасыщенных (апобелки) кобаламином. В клетках млекопитающих присутствует также безвекторная система поглощениеа кобаламина, которая в нормальных клетках характеризуется достаточной низкой эффективностью (см. статью Sennet С. и Rosenberg L.E., Ann. Rev. Biochem. 50, 1053-86 (1981)).

Функция TCII заключается в доставке плазматического кобаламина во все метаболически активные клетки по механизму опосредованного рецептором эндоцитоза. Известно, что ускоренная клеточная пролиферация при возникновении и развитии опухоли (неоплазия) напрямую вызывает повышенное потребление связанного с кобаламином TCII из кровотока по опосредованному рецептором механизму эндоцитозного поглощения. Во многих работах установлено, что повышенная регуляция ряда рецепторов TCII наблюдается в линиях злокачественных клеток для удовлетворения возрастающей метаболической потребности в продуцировании тимидина и метионина, в реакциях метилирования при синтезе ДНК и снабжения энергией клеток по механизму митохондриального метаболизма.

Основной рецептор TCII присутствует во всех типах тканей, в то время как второй рецептор TCII с более выраженной специфичностью к органам, так называемый мегалин, в основном экспрессируется в проксимальных канальцах почек и в некоторых других видах абсорбционного эпителия. После эндоцитозной интернализации TCII разлагается в лизосомах и свободный кобаламин транспортируется в цитоплазму и в ядерную мембрану, где он превращается в Me-Cbl и Ado-Cbl. Эти две формы проявляют функцию активных коферментов витамина В12. О важной роли TCII свидетельствует тот факт, что наследственный врожденный дефицит TCII вызывает мегалобластную анемию, тяжелые неврологические нарушения и летальный исход, если не проводить лечение избытком кобаламина.

Практически все клетки способны продуцировать TCII. Множество клеток, таких как гепатоциты, фибробласты, нервные клетки, энтероциты и макрофаги, синтезируют повышенные количества TCII. Предполагается, что первичным источником TCII является эндотелий кровеносных сосудов. Приблизительно 20-30% циркулирующего кобаламина связано с TCII в форме голо-TCII, который является метаболически эффективной формой, обеспечивающей интернализацию кобаламина во всех тканях (см. статью Rothenberg E. и др., в книге: Chemistry and Biochemistry of В12, ред. R.Banerjee, New York, NY, cc.441-473 (1999)).

TCI присутствует в крови и плазме, а также в большинстве внешнесекреторных выделений и других типов жидкостей. Этот белок в основном продуцируется в тканях передней кишки, слизистой оболочке желудка, слюнной и слезной железах и в секреторном эпителии внутреннего уха. TCI, в отличии от TCII, не поставляет связанный с ним кобаламин непосредственно для поглощения клетками, характеризуется продолжительным периодом полураспада в крови и таким образом в любой данный момент удерживает более 75% циркулирующего кобаламина (и коррина). Практически весь TCI циркулирует в форме голо-TCI. Его роль еще недостаточно изучена. Предполагается, что он функционирует в качестве бактериостатического агента, который предотвращает доставку всех типов кобаламинов и корринов в микроорганизмы. Этот белок стабилизирует также аденозилкобаламин и защищает его от фотолиза. В отличии от TCI, концентрация которого при циркуляции выше по сравнению с TCII, уровень TCII может быстро возрастать за счет синтеза de novo апо-TCII в ответ на поступающий кобаламин. TCI накапливается достаточно медленно и в значительной степени не стимулируется в ответ на любой инициирующий импульс (см. в указанной выше книге Alpers D. и Russell G., Chemistry and Biochemistry of B12, cc.411-441).

До настоящего времени безвекторная доставка кобаламина в клетки млекопитающих не рассматривалась как альтернативный путь поглощения производных кобаламина гиперпролиферативными клетками. Не вызывает сомнения тот факт, что физиологически важные механизмы поглощения кобаламина доброкачественными клетками млеокпитающих включают векторы TCII и TCI (а также собственный фактор в пищеварительном тракте). Однако по данным исследований in vivo и in vitro установлено, что свободный кобаламин также способен проникать через плазматическую мембрану без участия векторных белков. Прямое доказательство дополнительной способности поглощения свободного кобаламина получено при исследовании детей с врожденным и полным дефицитом TCII, у которых при парентеральном введении свободного кобаламина наблюдалась заметная ремиссия клинических и химических признаков внутриклеточного дефицита кобаламина (см. статью Hall С.Е. и др., Blood, 53, 251-263 (1979)). При исследовании in vitro наблюдалось поглощение свободного кобаламина клетками HeLa и фибробластами. В клетках HeLa поглощение свободного кобаламина составляет от 1% до 2% от поглощения связанного с TCII кобаламина. В фибробластах человека накопление свободного кобаламина с интервалом в 2 ч составляет приблизительно 20% от связанного с TCII витамина. Система поглощения свободного витамина фибробластами человека достаточно подробно изучена, как описано в статье Berliner N. и Rosenberg L.E., Metabolism, 30, 230-236 (1981)). Поглощение свободного CN-[⁵⁷Co]-Cbl исследовали в двухстадийной системе: начальное поглощение происходит с высокой скоростью по механизму насыщения и специфически ингибируется избытком немеченых CN-Cbl и OH-Cbl, процесс поглощения завершается через 30 мин. Вторая стадия поглощения происходит с более низкой скоростью в линейной зависимости от времени, не ингибируется избытком немеченного кобаламина и не выходит на плато даже через 8 ч, что свидетельствует о характерном неспецифическом процессе. Первая стадия поглощения является высокоспецифичным процессом проникновения через мембрану, который опосредуется белком и чувствителен к сульфгидрильным реагентам, кроме того этот процесс значительно ингибируется циклогексимидом (см. статью Sennet С.и Rosenberg L.E., Ann. Rev. Biochem. 50, 1053-86 (1981)). Эти свойства согласуются с присутствием опосредованной белком системы быстрого поглощения свободного кобаламина у млекопитающих.

Установлено, что многие бактерии и все эукариотные протисты являются ауксотрофными к витамину В12 и связывают его с более высокой аффинностью по сравнению с собственным фактором млекопитающих, TCI и TCII. Связывающие В12 белки из бактерий и простейших являются белками, взаимодействующими по безвекторному механизму с клеточной поверхностью и способными связывать множество корринов (включая сам кобаламин) с высокой аффинностью. Следовательно, существует возможность детектирования бактериальных инфекций при визуализации всего организма после введения радиоактивно меченного производного кобаламина (см. статью Collins D.A. и др., Mayo Clin. Proc. 75, 568-580 (2000)). Развитие гиперпролиферативных форм клеток млекопитающих может привести к развитию в ходе многостадийного канцерогенеза более эффективных форм уже существующих безвекторных систем поглощения кобаламина.

В настоящее время опубликованы и запатентованы подходы к применению кобаламина в качестве носителя для широкого спектра биологически активных агентов, включая радиоактивные изотопы металлов (см. патент Collins D.A., US Pat. Appl. No.2003/0144198). При испытании на животных и пациентах с использованием радиоактивно меченных производных кобаламина наблюдалось включение метки в опухолевые ткани, но при этом отмечено также значительное накопление радиоактивности в здоровых тканях, таких как почки и печень. Следовательно, визуализация и радиотерапия пока еще не являются оптимальными. В настоящий момент применение таких опубликованных методов ограничено возможным повреждением некоторых здоровых отделов организма.

Таким образом, существует необходимость в соединениях, композициях и способах для введения диагностических и терапевтических производных кобаламина в быстро пролифелирующие клетки в более высокой концентрации по сравнению с нормальными клетками. Объектом настоящего изобретения является разработка новых способов идентификации, синтеза, характеристики и введения производных кобаламина с высокой специфичностью в отношении клеток, характеризующихся аномально высокой пролиферацией, и при этом исключить развитие поколения устойчивых клеток.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение основано на том факте, что в отличие от самого кобаламина производные кобаламина, которые не связываются или связываются в значительно меньшей степени с транспортным белком, транскобаламином II (TCII), при соответствующем способе введения накапливаются в значительно меньшей степени в крови и доброкачественных органах, таких как почки и печень, по сравнению со скоростью накопления в неопластических тканях и, кроме того, быстро удаляются из крови. При использовании производных кобаламина, действующих в качестве заменителей витамина В12, значительно снижается риск формирования поколения устойчивых неопластических тканей.

Изобретение относится к производным кобаламина,

(а) не обладающим связывающей аффинностью или обладающим низкой связывающей аффинностью в отношении транскобаламина II и

(б) сохраняющим активность заменителя витамина В12.

Прежде всего, изобретение относится к производным кобаламина,

(а) обладающим менее 20%, предпочтительно менее 5%, связывающей аффинности в отношении транскобаламина II по сравнению со связывающей активностью немодифицированного кобаламина, которую определяют методом анализа связывания, и

(б) сохраняющим более 2% активности заменителя витамина В12, которую определяют методом анализа роста клеток.

Примеры соединений по настоящему изобретению, обладающих низкой связывающей активностью в отношении TCII или не обладающие такой активностью, включают специфические производные кобаламина, содержащие терапевтический и/или диагностический агент, такой как радиоактивный металл. Соединения по настоящему изобретению выбирают по результатам определения связывающей активности с использованием очищенного TCII и анализа роста клеток с использованием в качестве исследуемого организма бактерий Lactobacillus delbrueckii.

Настоящее изобретение относится также к способу диагностики неопластического заболевания или инфекции микроорганизма у млекопитающих, включающему

(а) соблюдение диеты, не содержащей витамин В12, для млекопитающего, который подвержен неопластическому заболеванию или инфекции, и

(б) последующее введение производного кобаламина по изобретению, содержащего диагностический агент.

Аналогичным образом настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего, страдающего от неопластического заболевания или от инфекции микроорганизма, включающему

(а) соблюдение диеты, не содержащей витамин В12, для млекопитающего, нуждающегося в лечении, и

(б) последующее введение производного кобаламина по изобретению, содержащего терапевтический агент.

Настоящее изобретение относится также к применению производного кобаламина в способе диагностики неопластического заболевания или инфекции микроорганизма или при лечении млекопитающего, страдающего от неопластического заболевания или инфекции микроорганизма.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим производные кобаламина по настоящему изобретению, прежде всего к композициям, пригодным для диагностики, и к фармацевтическим композициям, пригодным для лечения, а также к применению таких фармацевтических композиций в способе диагностики и в способе лечения соответственно.

Настоящее изобретение относится также к промежуточным соединениям, которые используются для получения соединений, пригодных для диагностики или лечения по настоящему изобретению, прежде всего к соединениям, содержащим хелатные заместители для связывания радиоактивных металлов, но не содержащим связанный с хелатным заместителем металл или нерадиоактивный металл.

Производные кобаламина по настоящему изобретению являются, прежде всего, ценными для диагностики и/или лечения агрессивных, быстро прогрессирующих неопластических заболеваний, таких как рак, и/или диагностики и/или лечения локальных инфекций патогенных микроорганизмов.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлены графики анализа взаимодействия радиоактивно меченного цианокобаламин-b-пропил-PAMA-OEt (пример 11), не связывающего TCII, с транспортными белками методом гель-фильтрации по сдвигу молекулярной массы (на оси ординат - время, на оси абсцисс - количество импульсов в мин (имп./мин)),

A) гель-фильтрация радиоактивно меченного производного на колонке Superdex 75 (пик соответствует молекулярной массе 1,5 кДа),

B) гель-фильтрация производного в смеси с TCI (сдвиг молекулярной массы от 1,5 кДа до 44 кДа),

C) гель-фильтрация производного в смеси с TCII (пик соответствует молекулярной массе 1,5 кДа, то есть цианокобаламин-b-пропил-PAMA-OEt практически не связывается с TCII).

На фиг.2 представлены графики анализа взаимодействия радиоактивно меченного цианокобаламин-b-бутил-PAPAcet (пример 5), связывающего TCII, с транспортными белками методом гель-фильтрации по сдвигу молекулярной массы (на оси ординат - время, на оси абсцисс - количество импульсов в мин (имп./мин)),

A) гель-фильтрация радиоактивно меченного производного на колонке Superdex 75 (пик соответствует молекулярной массе 1,5 кДа),

B) гель-фильтрация производного в смеси с TCI (сдвиг молекулярной массы от 1,5 кДа до 44 кДа),

C) гель-фильтрация производного в смеси с TCII (сдвиг молекулярной массы от 1,5 кДа до 60 кДа, то есть цианокобаламин-b-бутил-PAPAcet связывается с TCII).

На фиг.3, 4, 5 и 6 представлены диаграммы распределения в тканях,

на оси ординат - процент введенной радиоактивности на грамм ткани,

на оси абсцисс - органы: 1) кровь, 2) сердце, 3) селезенка, 4) почки, 5) желудок, 6) кишечник, 7) печень, 8) мышцы, 9) кость, 10) опухоль.

На фиг.3 представлена диаграмма распределения после внутривенной инъекции радиоактивного цианокобаламина (⁵⁷Co-CN-Cbl) в тканях мышей, получавших нормальный корм.

На фиг.4 представлена диаграмма распределения после внутривенной инъекции радиоактивного цианокобаламина (⁵⁷Co-CN-Cbl) в тканях мышей, получавших корм без витамина В12.

На фиг.5 представлена диаграмма распределения после внутривенной инъекции радиоактивного цианокобаламин-β-пропил-PAMA-OEt (пример 11) в тканях мышей, получавших нормальный корм.

На фиг.6 представлена диаграмма распределения после внутривенной инъекции радиоактивного цианокобаламин-β-пропил-PAMA-OEt (пример 11) в тканях мышей, получавших корм без витамина В12.

Подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения

При введении млекопитающим, соблюдавшим не содержащую витамин В12 диету, производных кобаламина, проявляющих чрезвычайно низкую связывающую аффинность в отношении кобаламин-векторного белка (или транспортного белка) или не обладающих такой активностью, наблюдается значительное снижение накопления в крови и в важных органах, таких как почки и печень, и при этом поддерживается высокий уровень поглощения в гиперпролиферативных клетках, что позволяет использовать такие производные для более точной диагностики и лечения неопластических заболеваний и локальных инфекций микроорганизмов.

К соединениям по настоящему изобретению, проявляющим низкую связывающую аффинность в отношении TCII и сохраняющим активность витамина В12, относятся, например, соединения формулы (I)

где R^b, R^c, R^d и R^e независимо друг от друга означают спейсерную хелатную группу, антибиотик или антипролиферативный терапевтический агент, органическую группу с определенной конфигурацией, содержащую от 4 до 20 атомов углерода, или водород,

R^R означает спейсерную хелатную группу, антибиотик или антипролиферативный терапевтический агент, каждый из которых связан через мостиковую группу Z, или водород,

при условии, что по крайней мере три остатка из R^b, R^c, R^d, R^e и R^R означают водород и по крайней мере один из R^b, R^c, R^d и R^e не означает водород,

Х означает монодентатный лиганд, а

центральный атом кобальта (Со) необязательно находится в форме радиоактивного изотопа.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения R^e означает водород.

Монодентатным лигандом Х является, например, циано,

галоген, такой как фтор, хлор, бром или иод, цианато, изоцианато, тиоцианато или изотиоцианато,

алкил с прямой или разветвленной цепью, содержащий от 1 до 25 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода, такой как метил, этил, н-пропил, н-бутил или изобутил или также н-гексил или н-децил, и необязательно замещенный группами: гидрокси, метокси или амино, например гидроксиметил, метоксиметил, аминометил, гидроксиэтил или метоксиэтил,

нитрил R-CN, изонитрил R-NC, карбоксилат R-COO^- или тиолят R-S^-, где R означает алкил с прямой или разветвленной цепью, включающий от 1 до 15 атомов углерода, предпочтительно от 1 до 6 атомов углерода, или арил, например фенил или нафтил, такой как ацетонитрил, пропионитрил, бензонитрил, метилизоцианат, фенилизоцианат, ацетат, пропионат, бензоат, метилтиолят, этилтиолят, н-гексилтиолят или тиофенолят,

фосфит (RO)₃Р, где заместители R являются одинаковыми или различными и означают алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, или арил, например необязательно замещенный фенил или нафтил, такой как триметилфосфит, метилдифенилфосфит, трифенилфосфит или три-орто-толилфосфит,

гидрокси или остаток аквокислоты, или

остаток 5'-дезоксиаденозина или родственного нуклеозида.

Х предпочтительно означает циано, метил, гидрокси, остаток аквокислоты или 5'-дезоксиаденозина, наиболее предпочтительно циано.

Спейсерная хелатная группа в качестве заместителей R^b, R^c, R^d, R^e или R^R означает хелатную группу для атомов металла, присоединенную к NH- или O-группе кобаламина через спейсерную группу, и необязательно содержит атом металла, прежде всего атом радиоактивного металла.

Соединения формулы (I), в которых спейсерная хелатная группа не содержит атом металла, используются в качестве промежуточных производных для получения соединений, предназначенных для применения в способах диагностики и/или лечения по настоящему изобретению.

Если в качестве заместителя R^b, R^c, R^d, R^e или R^R используют антибиотик или антипролиферативный терапевтический агент, то антибиотик выбирают из группы, включающей аминогликозидные антибиотики, такие как гентамицин, тетрациклины, антиметаболиты, такие как селенометионин, макролиды, такие как эритромицин и триметоприм, а антипролиферативный агент выбирают из группы, включающей антиметаболиты, такие как 5-фторурацил, алкилирующий агент, такой как оксалиплатин, дакарбазин, циклофосфамид или карбоплатин, ингибитор клеточного цикла, такой как винбластин или доцетаксел, деградирующий ДНК агент (ингибитор топоизомеразы, интеркалятор, расщепляющий цепи агент), такой как доксорубицин, блеомицин или топотекан, соединение, влияющее на путь передачи сигнала, такое как модификатор активности каспазы, агонист или антагонист рецепторов гибели клеток, и модификатор нуклеаз, фосфостаз и киназ, такой как мезилат иматиниба, дексаметазон, миристат-ацетат форбола, циклоспорин А, кверцетин или тамоксифен, причем указанные соединения присоединены к NH- или O-группе кобаламина ковалентной связью напрямую или через спейсер.

Спейсер означает алифатическую цепь, содержащую от 2 до 10 атомов углерода, предпочтительно от 2 до 6 атомов углерода, например от 2 до 5 атомов углерода, причем один или два атома углерода заменены на атомы азота и/или кислорода, а алифатическая цепь замещена группами гидрокси, оксо или амино. Прежде всего, два соседних атома углерода заменены на амидогруппу -NH-CO- или сложноэфирную группу -O-СО-.

Примеры спейсеров, соединяющих NH- или O-группы кобаламина с хелатной группой, включают этилен, пропилен, бутилен или пентилен, или группы, в которых один атом углерода заменен на атом кислорода или азота, или один атом углерода заменен на атом кислорода или азота, или соседний атом углерода замещен на оксо.

Хелатное соединение содержит два, три или более донорных атомов, выбранных из азота, кислорода и серы, которые расположены на достаточном расстоянии для связывания с атомом металла. Прежде всего, хелатные соединения включают тридентатные хелатные соединения, содержащие три участка связывания с металлом, включающие донорные атомы азота, кислорода и/или серы, причем расстояние между ними является достаточным для связывания с атомами металла. Атомы азота в качестве донорных атомов входят в состав, например, алифатического амина, ароматического амина или азотсодержащего ароматического гетероцикла. Атомы кислорода в качестве донорных атомов входят в состав, например, спиртов, простых и сложных эфиров или карбоксильной группы. Атомы серы в качестве донорных атомов входят в состав, например, тиоэфиров или тиолов. Доноры присоединены, например, через алифатические углеводородные цепи или цепи, включающие амидные связи, и являются производными аминокислот, полиэфиров и т.п.

Предпочтительными хелатными соединениями являются хелатные соединения формул (II)-(IX). Карбоксильные группы могут присутствовать в виде сложных эфиров, которые отщепляются одновременно с образованием комплекса с атомом металла, при этом образуются координационные карбоксилатные группы. Такие этерифицированные хелатные соединения, то есть сложные эфиры, могут включать алкильные эфиры, в которых алкильная группа является прямой или разветвленной и включает от 1 до 25 атомов углерода, причем необязательно от одного до пяти атомов углерода заменены на атомы азота или кислорода, или один или два атома углерода заменены на атомы серы или фосфора, и указанные атомы необязательно замещены группами: фенил, пиридил, гидрокси, галоген, циано, оксо или амино. Сложный эфир включает также арильный или гетероарильный эфир, в котором арил или гетероарил включает от 3 до 10 атомов углерода или ноль, один или два атома кислорода, ноль, один, два или три атома азота или ноль или один атом серы. Такие сложноэфирные остатки также соответствующим образом замещены, чтобы обеспечить отщепление эфирных групп в определенных условиях реакции, например, как описано для сложноэфирных групп при их использовании в качестве защитных групп для карбоксильных групп, см. книгу Green T.W. и Wuts P.G.M., Protective groups in organic synthesis, Wiley (1999).

К этерифицированным хелатным соединениям предпочтительно относятся соединения в форме метилового, этилового или цианометилового эфиров.

В качестве радиоактивных металлов используют радиоактивные изотопы, такие как ^94mTc, ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu и ¹⁷⁷Lu, прежде всего ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, и ¹¹¹In.

К радиоактивным изотопам Со относятся, например, ⁵⁷Со и ⁶⁰Co.

К органическим группам с определенной конформацией, содержащим от 4 до 20 атомов углерода, относятся, например, алкил, циклоалкил, арил арилалкил, гетероарил или гетероарилалкил, необязательно замещенные группами: гидрокси, алкокси, оксо, амино, карбокси, карбамоил или алкоксикарбонил. Примеры арильных групп включают фенил, метилфенил, диметилфенил, гидроксифенил или нафтил. Примеры гетероарильных групп включают пиридил, пирролил, имидазолил или бензимидазолил. В алкильной цепи атомы углерода заменены на атомы азота или кислорода. Например, в алкильной цепи один атом углерода заменен на атом азота (или кислорода), а соседний атом углерода замещен оксогруппой с образованием карбоксамида (или сложноэфирной группы соответственно). Типичные примеры органических групп с определенной конформацией включают изобутил, трет-бутил, трет-пентил, орто-толил, орто-метилбензил или 2,6-диметилбензил.

Связующая группа Z, соединяющая R^R со спейсерной хелатной группой или с антибиотиком или антипролиферативным агентом, означает связь или связующую группу, которую выбирают из группы, включающей фосфаты, фосфонаты, сложные эфиры карбоновых кислот или алкилены, содержащие от 1 до 10 атомов углерода или их комбинации. Такие связующие группы соединяют спейсерную хелатную группу или терапевтический агент, необязательно содержащий спейсерную группу, как определено выше, с атомом кислорода в составе кобаламина.

Соединения, которые модифицированы по группе R^R, но в которых R^b, R^c, R^d и R^e все означают водород, и которые связываются с транспортными белками ТС и в то же время проявляют ферментативную активность, исключены из области настоящего изобретения.

Выбор соединения по настоящему изобретению основан на следующих критериях:

(а) отсутствие связывающей аффинности или значительно сниженная связывающая аффинность в отношении TCII, например менее 20%, прежде всего менее 10%, предпочтительно менее 5%, более предпочтительно менее 2%, по сравнению с немодифицированным кобаламином, и

(б) активность в качестве заменителя витамина В12, определенная с использованием роста бактерий или клеточных линий млекопитающих, зависимых от витамина В12, составляет, например, более 2% активности, прежде всего более 10%, предпочтительно более 20% активности по сравнению с активностью витамина В12, которую проявляет немодифицированный кобаламин.

Для определения связывающей аффинности производных кобаламина (Cbl) с TCII анализ in vitro проводят с использованием частично очищенного TCII, выделенного из крови кролика. В качестве субстрата можно также использовать рекомбинантный TCII, который продуцируется в экспрессионной системе Е.coli.

Производные кобаламина по настоящему изобретению должны проявлять активность в качестве заменителей витамина В12. В связи с этим значительно снижается риск развития устойчивости, которая приводит к образованию клеток с высоким уровнем пролиферации. По всей вероятности мутантные клетки, в которых уже не происходит поглощения производных кобаламина с низкой связывающей активностью в отношении TCII или не обладающих такой активностью, теряют способность своих клеток-предшественников поддерживать высокий уровень пролиферации по механизму высокоэффективного поглощения витамина В12, независимого от TCII.

Для определения активности производных кобаламина в отношении витамина В12 использовали анализ в присутствии штамма Lactobacillus delbrueckii, который рекомендован во всем мире в качестве стандартного штамма для идентификации цианокобаламина (CN-Cbl). Добавление цианокобаламина в среду, не содержащую цианокобаламин, в ответ вызывает рост цианокобаламин-ауксотропного бактериального штамма, который можно определять методом количественного твердофазного метода диффузии на пластине. Этот метод анализа использовали для определения способности производного кобаламина (в %) замещать цианокобаламин в качестве жизненно необходимого катализатора.

Настоящее изобретение относится также к способу диагностики и к способу лечения неопластических заболеваний и локальных инфекций микроорганизмов у млекопитающих, включающий

(а) соблюдение диеты млекопитающим, не содержащей витамин В12,

(б) последующее ведение производного кобаламина по настоящему изобретению, содержащего диагностический или терапевтический агент,

и к применению производных кобаламина по изобретению в указанном способе.

Положительное влияние введения не связывающих TCII производных кобаламина на их биораспределение в организме млекопитающих после соблюдения диеты, не содержащей витамин, описано в таблице 1.

Таблица 1
Распределение в тканях у мышей через 24 ч после внутривенного введения радиоактивно меченных производных
Пример	5	6	8	10	11	12	14	18	20	22	25
Взаим. с TCII	+	+	+	-	-	-	+	-	+	-	+
Кровь	2,30	2,40	2,20	0,10	0,09	0,04	1,20	0,06	2,10	0,25	0,18
Почки	14,10	15,80	16,50	1,36	0,39	1,08	40,00	10,40	19,90	3,54	116,00
Печень	9,40	7,40	8,10	1,45	0,44	0,94	8,00	3,90	21,06	3,90	20,70
Опухоль	7,90	7,30	3,60	0,73	1,61	6,13	3,00	6,80	9,20	2,90	3,16

Пример 5: цианокобаламин-b-бутил-PAPAcet,

пример 6: цианокобаламин-b-бутиламинокарбоксиметил-His-OMe,

пример 8: цианокобаламин-с-бутил-PAPAcet,

пример 10: цианокобаламин-b-этил-PAMA-OEt,

пример 11: цианокобаламин-b-пропил-PAMA-OEt,

пример 12: цианокобаламин-b-бутил-PAMA-OEt,

пример 14: цианокобаламин-b-гексил-PAMA-OEt,

пример 18: цианокобаламин-d-пропил-РАМА-OEt,

пример 20: цианокобаламин-b-пропил-His-OMe,

пример 22: цианокобаламин-b-этилтриамин,

пример 25: цианокобаламин-5'-фосфоколамин-His-ОМе.

Результаты анализа биораспределения, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что не сязывающиеся с TCII соединения, например соединения по настоящему изобретению, описанные в примерах 10, 11, 12, 18 и 22, в значительной степени накапливаются в опухоли, в 5 раз или более по сравнению с кровью и по крайней мере больше, чем на половину количества, определенного в жизненно важных органах, почках и печени. Соединения, полученные в примерах 5, 6, 8, 14, 20 и 25, не относятся к соединениям по изобретению, так как они связываются с TCII и описаны только для сравнения.

Производные кобаламина по настоящему изобретению, прежде всего, являются ценными для диагностики и/или лечения агрессивных, быстро прогрессирующих опухолевых заболеваний, таких как рак. Соединения по изобретению можно использовать для обработки клеток с высокой степенью пролиферации в организме человека, включенных в процесс развития злокачественной опухоли, такой как, например, меланома, фибросаркома, карцинома яичников, карцинома поджелудочной железы, остеокарцинома и острый лейкоз, так как эти соединения не чувствительны к опосредованному TCII эндоцитозу. Способ по изобретению позволяет селективным образом защитить доброкачественные органы от опосредованного TCII разрушительного поглощения производных кобаламина, содержащих радиоактивный изотоп и/или нерадиоактивный агент, разрушающий клетки.

Соединения по настоящему изобретению можно использовать не только для получения визуализации опухолей и лечения рака, но и для визуализации и возможного лечения локальных инфекций микроорганизмов, зависящих от прямого поглощения кобаламинов в высокой степени.

Соединения по настоящему изобретению, содержащие антипролиферативный агент, можно использовать для транспорта агента в неактивной форме в гиперпролиферативные клетки, где он проявляет свое действие после внутриклеточного амидолиза.

Способ лечения опухолевого и/или инфекционного заболевания заключается в введении соединения по изобретению, содержащего пригодный терапевтический агент, в отдельности или в комбинации с одним или более других терапевтических агентов, причем предполагаемое комбинационное лечение проводят с использованием фиксированных комбинаций или соединение по изобретению и один или более других терапевтических агентов вводят поочередно или вводят независимо друг от друга или совместно вводят фиксированную комбинацию и один или более других терапевтических агентов. Соединение по изобретению можно вводить, кроме того или дополнительно, специально для лечения опухоли в комбинации с химиотерапией, иммунотерапией, хирургическим вмешательством или использовать комбинацию указанных способов лечения. В равной степени возможна долгосрочная терапия наряду с адьювантной терапией совместно с другими стратегиями лечения.

Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим производные кобаламина по изобретению, прежде всего к фармацевтическим композициям, пригодным для диагностики, и к фармацевтическим композициям, предназначенным для лечения.

Предпочтительны фармацевтические композиции для парентерального введения, такого как внутривенное, внутримышечное или подкожное введение. Композиции включают активный ингредиент в отдельности или в смеси с терапевтически примемлемым носителем. Доза активного ингредиента зависит от заболевания, которое требуется вылечить, и от субъекта, его возраста, массы тела и индивидуального состояния, от конкретных фармакокинетических данных и от способа введения.

Способы получения

Соединения по изобретению получают стандартными методами, известными в данной области химии.

Предпочтительно цианокобаламин, то есть соединение формулы (I), где R^b, R^c, R^d, R^e и R