Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота

Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота

Реферат

Изобретение относится к области вирусологии, биотехнологии и ветеринарии и касается создания новых вакцин, которые могут быть использованы для предупреждения инфекционных болезней крупного рогатого скота (КРС), сопровождающихся нарушением функций репродуктивной системы различной степени тяжести.

Инфекционные болезни, вызывающие аборты, рождение нежизнеспособного потомства, прохолосты и другие патологии репродуктивной системы, являются серьезной проблемой молочного и мясного скотоводства.

Как правило, эти заболевания вызываются несколькими возбудителями, относящимися к разным таксономическим категориям. Ведущая роль в патологии воспроизводства принадлежит бактериям Leptospira interrogans серогрупп Pomona, Grippotyphosa, Tarassovi, Sejroe. Они встречаются на всей территории России и в большинстве стран мира. На неблагополучных фермах от 27 до 92% исследованных животных имеют специфические антитела к лептоспирам (Ю.А.Малахов, А.Н.Панин, Г.Л.Соболева, 2001). Аборты, вызываемые лептоспирами, могут происходить в разное время после заражения и на любой стадии стельности. Иногда аборты бывают единственным клиническим признаком инфекции (Ellis, 1985, Thiermann, 1985).

Кроме лептоспир в развитии инфекционных абортов определенное этиологическое значение также принадлежит вирусам инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи (ВД), рота- (РВ) и коронавирусам (KB). Заболевания, обусловленные смешанной инфекцией, клинически протекают тяжелее, длительнее и наряду с нарушением репродуктивной функции характеризуются поражением респираторного и желудочно-кишечного трактов.

Для профилактики инфекционного аборта крупного рогатого скота широкое применение получила поливалентная вакцина ВГНКИ против лептоспироза животных, изготавливаемая в двух вариантах и содержащая инактивированную формалином суспензию клеток штаммов Leptospira interrogans серогрупп: Pomona PSR-1, Tarassovi ВГНКИ-4, Icterohaemorrhagiae ВГНКИ-2, Canicola ВГНКИ-3 (1-й вариант) или Pomona PSR-1, Tarassovi ВГНКИ-4, Grippotyphosa ВГНКИ-1, Sejroe "Hardjo" (2-й вариант), с общей концентрацией в каждом варианте 0,5-5,0 млрд микробных клеток в 1 см³, адъювант - гидрат окиси алюминия, и стабилизатор (Патент RU №2030915, А61К 39/02, опубл. 20.03.1995).

Недостатком поливалентной вакцины ВГНКИ является то, что она не обеспечивает иммунологическую защиту животных от инфекционных абортов вирусной этиологии ввиду отсутствия в вакцине антигенов вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи.

Известна ассоциированная вакцина против лептоспироза и кампилобактериоза крупного рогатого скота, предназначенная для профилактики болезней, вызывающих нарушения функции воспроизводства. Вакцина содержит антигены лептоспир серологических групп Pomona, Tarassovi, Grippotyphosa, Sejroe и антигены кампилобактерий из штаммов ВГНКИ N 43/3 и ВГНКИ N 169/17, инактиватор и адъювант (Патент RU №2021818, А61К 39/116, опубл. 30.10.1994).

Недостатком известной ассоциированной вакцины является ограниченность спектра действия, так как она направлена против узкой группы возбудителей заболеваний и не обеспечивает иммунологическую защиту животных от инфекционных абортов вирусной этиологии.

Известна также вакцинная композиция против инфекционных болезней КРС, сопровождающихся поражением репродуктивных органов и респираторного тракта, содержащая аттенуированный вирус бычьего герпеса (инфекционного ринотрахеита) и, по меньшей мере, один антиген, выбранный из группы, состоящей из: вируса вирусной диареи; аттенуированного вируса парагриппа-3; аттенуированного респираторно-синцитиального вируса; бактерий Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira Bratislava и Campylobacter fetus и адъювант (Международная заявка WO 2004093904, А61К 39/245, опубл. 04.11.2004).

Однако данная вакцинная композиция характеризуется низкой противоэпизоотической эффективностью, обусловленной тем, что используемые для ее изготовления штаммы обладают антигенными и иммунобиологическими отличиями по сравнению с аналогичными характеристиками эпизоотических возбудителей, циркулирующих на территории России и стран СНГ.

Кроме того, применение живых вакцин, содержащих неинактивированные антигены вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи, категорически противопоказано для стельных коров и новорожденных телят из-за возможности гомологичной рекомбинации вакцинного и полевого штаммов вируса, ведущей к обострению инфекций, абортам и даже гибели отдельных животных.

Наиболее близким аналогом является вакцина против инфекционных болезней, вызывающих аборты у КРС, содержащая аттенуированный вирус бычьего герпеса (инфекционного ринотрахеита), аттенуированный вирус парагриппа-3, аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус, вирус вирусной диареи; и, по меньшей мере, один антиген, выбранный из группы, состоящей из Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira borgpetersenii hardio-prajitno, Leptospira icterohaemorrhagiae, и Leptospira interrogans pomona, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira Bratislava и Campylobacter fetus, инактиватор, адъювант и фармацевтически приемлемый носитель (Международная заявка WO 2004017990, А61К 39/02, опубл. 04.03.2004).

Однако данная вакцина не содержит антигенов против возбудителей, циркулирующих на территории России и стран СНГ, и вследствие этого характеризуется низкой противоэпизоотической эффективностью.

Задачей изобретения является разработка безопасной комбинированной (поливалентной) вакцины, содержащей сбалансированные в антигенном и иммуногенном отношении вирусные и бактериальные антигены, которая позволит создать напряженный иммунитет против наиболее значимых возбудителей болезней, сопровождающихся поражением репродуктивной системы, и обеспечить, таким образом, сохранность молодняка и продуктивность взрослых животных.

Еще одной задачей является получение новых производственных штаммов вирусов ИРТ и ВД, обладающих широким антигенным спектром, высокой антигенной и иммуногенной активностью не только в нативном виде, но и после инактивации, стабильно сохраняющих свои свойства, и пригодных для создания инактивированных комбинированных вакцин различной валентности.

Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала комбинированных вакцин против инфекционных болезней, сопровождающихся поражением репродуктивной системы, а также в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности комбинированной вакцины и создании напряженного и длительного иммунитета у привитых животных и родившихся телят против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота.

Технический результат изобретения достигается за счет использования в составе вакцины новых производственных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи КРС с широким антигенным спектром, а также за счет создания синергетической композиции поливалентной вакцины при объединении новых производственных штаммов вирусов с известными вакцинными штаммами лептоспир.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Предлагаемая инактивированная комбинированная вакцина против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличается тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь инактивированной суспензии штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ГКВ №2333, семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesviridae, инактивированной суспензии штамма вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, инактивированной суспензии клеток бактерий Leptospira interrogans серогруппы Pomona штамма ВГНКИ-6, инактивированной суспензии клеток бактерий Leptospira interrogans серогруппы Tarassovi штамма ВГНКИ-4, инактивированной суспензии клеток бактерий Leptospira interrogans серогруппы Grippotyphosa штамма ВГНКИ-1, инактивированной суспензии клеток бактерий Leptospira interrogans серогруппы Sejroe штамма "Hardjo" и инактивированной суспензии клеток бактерий Leptospira interrogans серогруппы Sejroe штамма ВГНКИ-5, в эффективном количестве.

Термин «эффективное количество» означает количество активного вещества, которое при введении коровам и/или телятам обеспечивает индукцию специфического иммунного ответа достаточного уровня в организме животных с последующим предупреждением от заболевания и симптомов заболевания, подлежащих профилактике.

Входящие в состав комбинированной вакцины штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ГКВ №2333, семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesviridae, и штамм вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus, являются новыми производственными штаммами и впервые используются в составе вакцинных препаратов.

Термин «производственный штамм» означает вакцинный штамм, изученный по своим биологическим свойствам, стабильный при хранении и пересевах, безвредный после инактивирования или аттенуирования для животного, хорошо адаптированный к системе культивирования, обладающий высокой антигенной и иммуногенной активностью, как для чувствительной лабораторной модели, так и для естественно восприимчивых животных, а также характеризующийся широким антигенным спектром, доминирующим над эпизоотическими штаммами возбудителя.

Производственный штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ГКВ №2333 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2333 и характеризуется следующими признаками и свойствами.

Источник происхождения:

Источником получения нового производственного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота является вирусный штамм В-25 (авторское название), выделенный в 1991 г. из носового смыва теленка с респираторным синдромом, который прошел 35 последовательных пассажей в перевиваемых культурах клеток КРС.

Морфологические свойства:

Штамм ГКВ №2333 относится к семейству Herpcsviridae, подсемейство Alphaherpesviridae. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса инфекционного ринотрахеита КРС, размером 150-200 нм и состоящие из капсида кубической симметрии и покрывающей его внешней оболочки. Капсид имеет 162 призматических полых капсомера. Нуклеокапсид формируется внутри ядра, где образуются включения типа А.

Антигенные свойства:

Штамм ГКВ №2333 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2333 вируса ИРТ ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса ИРТ (табл.1).

Табл.1
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2333 вируса ИРТ
Штамм/изолят вируса ИРТ для РН	Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2333 вируса ИРТ*, М±m
ГКВ №2333	142,1±24,2
В-25	84,4±13,8
Изолят №1702	76,1±23,9
Изолят №2105	87,3±12,5
Изолят №1320	111,4±26,5
*здесь и далее в таблицах приведены обратные значения титра антител

Биотехнологические характеристики:

Штамм ГКВ №2333 хорошо размножается в первичных и перевиваемых культурах клеток (почки, тестикулы), полученных из тканей и органов крупного рогатого скота. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 10^7,5-10^8,5 ТЦД₅₀/см³.

Рекомендуемый способ хранения:

В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.

Периодичность освежения:

Один раз в три года в перевиваемой культуре клеток почки теленка МДВК (далее - культура клеток МДВК).

Дополнительные сведения о штамме:

Штамм ГКВ №2333 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB).

Реактогенность - штамм ГКВ №2333 реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Производственный штамм вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2336 и характеризуется следующими признаками и свойствами.

Источник происхождения:

Источником получения нового производственного штамма вируса диареи ГКВ №2336 является вирусный штамм СТ-89 (авторское название), выделенный в 1989 г. из содержимого кишечника телят с признаками диареи в культуре клеток почки новорожденного теленка, который прошел 82 последовательных пассажа в перевиваемой культуре клеток МДВК.

Морфологические свойства:

Штамм ГКВ №2336 относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса диареи КРС, размером 40-60 нм и состоящие из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии и наружной липопротеидной оболочки.

Антигенные свойства:

Штамм ГКВ №2336 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2336 вируса диареи КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса ВД (табл.2).

Табл.2
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2336 вируса ИРТ
Штамм/изолят вируса ВД для РН	Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2336 вируса ВД, М±m
ГКВ №2336	374,8±31,6
СТ-89	107,6±24,5
Изолят №865	168,9±21,3
Изолят №1204	337,7±26,8
Изолят №663	174,8±22,4

Имеет тесное антигенное родство с вирусами классической чумы свиней и пограничной болезни овец.

Биотехнологические характеристики:

Штамм ГКВ №2336 хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и в культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 10^7,5-10^8,5 ТЦД₅₀/см³.

Рекомендуемый способ хранения:

В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.

Периодичность освежения:

Один раз в три года в культуре клеток МДВК.

Дополнительные сведения о штамме:

Штамм ГКВ №2336 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB) и в тест-системе ПЦР.

Реактогенность - штамм ГКВ №2336 реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

В составе комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота инактивированные вирусные суспензии штаммов ГКВ №2333 и ГКВ №2336 содержатся с титром инфекционной активности каждого вируса не менее 10^7,5 ТЦД₅₀ в 1 см³ вакцины.

Инактивацию вирусных суспензий осуществляют любым известным способом, например путем добавления формалина или димера этиленимина (ДЭИ).

В составе предлагаемой вакцины вирусные суспензии штаммов могут быть использованы в любых сочетаниях по объему, например, вирусные суспензии содержатся в соотношении 1:1 по объему при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2333 и ГКВ №2336 - 10^8,0-8,5 ТЦД₅₀/см³. В других вариантах получения вакцины вирусные суспензии содержатся в соотношении 1:2, если инфекционная активность штамма ГКВ №2333 составляет 10^8,5-9,0 ТЦД₅₀/см³, а штамма ГКВ №2336 - 10^7,5-8,0 ТЦД₅₀/см³; или в соотношении по объему 2:1, если инфекционная активность штамма ГКВ №2333 составляет 10^7,5-8,0 ТЦД₅₀/см³, а штамма ГКВ №2336 - 10^8,0-8,5 ТЦД₅₀/см³. При этом следует отметить, что увеличение или уменьшение объема одного из компонентов не оказывает значительного влияния на антигенную активность готовой вакцины.

Используемые для изготовления лептоспирозного компонента комбинированной вакцины штаммы Leptospira interrogans известны и используются при изготовлении поливалентной вакцины ВГНКИ против лептоспироза животных. Однако авторами было установлено, что при объединении известных штаммов лептоспир с новыми производственными штаммами вирусов в предлагаемой по изобретению комбинации наблюдается образование синергетической композиции, проявляемой в увеличении напряженности и длительности иммунитета к вирусному и лептоспирозному компонентам вакцины.

В составе предлагаемой вакцины инактивированные суспензии клеток бактерий Leptospira interrogans серогруппы Pomona (штамм ВГНКИ-6), серогруппы Tarassovi (штамм ВГНКИ-4), серогруппы Grippotyphosa (штамм ВГНКИ-1) и серогруппы Sejroe (штаммы "Hardjo" и ВГНКИ-5), содержатся в равных соотношениях с конечной концентрацией не менее 270 млн микробных клеток в 1 см³ вакцины.

Инактивацию суспензий клеток лептоспир осуществляют любым известным способом, например путем добавления формалина, содержащего не менее 37% формальдегида.

Согласно изобретения комбинированная вакцина также содержит одну или более приемлемую в ветеринарии целевую добавку.

Термин "целевая добавка" означает любые приемлемые в ветеринарии фармацевтические компоненты, которые традиционно используются для обеспечения сохранности антигенов в процессе технологической переработки, приготовления конечной рецептурной формы или последующего хранения и тому подобное.

В качестве целевой добавки комбинированная вакцина может содержать растворитель, адъювант, солюбилизирующий агент, разбавитель, консервант, стабилизатор, антибактериальное и противогрибковое средства, изотонический агент, агент, задерживающий всасывание, и тому подобное. Разбавители могут включать дистиллированную воду, физиологический раствор, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать, наряду с другими, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают альбумин, сахарозу, желатозу, обезжиренное молоко и т.д.

Адъюванты включают вещества, неспецифически усиливающие иммунный ответ к антигенам, и могут быть минерального происхождения - гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, алюминиево-калиевые квасцы; растительного происхождения - сапонин (Квил-А); адъюванты на основе минеральных и неминеральных масел; синтетический адъювант - мурамилдипептид и др.

В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина преимущественно содержит адъювант, например, гидрат окиси алюминия или смесь гидрата окиси алюминия с сапонином.

При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать консервант мертиолят натрия в количестве 1:10000.

Хотя специалист в данной области может легко определить количество и концентрацию адъювантов и добавок, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к композициям, включающим предпочтительно от 20 до 30 об.% адъюванта.

В предпочтительном варианте вакцина содержит 6%-ный гель гидрата окиси алюминия в количестве 20 об.% и сапонин в количестве 0,05 об.%, что соответствует 12 г гидрата окиси алюминия и 500 мг сапонина в 1 л вакцины.

Нижеследующие примеры рецептур являются чисто иллюстративными и не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота представляет собой жидкость светло-красного цвета, при хранении образуется рыхлый сероватый осадок, легко разбивающийся в гомогенную взвесь при встряхивании.

Вакцина стабильна и сохраняет исходную активность при температуре 2-8°С не менее 18 месяцев (срок наблюдения).

С целью профилактики абортов полученную вакцину вводят взрослым животным двукратно с интервалом 14-21 сут, второй раз не позже, чем за 2 недели до осеменения. Стельных животных вакцинируют дважды: первый раз - за 50-60 сут до отела, второй раз - через 14-21 сут после первой иммунизации (не позднее 30 дней до отела). Телят в возрасте 40-45 сут вакцинируют дважды с интервалом 20-25 сут. Ревакцинацию проводят однократно в той же дозе, каждые 6 мес. Вакцину вводят внутримышечно взрослым животным в дозе 3 см³, телятам - в дозе 2 см³.

Вакцина апробирована на крупном рогатом скоте в неблагополучных хозяйствах. Эта апробация подтверждает безвредность препарата и его противоэпизоотическую эффективность, проявляемую в усилении иммунизирующей активности компонентов инактивированной вакцины. Вакцинация повышает иммунитет у матерей и защищает потомство в период эмбрионального развития и в постнатальный период. При этом индуцируемый иммунный ответ характеризовался высокой специфичностью по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах.

Защитный уровень антител у животных, привитых данной вакциной, сохранялся не менее 8 мес у взрослых животных и 6 мес у молодняка в возрасте до 1 года, колостральный иммунитет - до 1,5 месяцев.

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Получение инактивированной комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза КРС.

Вакцину готовят из новых производственных штаммов вируса инфекционного ринотрахеита ГКВ №2333, вируса диареи ГКВ №2336 (вирусный компонент) и известных вакцинных штаммов лептоспир Leptospira interrogans серогруппы Pomona (штамм ВГНКИ-6), серогруппы Tarassovi (штамм ВГНКИ-4), серогруппы Grippotyphosa (штамм ВГНКИ-1) и серогруппы Sejroe (штаммы "Hardjo" и ВГНКИ-5) (лептоспирозный компонент).

Технологический процесс состоит из следующих основных стадий: стадии получения вирусного компонента, стадии получения лептоспирозного компонента, объединение полученных вирусного и лептоспирозного компонентов, добавление адъюванта, смешивание всех компонентов вакцины с последующей расфасовкой готового продукта.

А. Стадия получения вирусного компонента комбинированной вакцины.

Изготовление вирусного компонента комбинированной вакцины включает раздельные этапы получения вирусных суспензий из посевных материалов штаммов вируса инфекционного ринотрахеита ГКВ №2333 и вируса диареи ГКВ №2336; определения инфекционной активности каждой вирусной суспензии, инактивацию вируссодержащих культуральных жидкостей каждого штамма и их объединение.

Стадия получения вирусных суспензий согласно изобретению основывается на системе посевных материалов (seed lot system), при которой последовательные серии продукции получают из главного посевного материала (master seed lot) при определенном количестве пересевов (пассажей). В текущем производстве рабочий посевной материал (working seed lot) готовится из главного посевного материала. Готовый продукт производят из рабочего посевного материала, при этом число пересевов из главного посевного материала не должно превышать значения, установленного при клинических испытаниях вакцин, исходя из требований безопасности и эффективности.

Процесс получения системы посевных материалов каждого штамма вируса включает несколько этапов:

- приготовление культуры клеток;

- проведение пассажей вируса;

- получение вирусной суспензии;

- промежуточный контроль штамма вируса;

- лиофилизация, замораживание или инактивация штамма вируса;

- контроль штамма вируса.

Штаммы вирусов инфекционного ринотрахеита ГКВ №2333 и вирусной диареи ГКВ №2336 выращивают отдельно в перевиваемой культуре клеток почки теленка МДВК.

Накопление вирусов в культуре клеток оценивают по цитопатическому эффекту. Титр вирусов вычисляют по методу Рида и Менча и выражают в lg ТЦД₅₀/см³.

При достижении титра вирусов до значений 10^7,5-10^9,0 ТЦД₅₀/см³, полученный вируссодержащий материал каждого штамма очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Далее суспензии вирусов инактивируют раствором формалина, содержащим не менее 37% формальдегида. Полноту инактивации оценивают по отсутствию размножения вирусов в чувствительной культуре клеток в течение четырех пассажей.

Инактивированные суспензии вирусов объединяют с таким расчетом, чтобы в каждой серии титр инфекционной активности каждого из штаммов составлял не менее 10^7,5 ТЦД₅₀/см³, например, объединенные вирусные суспензии готовят в следующих соотношениях:

Этап А (1) - смешивают вирусные суспензии штамма ГКВ №2333 и штамма ГКВ №2336 в соотношении 1:1 по объему, если титр инфекционной активности каждого штамма составляет 10^8,0-8,5 ТЦД₅₀/см³;

Этап А (2) - смешивают вирусные суспензии штамма ГКВ №2333 и штамма ГКВ №2336 в соотношении 1:2 по объему, если инфекционная активность штамма ГКВ №2333 составляет 10^8,5-9,0 ТЦД₅₀/см³, а штамма ГКВ №2336 - 10^7,5-8,0 ТЦД₅₀/см³;

Этап А (3) - смешивают вирусные суспензии штамма ГКВ №2333 и штамма ГКВ №2336 в соотношении по объему 2:1, если инфекционная активность штамма ГКВ №2333 составляет 10^7,5-8,0 ТЦД₅₀/см³, а штамма ГКВ №2336 - 10^8,0-8,5 ТЦД₅₀/см³.

Далее объединенные вирусные суспензии тщательно перемешивают.

Б. Стадия получения лептоспирозного компонента комбинированной вакцины.

Культуры лептоспир Leptospira interrogans серогруппы Pomona (штамм ВГНКИ-6), серогруппы Tarassovi (штамм ВГНКИ-4), серогруппы Grippotyphosa (штамм ВГНКИ-1) и серогруппы Sejroe (штаммы "Hardjo" и ВГНКИ-5) выращивают раздельно на жидкой сывороточной питательной среде в течение 7-10 дней до накопления каждого штамма лептоспир не менее 70 млн микробных клеток в 1 см³.

Далее полученные культуры объединяют в соотношениях 1:1:1:0,5:0,5, добавляют формалин до концентрации 0,15%. Полученную смесь инактивированных суспензий клеток концентрируют ультрафильтрацией до получения бакмассы с содержанием 2 млрд микробных клеток в 1 см³ и более.

В. Стадия приготовления готового препарата комбинированной вакцины.

Комбинированную вакцину по изобретению получают путем объединения вирусного и лептоспирозного компонентов вакцины и последующего добавления целевых добавок.

Изготавливают 5 опытных серий (вариантов) вакцины.

Вариант 1.

К объединенной инактивированной суспензии вирусов, приготовленной на стадии А (1), добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, затем добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000, тщательно перемешивают.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов лептоспир, приготовленной на стадии Б, добавляют мертиолят натрия в концентрации 1:10000 в качестве консерванта, затем смешивают с 6%-ным ГОА (20% от общего объема), тщательно перемешивают.

Смешивают вирусный и лептоспирозный компоненты препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 7,5 lg ТЦД₅₀, лептоспир - не менее 270 млн м.кл. в 1 см³.

Вариант 2.

К объединенной инактивированной суспензии вирусов, приготовленной на стадии А (2), добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, затем добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000, тщательно перемешивают.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов лептоспир, приготовленной на стадии Б, добавляют 6%-ный ГОА (20% от общего объема) и тщательно перемешивают.

Смешивают вирусный и лептоспирозный компоненты препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 7,5 lg ТЦД₅₀, лептоспир - не менее 270 млн м.кл. в 1 см³.

Вариант 3.

К объединенной инактивированной суспензии вирусов, приготовленной на стадии А (3), добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л и консервант мертиолят натрия в концентрации 1:10000, тщательно перемешивают.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов лептоспир, приготовленной на стадии Б, добавляют 6%-ный ГОА (20% от общего объема) и тщательно перемешивают.

Смешивают вирусный и лептоспирозный компоненты препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 7,5 lg ТЦД₅₀, лептоспир - не менее 270 млн м.кл. в 1 см³.

Вариант 4.

К объединенной инактивированной суспензии вирусов, приготовленной на стадии А (1), добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 20% от общего объема, затем добавляют сапонин в концентрации 500 мг/л, тщательно перемешивают.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов лептоспир, приготовленной на стадии Б и имеющей концентрацию выше 2 млрд м.кл., добавляют 6%-ный ГОА (20% от общего объема) и тщательно перемешивают.

Смешивают вирусный и лептоспирозный компоненты препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 7,5 lg ТЦД₅₀, лептоспир - не менее 270 млн м.кл. в 1 см³.

Вариант 5.

К объединенной инактивированной суспензии вирусов, приготовленной на стадии А (1), добавляют 6%-ный гель гидроокиси алюминия (ГОА) в количестве 30% от общего объема.

К инактивированной бактериальной суспензии клеток смеси штаммов лептоспир, приготовленной на стадии Б и имеющей концентрацию выше 2 млрд м.кл., добавляют 6%-ный ГОА (30% от общего объема) и тщательно перемешивают.

Смешивают вирусный и лептоспирозный компоненты препарата с таким расчетом, чтобы концентрация вирусных антигенов в готовой вакцине составила не менее 7,5 lg ТЦД₅₀, лептоспир - не менее 270 млн м.кл. в 1 см³.

Полученные варианты инактивированной комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота имеют компонентный состав, приведенный в табл.3.

Табл.3
Композиционный состав комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и лептоспироза крупного рогатого скота
Ингредиент	Титр, lg ТЦД50/см3	Содержание ингредиентов, об.%
Вариант 1	Вариант 2	Вариант 3	Вариант 4	Вариант 5
Вирус ИРТ	7,5-8,0	-	-	40	-	-
8,0-8,5	30	-	-	35	30
8,5-9,0	-	20	-	-	-
Вирус ВД	7,5-8,0	-	40	-	-	-
8,0-8,5	30	-	20	35	30
Суспензия клеток штаммов лептоспир	-	19,94	19,94	19,94	9,95	10,0
ГОА (6%-й гель)	-	20	20	20	20	30
Сапонин	-	0,05	0,05	0,05	0,05	-
Мертиолят натрия	-	0,01	0,01	0,01	-	-

Пример 2. Оценка антигенной активности комбинированной вакцины на экспериментальных моделях.

Для определения антигенной активности комбинированной вакцины по изобретению в качестве экспериментальной модели используют лабораторных животных, при этом для оценки антигенной активности вирусных компонентов вакцины используют морских свинок массой 350-400 г, лептоспирозного компонента - кроликов массой 3-3,5 кг.

Формируют группы по 10 животных в каждой: 3 опытные группы и 1 контрольную (морские свинки), 3 опытные группы и 1 контрольную (кролики).

Морских свинок опытных групп иммунизируют исследуемой вакциной в дозе 0,25 см³; 0,5 см³ и 1,0 см³ соответственно, кроликов - в дозе, содержащей не менее 15 млн лептоспир каждой серогруппы. При этом вакцину вводят морским свинкам внутримышечно, кроликам - внутривенно. Животных контрольных групп не иммунизируют.

На 21 сутки после инъекции вакцины у всех животных берут кровь и отделяют сыворотку, которую затем исследуют на наличие специфических антител.

Антигенную активность вирусного компонента вакцины оценивают по уровню вирус-специфических антител к вирусам ИРТ и ВД. Титр антител определяют в реакции нейтрализации (РН), которую проводят в 96-луночных планшетах по стандартной методике методом двукратных разведений испытуемой сыворотки против рабочей дозы каждого вируса 100 ТЦД₅₀/лунка.

Вируснейтрализующий титр исследуемой сыворотки выражают как предельное ее разведение, ингибирующее развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток.

Антигенную активность лептоспирозного компонента вакцины оценивают в реакции микроагглютинации (РМА) по титру антител в сыворотке крови вакцинированных кроликов.

Результаты исследования представлены в табл.4, которые свидетельствуют, что по антигенной активности комбинированная вакцина против ИРТ, ВД и лептоспироза крупного рогатого скота превосходит существующие аналоги. Так, предлагаемая вакцина уже через 21 сутки после иммунизации обеспечивает выработку специфических антител ко всем компонентам препарата в высоком титре: к вирусу ИРТ - 1:79,8, к вирусу ВД - 1:114,1, к лептоспирам - от 1:1533 до 1:1744, превентивная активность сыворотки крови кроликов составляла 100%. В опытах подтверждено, что контроль вакцины по лептоспирозному компоненту следует проводить на кроликах в дозе не менее 15 млн микробных клеток лептоспир каждой серогруппы.

Животные контрольной группы на протяжении всего опыта были серонегативны к вирусам ИРТ, ВД и лептоспирам.

Табл.4
Антигенная активность комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи и летптоспироза крупного рогатого скота на экспериментальных моделях
Группа жив-х	Титр антител в сыворотке крови морских свинок	Номер серии	Титр антител в сыворотке крови кроликов к лептоспирам	Превентивная активность сыворотки крови кроликов к лептоспирам, %
Доза препарата см3	Титр вируснейтрализующих антител, М±m
ИРТ	ВД
I	0,25	26,1±5,4	70,2±9,5	1	1744±256	50
II	0,5	79,8±6,2	114,1±12,6	2	1680±194	100
III	1,0	63,1±5,2	91,5±10,3	3	1533±205	80
контроль	-	0	0	0	0	0

Пример 3. Оценка стабильности комбинированной вакцины в процессе хранения.

Испытание стабильности комбинированной вакцины, полученной по примеру 1, проводят на экспериментальных животных - морских свинках и кроликах. При этом для оценки стабильности антигенной активности вирусных компонентов вакцины используют морских свинок, лептоспирозного компонента - кроликов.

Для этого вакцину вводят через 6, 12 и 18 мес. хранения при температуре 4°С однократно: морским свинкам в дозе 0,5 см³, кроликам в дозе не менее 15 млн микробных клеток лептоспир каждой серогруппы. Через 21 сут после вакцинации сыворотку крови животных отбирают для исследования.

Стабильность вирусного компонента вакцины оценивают в РН, лептоспирозного - в РМА по отсутствию снижения титра антител ниже установленного уровня (1:16 и 1:400 соответственно) при хранении вакцины при +4°С в течение 18 месяцев.

Результаты испытания представлены в табл.5.

Табл.5
Изменение антигенной активности комбинированной вакцины в процессе хранения
Время хранения	Титр антител в сыворотке крови вакцинированных лабораторных животных
При изгот.	6 мес	12 мес	18 мес
ИРТ	79,8±12,3	80,0±10,2	76,5±12,5	65,8±8,9
ВД	114,1±10,8	108,2±22,5	110,2±16,9	95,8±12,4
Лептоспиры	1680,8±152,3	1450,2±186,3	1428,5±253,1	859,6±106,3

Пример 4. Про