Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезней крупного рогатого скота

Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезней крупного рогатого скота

Реферат

Изобретение относится к области вирусологии, биотехнологии и ветеринарии и касается создания новых вакцин, которые могут быть использованы для специфической профилактики массовых вирусных инфекционных болезней крупного рогатого скота (КРС), особенно у новорожденных телят.

Инфекционный ринотрахеит, парагрипп-3, вирусная диарея, респираторно-синцитиальная, ротавирусная, коронавирусная инфекции относятся к массовым вирусным заболеваниям КРС, которые наблюдаются практически повсеместно, как в промышленных комплексах с большой концентрацией животных, так и в небольших хозяйствах.

В силу различной органотропности этих вирусов вызываемые ими заболевания, как правило, имеют различное клиническое проявление. Вирусы инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи (ВД), респираторно-синцитиальной (PC) инфекции, парагриппа-3 (ПГ-3) являются ведущей этиологической причиной респираторных болезней крупного рогатого скота, а вирусы диареи (ВД) крупного рогатого скота, рота-(РВ) и коронавирусы (KB) поражают преимущественно органы пищеварения.

Установлено, что в большинстве случаев указанные возбудители редко вызывают заболевание самостоятельно, чаще всего циркулируют в стаде в ассоциации, вызывая появление смешанных инфекций с многообразием форм клинического проявления. Инфицированность поголовья данными вирусами может достигать 100%, гибель и вынужденная выбраковка - 15-30% и более.

При смешанных инфекциях трудно определить ведущую роль того или иного инфекционного агента, поэтому в системе мер борьбы с массовыми вирусными болезнями решающее значение приобретает использование поливалентных комбинированных вакцин, сочетающих в себе антигены нескольких доминирующих возбудителей.

К настоящему времени известно несколько комбинированных вакцин различной валентности против смешанных вирусных инфекций, однако их применение не всегда сопровождается положительным эффектом, главным образом, из-за недостаточной иммуногенной активности и узкого антигенного спектра. Сдерживающим фактором в получении эффективных комбинированных вакцин является сложность создания стабильной композиции совместимых и неконкурирующих между собой антигенов, сбалансированных как в антигеном, так и иммуногенном отношении.

Известна вакцина "ТРИВАК (ВИЭВ)" для профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота, содержащая антигены из аттенуированных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и диареи - болезни слизистых. В качестве штаммов вирусов вакцина содержит штамм Herpes virus bovis "ТК-А(ВИЭВ)В-2" с активностью 10^4,5-10^6,5 ТЦД₅₀/мл, штамм Virus diarrhea - mucosal disease bovinum "BK-1(B-1)N 28" с активностью 10^4,0-10^6,0 ТЦД₅₀/мл, штамм Paramyxovirus "ПТК-45/86" с активностью 10^5,0-10^7,0 ТЦД₅₀/мл (патент RU 2111011, А61К 39/295, опубл. 20.05.1998).

Недостатком данной вакцины является низкая защита поголовья КРС от пневмогастроэнтеритов вследствие неполноценности антигенного состава входящих в нее компонентов и сложных взаимодействий вирусов, из которых она изготовлена.

Известна инактивированная комбинированная вакцина против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезней телят "КОМБОВАК", содержащая производственные инактивированные штаммы 6 вирусов: инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезней крупного рогатого скота (Наставление по применению вакцины инактивированной комбинированной против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезни телят КОМБОВАК, №13-3-04/0703 от 20.03.2003, утвержденное Департаментом ветеринарии 20.03.2003).

Недостатком известной комбинированной вакцины является относительно невысокий титр инфекционной активности входящих в ее состав вирусных суспензий, в результате чего в прививной дозе не обеспечивается необходимое количество протективных антигенов против указанных болезней.

Наиболее близким аналогом является комбинированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов крупного рогатого скота и телят, содержащая адъювант и инактивированные суспензии вирусов инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, ротавирусной и коронавирусной инфекции в титре 10^7,5-10^8,5 ТЦД_50/см³. инактивированные суспензии вирусов парагриппа-3 и респираторно-синцитиальной инфекции - в титре 10^6,5-10^7,5 ТЦД_50/см³, взятые в вакцине в объемном соотношении 1:1:1:1:0,5:0,5 соответственно (Патент RU №2261111, А61К 39/295, опубл. 27.09.2005).

К недостаткам ближайшего аналога относится то, что входящие в его состав вакцинные штаммы вирусов не обеспечивают формирование иммунитета по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам, эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах, и, как следствие этого, известная вакцина является недостаточно эффективной. Кроме того, известная вакцина не позволяет достигнуть высокого уровня титров антител в крови коров и в молозиве, выпаиваемом новорожденным телятам.

В связи с этим задачей изобретения является создание комбинированной (поливалентной) вакцины против основных вирусных заболеваний КРС, обеспечивающей формирование устойчивого иммунитета по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах, и способной, таким образом, повысить сохранность молодняка и продуктивность взрослых животных.

Еще одной задачей является получение новых производственных штаммов вирусов ИРТ, ПГ-3, ВД, PC, PB и KB, обладающих широким антигенным спектром, высокой антигенной и иммуногенной активностью не только в нативном виде, но и после инактивации, стабильно сохраняющих свои свойства и пригодных для создания инактивированных комбинированных вакцин различной валентности.

Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала комбинированных вакцин против основных вирусных болезней КРС, а также в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности комбинированной вакцины, расширении ее антигенного спектра и усилении напряженности иммунитета у привитых животных и родившихся телят против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота - и коронавирусной болезней КРС.

Технический результат изобретения достигается за счет использования в составе вакцины новых производственных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиального вируса, рота-, коронавирусов с широким антигенным спектром и образования синергетичсской ассоциации вирусных антигенов в составе поливалентной вакцины, проявляемой в усилении иммунного ответа и установлении долговременного иммунитета.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Предлагаемая инактивированная комбинированная вакцина против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота - и коронавирусной болезней крупного рогатого скота, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличается тем, что в качестве активного вещества она содержит смесь инактивированной суспензии штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ГКВ №2333, семейства Herpesviridae, подсемейства Alphaherpesviridae; инактивированной суспензии штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота ГКВ №2334, подсемейства Paramixoviridae, рода Paramixovirus; инактивированной суспензии штамма вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, семейства Flaviviridae, рода Pestivirus; инактивированной суспензии штамма вируса респираторно-синцитиальной болезни крупного рогатого скота ГКВ №2335, подсемейства Pneumoviridae, рода Pneumovirus; инактивированной суспензии штамма ротавируса крупного рогатого скота ГКВ №2337, семейства Reoviridae, рода Rotavims; инактивированной суспензии штамма коронавируса крупного рогатого скота ГКВ №2338, семейства Coronaviridae, рода Coronavirus, в эффективном количестве.

Термин «эффективное количество» означает количество активного вещества, которое при введении коровам и/или телятам обеспечивает индукцию специфического иммунного ответа достаточного уровня в организме животных с последующим предупреждением от заболеваний и симптомов заболеваний, подлежащих профилактике.

Входящие в состав комбинированной вакцины штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ГКВ №2333, штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота ГКВ №2334, штамм вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336, штамм вируса респираторно-синцитиальной болезни крупного рогатого скота ГКВ №2335, штамм ротавируса крупного рогатого скота ГКВ №2337, штамм коронавируса крупного рогатого скота ГКВ №2338 являются новыми производственными штаммами и впервые используются в составе вакцинных препаратов.

Термин «производственный штамм» означает вакцинный штамм, изученный по своим биологическим свойствам, стабильный при хранении и пересевах, безвредный после инактивирования или аттенуирования для животного, хорошо адаптированный к системе культивирования, обладающий высокой антигенной и иммуногенной активностью, как для чувствительной лабораторной модели, так и для естественно восприимчивых животных, а также характеризующийся широким антигенным спектром, доминирующим над эпизоотическими штаммами возбудителя.

Производственный штамм вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ГКВ №2333 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2333 и характеризуется следующими признаками и свойствами.

Источник происхождения:

Источником получения нового производственного штамма вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота является вирусный штамм В-25 (авторское название), выделенный в 1991 г. из носового смыва теленка с респираторным синдромом, который прошел 35 последовательных пассажей в перевиваемых культурах клеток КРС.

Морфологические свойства:

Штамм ГКВ №2333 относится к семейству Herpesviridae, подсемейство Alphaherpesviridae. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса инфекционного ринотрахеита КРС, размером 150-200 нм и состоящие из капсида кубической симметрии и покрывающей его внешней оболочки. Капсид имеет 162 призматических полых капсомера. Нуклеокапсид формируется внутри ядра, где образуются включения типа А.

Антигенные свойства:

Штамм ГКВ №2333 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2333 вируса ИРТ ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса ИРТ (табл.1).

Табл.1
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2333 вируса ИРТ
Штамм/изолят вируса ИРТ для РН	Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2333 вируса ИРТ*, М±m
ГКВ №2333	142,1±24,2
В-25	84,4±13,8
Изолят №1702	76,1±23,9
Изолят №2105	87,3±12,5
Изолят №1320	111,4±26,5
*здесь и далее в таблицах приведены обратные значения титра антител

Биотехнологические характеристики:

Штамм ГКВ №2333 хорошо размножается в первичных и перевиваемых культурах клеток (почки, тестикулы), полученных из тканей и органов крупного рогатого скота. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 7,5-8,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Рекомендуемый способ хранения:

В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.

Периодичность освежения:

Один раз в три года в перевиваемой культуре клеток почки теленка МДВК (далее - культура клеток МДВК).

Дополнительные сведения о штамме:

Штамм ГКВ №2333 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB).

Реактогенность - штамм ГКВ №2333 реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Производственный штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота ГКВ №2334 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2334 и характеризуется следующими признаками и свойствами.

Источник происхождения:

Источником получения нового штамма производственного вируса парагриппа-3 КРС является вирусный штамм В-19 (авторское название), выделенный в 1990 г. из носового смыва теленка с признаками ринита в культуре клеток почки теленка, который прошел 67 последовательных пассажей в культуре клеток МДВК.

Морфологические свойства:

Штамм ГКВ №2334 относится к порядку Paramixoviridae, подсемейству Paramixovirinae, роду Paramixovirus. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса ПГ-3, полиморфной слегка овальной формы, размер вириона варьирует от 150 до 250 нм. Вирион состоит из оболочки и внутреннего компонента, который представлен рибонуклеопротеидной спиралью.

Антигенные свойства:

Штамм ГКВ №2334 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2334 вируса ПГ-3 ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса ПГ-3 (табл.2).

Табл.2
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2334 вируса ПГ-3
Штамм/изолят вируса ПГ-3 для РН	Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2334 вируса ПГ-3, М±m
ГКВ №2334	322,4±18,5
В-19	276,2±36,7
Изолят №543	111,4±26,5
Изолят №486	161,1±25,6

Биотехнологические характеристики:

Штамм ГКВ №2334 хорошо размножается в первичных и перевиваемых культурах клеток (почки, легкие), полученных из тканей и органов крупного рогатого скота. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 7,5-9,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Рекомендуемый способ хранения:

В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.

Периодичность освежения:

Один раз в три года в культуре клеток МДВК.

Дополнительные сведения о штамме:

Штамм ГКВ №2334 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB).

Реактогенность - штамм ГКВ №2334 реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Производственный штамм вируса диареи крупного рогатого скота ГКВ №2336 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2336 и характеризуется следующими признаками и свойствами.

Источник происхождения:

Источником получения нового производственного штамма вируса диареи ГКВ №2336 является вирусный штамм СТ-89 (авторское название), выделенный в 1989 г. из содержимого кишечника телят с признаками диареи в культуре клеток почки новорожденного теленка, который прошел 82 последовательных пассажа в перевиваемой культуре клеток МДВК.

Морфологические свойства:

Штамм ГКВ №2336 относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для вируса диареи КРС, размером 40-60 нм и состоящие из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии и наружной липопротеидной оболочки.

Антигенные свойства:

Штамм ГКВ №2336 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2336 вируса диареи КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса ВД.

Результаты оценки антигенных свойств штамма ГКВ №2336 представлены в табл.3.

Табл.3
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2336 вируса ВД
Штамм/изолят вируса ВД для РН	Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2336 вируса ВД, М±m
ГКВ №2336	374,8±31,6
СТ-89	107,6±24,5
Изолят №865	168,9±21,3
Изолят №1204	337,7±26,8
Изолят №663	174,8±22,4

Имеет тесное антигенное родство с вирусами классической чумы свиней и пограничной болезни овец.

Биотехнологические характеристики:

Штамм ГКВ №2336 хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и в культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 10^7,5-10^8,5 ТЦД₅₀/см³.

Рекомендуемый способ хранения:

В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.

Периодичность освежения:

Один раз в три года в культуре клеток МДВК.

Дополнительные сведения о штамме:

Штамм ГКВ №2336 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB) и в тест-системе ПЦР.

Реактогенность - штамм ГКВ №2336 реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Производственный штамм вируса респираторно-синцитиальной болезни крупного рогатого скота ГКВ №2335 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2335 и характеризуется следующими признаками и свойствами.

Источник происхождения:

Источником получения нового штамма производственного вируса PC КРС является вирусный штамм 89 (авторское название), выделенный в 1989 г. из носовых смывов телят с признаками ринита и пневмонии в культуре клеток почки эмбриона коровы, который прошел 72 последовательных пассажа в культуре клеток МДВК.

Морфологические свойства:

Штамм ГКВ №2335 относится к порядку Paramixoviridae, подсемейству Pneumoviridae, роду Pneumovirus. При электронном микроскопическом исследовании методом негативного контрастирования вируссодержащего культурального материала обнаружены вирионы, характерные для респираторно-синцитиального вируса КРС, размером 200-300 нм и состоящие из нуклеокапсида спиральной симметрии и наружной липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются выступы длиной 8-12 нм.

Антигенные свойства:

Штамм ГКВ №2335 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2335 вируса PC ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам вируса PC (табл.4).

Табл.4
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2335 вируса РС
Штамм/изолят вируса PC для РН	Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2335 вируса PC, M±m
ГКВ №2335	162,5±22,8
PC-89	81,6±22,5
Изолят №124	62,3±16,4

Антигенно связан с PC вирусом человека.

Биотехнологические характеристики:

Штамм ГКВ №2335 хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и в культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 6,5-7,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Рекомендуемый способ хранения:

В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.

Периодичность освежения:

Один раз в три года в культуре клеток МДВК.

Дополнительные сведения о штамме:

Штамм не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB).

Реактогенность - штамм ГКВ №2335 реактогенными свойствами не

обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Производственный штамм ротавируса крупного рогатого скота ГКВ №2337 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2337 и характеризуется следующими признаками и свойствами.

Источник происхождения:

Источником для получения нового производственного штамма ротавируса КРС является вирусный штамм К-88 (авторское название), выделенный в 1988 г. из содержимого кишечника теленка с выраженной диареей, который прошел 69 последовательных пассажей в перевиваемых культурах клеток КРС.

Морфологические свойства:

Штамм ГКВ №2337 относится к семейству Reoviridae, роду Rotavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ротавирусной инфекции КРС: вирион представляет собой образование округлой формы диаметром 60-80 нм, напоминающий вид колеса.

Антигенные свойства:

Штамм ГКВ №2337 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2337 ротавируса КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам ротавируса КРС (табл.5).

Табл.5
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2337 ротавируса КРС
Штамм/изолят ротавируса для РН	Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских свинок, иммунизированных штаммом ГКВ №2337 ротавируса, М±m
ГКВ №2337	824,3±46,1
К-88	406,2±36,0
Изолят №2810	238,8±26,4
Изолят №Р-47	219,4±24,2
Изолят №Р-56	351,7±34,2

Имеет антигенное родство с ротавирусами, выделенными от других видов животных.

Биотехнологические характеристики:

Штамм хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и в культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 7,5-8,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Рекомендуемый способ хранения:

В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.

Периодичность освежения:

Один раз в три года в культуре клеток МДВК.

Дополнительные сведения о штамме:

Штамм ГКВ №2337 не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью референс-сыворотки (GB) и в ИФА.

Реактогенность - штамм ГКВ №2337 реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Производственный штамм коронавируса крупного рогатого скота ГКВ №2338 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии РАМН, имеет регистрационный номер депонента ГКВ №2338 и характеризуется следующими признаками и свойствами.

Источник происхождения:

Источником получения нового производственного штамма коронавируса КРС является вирусный штамм КВ-90 (авторское название), выделенный в 1990 г. из содержимого кишечника теленка с выраженной диареей в культуре клеток почки эмбриона коровы, который прошел 48 последовательных пассажей в перевиваемых культурах клеток КРС.

Морфологические свойства:

Штамм ГКВ №2338 относится к семейству Coronaviridae, роду

Coronavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя коронавирусной инфекции КРС: вирион представляет собой образование округлой или овальной формы диаметром 80-100 нм с булавовидными выступами длиной 12-24 нм, образующие подобие солнечной короны. Геном вируса представлен однонитевой, фрагментированной РНК.

Биотехнологические характеристики:

Штамм ГКВ №2338 хорошо размножается в первичной культуре клеток почки телят (эмбрионов коров) и культуре клеток МДВК. В указанных культурах клеток вирус накапливается в титре 6,5-7,5 lg ТЦД₅₀/см³.

Антигенные свойства:

Штамм ГКВ №2338 проявляет высокую антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, обладает широким антигенным спектром и доминирует по отношению к полевым штаммам.

Введение морским свинкам штамма ГКВ №2338 коронавируса КРС ведет к формированию гуморального иммунного ответа к различным штаммам и полевым изолятам коронавируса КРС (табл.6).

Табл.6
Перекрестная антигенная активность штамма ГКВ №2338 коронавируса КРС
Штамм/изолят коронавируса для РН	Титр вируснейтрализующих антител в сыворотке крови морских штаммом свинок, иммунизированных №2338 коронавируса, М±m
ГКВ №2338	247,3±41,8
КВ-90	187,4±36,6
Изолят №456	81,5±12,8
Изолят №128	59,7±6,7

Рекомендуемый способ хранения: в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С.

Периодичность освежения: один раз в три года в культуре клеток МДВК.

Дополнительные сведения о штамме:

Штамм не контаминирован посторонней микрофлорой. Тестируется с помощью корона-клона.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при последовательных пассажах в культуре клеток МДВК в течение 10 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

В составе комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезней крупного рогатого скота инактивированные вирусные суспензии штаммов содержатся с титром инфекционной активности каждого вируса не менее 10^6,5 ТЦД⁵⁰ в 1 см³ вакцины.

Инактивацию вирусных суспензий осуществляют любым известным способом, например путем добавления формалина или димера этиленимина (ДЭИ).

В составе предлагаемой вакцины вирусные суспензии штаммов могут содержаться в любых сочетаниях по объему, например вирусные суспензии содержатся в соотношении по объему 1:1:1:1:1:1 при титре инфекционной активности штаммов ГКВ №2333, ГКВ №2336, ГКВ №2334, ГКВ №2337 - 10^8,5-9,0 ТЦД₅₀/см³ и штаммов ГКВ №2335 и ГКВ №2338 - 10^6,5-7,0 ТЦД₅₀/см³. В других вариантах получения вакцины вирусные суспензии смешивают в соотношении по объему 2:2:2:2:1:1, если титр инфекционной активности штаммов ГКВ №2333, ГКВ №2336, ГКВ №2334, ГКВ №2337 составляет 10^7,5-8,5 ТЦД₅₀/см³, а штаммов ГКВ №2335 и ГКВ №2338 - 10^7,0-7,5 ТЦД⁵⁰/см³; или в соотношении по объему 2:2:1:1:2:2, если титр инфекционной активности штаммов ГКВ №2333, ГКВ №2336 составляет 10^7,5-8,5 ТЦД₅₀/см³, штаммов ГКВ №2334, ГКВ №2337 - 10^8,5-9,0 ТЦД₅₀/см³ и штаммов ГКВ №2335 и ГКВ №2338 - 10^6,5-7,0 ТЦД₅₀/см³. При этом следует отметить, что увеличение или уменьшение объема в два раза одного из компонентов не оказывает значительного влияния на антигенную активность готовой вакцины.

Согласно изобретению комбинированная вакцина также содержит одну или более приемлемую в ветеринарии целевую добавку.

Термин "целевая добавка" означает любые приемлемые в ветеринарии фармацевтические компоненты, которые традиционно используются для обеспечения сохранности антигенов в процессе технологической переработки, приготовления конечной рецептурной формы или последующего хранения и тому подобное.

В качестве целевой добавки комбинированная вакцина может содержать растворитель, адъювант, солюбилизирующий агент, разбавитель, консервант, стабилизатор, антибактериальное и противогрибковое средства, изотонический агент, агент, задерживающий всасывание, и тому подобное. Разбавители могут включать дистиллированную воду, физиологический раствор, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать, наряду с другими, хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают альбумин, сахарозу, желатозу, обезжиренное молоко и т.д.

Адъюванты включают вещества, неспецифически усиливающие иммунный ответ к антигенам, и могут быть минерального происхождения - гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, алюминиево-калиевые квасцы; растительного происхождения - сапонин (Квил-А); адъюванты на основе минеральных и неминеральных масел; синтетический адъювант - мурамилдипептид и др.

В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина преимущественно содержит адъювант, например гидрат окиси алюминия или смесь гидрата окиси алюминия с сапонином.

При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать консервант мертиолят натрия в количестве 1:10000.

Хотя специалист в данной области может легко определить количество и концентрацию адъювантов и добавок, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к композициям, включающим предпочтительно от 19,94 до 30 об.% адъюванта.

В предпочтительном варианте вакцина содержит 6%-ный гель гидрата окиси алюминия в количестве 19,94 об.% и сапонин в количестве 0,05 об.%, что соответствует 11,964 г гидрата окиси алюминия и 500 мг сапонина в 1 л вакцины.

Нижеследующие примеры рецептур являются чисто иллюстративными и не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезней крупного рогатого скота представляет собой жидкость светло-красного цвета, при хранении образуется рыхлый сероватый осадок, легко разбивающийся в гомогенную взвесь при встряхивании.

Вакцина стабильна и сохраняет исходную активность при температуре 2-8°С не менее 18 месяцев (срок наблюдения).

Вакциной против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезней крупного рогатого скота прививают коров и телок случного возраста дважды: за 4 и 1 неделю до осеменения, а затем перед отелом: первый раз - за 50-60 сут до отела, второй раз - через 14-21 сут после первой иммунизации (не позднее 30 сут до отела) подкожно в дозе 3 см³.

Телят в возрасте 30 сут и старше вакцинируют дважды с интервалом 20-25 сут в дозе 2 см³. Животных старше 4-месячного возраста вакцинируют дважды внутримышечно в дозе 3 см³ с интервалом 14-21 сут.

Ревакцинацию проводят однократно в той же дозе каждые 6 мес. до исчезновения заболеваний в хозяйстве.

Вакцина апробирована на крупном рогатом скоте в неблагополучных хозяйствах. Эта апробация подтверждает безвредность препарата и его противоэпизоотическую эффективность, проявляемую в усилении иммунизирующей активности компонентов инактивированной вакцины. Вакцинация повышает иммунитету матерей и защищает потомство в период эмбрионального развития и в постнатальный период. При этом индуцируемый иммунный ответ характеризовался высокой специфичностью по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах.

Защитный уровень антител у животных, привитых данной вакцинной сохранялся не менее 8 мес у взрослых животных и 6 мес у молодняка в возрасте до 1 года, колостральный иммунитет - до 1,5 месяцев.

Вакцина по изобретению отличается более высокой антигенной и иммуногенной активностью, способностью создавать колостральный иммунитет высокой напряженности, высокой стабильностью при хранении.

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.

Пример 1. Получение инактивированной комбинированной вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезней крупного рогатого скота.

Вакцину готовят из новых производственных штаммов вируса инфекционного ринотрахеита ГКВ №2333, вируса парагриппа-3 №2334, вируса диареи ГКВ №2336, респираторно-синцитиального вируса ГКВ №2335, ротавируса ГКВ №2337 и коронавируса ГКВ №2338.

Технологический процесс состоит из следующих основных стадий:

стадии раздельного получения вирусных суспензий из штаммов вируса инфекционного ринотрахеита ГКВ №2333, вируса парагриппа-3 №2334, вируса диареи ГКВ №2336, ротавируса ГКВ №2337, респираторно-синцитиального вируса ГКВ №2335 и коронавируса ГКВ №2338; определения инфекционной активности каждой вирусной суспензии, инактивации вируссодержащих культуральных жидкостей каждого штамма отдельно, объединения полученных инактивированных суспензии вирусов, добавления адъюванта, смешивания всех компонентов вакцины с последующей расфасовкой готового продукта.

Стадия получения вирусных суспензий согласно изобретениию основывается на системе посевных материалов (seed lot system), при которой последовательные серии продукции получают из главного посевного материала (master seed lot) при определенном количестве пересевов (пассажей). В текущем производстве рабочий посевной материал (working seed lot) готовится из главного посевного материала. Готовый продукт производят из рабочего посевного материала, при этом число пересевов из главного посевного материала не должно превышать значения, установленного при клинических испытаниях вакцин, исходя из требований безопасности и эффективности.

Процесс получения системы посевных материалов каждого штамма вируса включает несколько этапов:

- приготовление культуры клеток МДВК;

- проведение пассажей вируса;

- получение вирусной суспензии;

- промежуточный контроль штамма вируса;

- лиофилизация, замораживание или инактивирование штамма вируса;

- контроль штамма вируса.

Все используемые для изготовления комбинированной вакцины штаммы вирусов выращивают в перевиваемой культуре клеток почки теленка МДВК.

Для культивирования штаммов ротавируса ГКВ №2337 и коронавируса ГКВ №2338 в поддерживающую среду добавляют трипсин в концентрации 5 мкг/см³

Накопление вирусов в культуре клеток оценивают по цитопатическому эффекту, накопление вируса ПГ-3 так же по гемагглютинирующей активности с использованием эритроцитов морской свинки. Титр вирусов вычисляют по методу Рида и Менча и выражают в lg ТЦД₅₀/см³.

При достижении титра вирусов инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, ротавирусной инфекции и парагриппа-3 до значений 10^7,5-10^9,0 ТЦД₅₀/см³, а вирусов респираторно-синцитиальной и коронавирусной инфекций - 10^6,5-10^7,5 ТЦД₅₀/см³ полученный вируссодержащий материал каждого штамма очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Далее суспензии вирусов инактивируют раствором формалина, содержащим не менее 37% формальдегида. Полноту инактивации оценивают по отсутствию размножения вирусов в чувствительной культуре клеток в течение четырех пассажей.

Инактивированные суспензии вирусов объединяют с таким расчетом, чтобы в каждой серии титр