Новые соединения

Новые соединения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к терапевтически активным соединениям, которые являются производными ксантина, способам получения указанных производных, фармацевтическим композициям, содержащим эти активные соединения, и применению этих соединений в терапии, особенно для лечения заболеваний, где недостаточная активация рецептора HM74A способствует развитию заболевания или где активация рецептора будет иметь полезный эффект.

Дислипидемия - общий термин, используемый для описания лиц с аберрантными липопротеиновыми профилями. Клинически, основными классами соединений, используемых для лечения пациентов с дислипидемией, имеющих поэтому риск сердечно-сосудистого заболевания, являются статины, фибраты, связывающие желчные кислоты смолы и никотиновая кислота. Никотиновая кислота (Ниацин, витамин B) использовалась клинически в течение более 40 лет у больных с различными формами дислипидемии. Первичный способ действия никотиновой кислоты осуществляется через ингибирование чувствительной к гормонам триглицеридлипазы (HSL), которое приводит к понижению плазменных уровней неэтерифицированных жирных кислот (NEFA), что, в свою очередь, изменяет жировой обмен в печени таким образом, что снижается продукция ЛПНП и ЛПОНП (липопротеинов низкой и очень низкой плотности). Уменьшенные уровни ЛПОНП, как полагают, понижают активность белка переноса сложного эфира холестерина (CETP), что приводит к увеличенному уровню ЛПВП (липопротеин высокой плотности), что может быть причиной наблюдаемых улучшений состояния сердечно-сосудистой системы. Таким образом, никотиновая кислота осуществляет очень желательное изменение липопротеиновых профилей; снижение уровней ЛПОНП и ЛПНП, увеличивая ЛПВП. Также было показано, что никотиновая кислота оказывает благоприятное действие на изменение течения заболеваний, уменьшая прогрессию и увеличивая регрессию атеросклеротических поражений и уменьшая количество случаев сердечно-сосудистых заболеваний в нескольких испытаниях.

Наблюдаемое ингибирование HSL обработкой никотиновой кислотой опосредовано уменьшением в клетках циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), вызванным опосредованным G-белком ингибированием аденилилциклазы. Недавно связанные с G-белком рецепторы HM74 и HM74A были идентифицированы как рецепторы никотиновой кислоты (заявка PCT WO02/84298; Wise et.al. J Biol Chem., 2003, 278(11), 9869-9874). Последовательность ДНК человеческого HM74A может быть найдена в Genbank; номер доступа AY148884. Две другие публикации поддерживают это открытие (Tunaru et.al. Nature Medicine, 2003, 9(3), 352-255 and Soga et.al. Biochem Biophys Res Commun., 2003, 303(1) 364-369), однако номенклатура немного отличается. В публикации Tunaru то, что они называют человеческим HM74, фактически является HM74A, а в публикации Soga HM74b идентично HM74A. Клетки, трансфицированные таким образом, чтобы экспрессировать HM74A и/или HM74, приобретают способность вызывать G_i G-белок-опосредованный ответ при воздействии никотиновой кислоты. У мышей, у которых отсутствует гомолог HM74A (m-PUMA-G), никотиновая кислота не в состоянии уменьшить плазменные уровни NEFA.

Некоторые производные ксантина были синтезированы и раскрыты в предшествующем уровне техники. Например, в EP0389282 раскрыты производные ксантина как потенциальные медиаторы цереброваскулярных нарушений. Ряд производных ксантина был идентифицирован в качестве антагонистов рецептора аденозина Jacobson et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 2639-2644.

Авторы изобретения представляют группу производных ксантина, которые являются селективными агонистами рецептора никотиновой кислоты HM74A и являются, таким образом, пригодными для лечения, профилактики и супрессии заболеваний, где пониженная активация этого рецептора способствует развитию заболевания или где активация рецептора будет иметь полезный эффект.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к терапевтически активным производным ксантина и применению этих производных в терапии, особенно для лечения заболеваний, где пониженная активация этого рецептора HM74A способствует развитию заболевания или где активация рецептора будет иметь полезный эффект, в частности заболеваний, связанных с метаболизмом липидов, включая дислипидемию или гиперлипопротеинемию, такую как диабетическая дислипидемия и смешанная дислипидемия, сердечную недостаточность, гиперхолестеринемию, сердечно-сосудистые заболевания, включая атеросклероз, артериосклероз и гипертриглицеридемию. Как таковые соединения могут также быть использованы как терапевтические средства для лечения заболевания коронарных артерий, тромбоза, стенокардии, хронической почечной недостаточности, периферического сосудистого заболевания и инсульта, а также сердечно-сосудистых показаний, связанных с сахарным диабетом типа II, диабета типа I, резистентности к инсулину, гиперлипидемии, нервной анорексии, ожирения. Соединения могут также быть полезны для лечения воспалительных заболеваний или состояний, как изложено далее ниже.

Промежуточные соединения, композиции, методы и способы, описанные здесь, составляют дальнейшие объекты изобретения.

Подробное описание изобретения

Согласно одному аспекту изобретение относится к соединению Формулы (I)

и его физиологически функциональному производному, в которой

R¹ выбирают из водорода и C_1-4 алкила, который может быть необязательно замещен одной или более группами, выбранными из CN и CF₃;

R² выбирают из незамещенного C_3-10 алкила, C_1-10 алкила, замещенного одной или более группами, выбранными из фтора и CN, C₅ алкенила, неразветвленного C₄ алкенила и C_1-4 алкила, замещенного циклоалкилом;

и R³ выбирают из галогена и CN;

при условии, что:

(i) когда R₃ обозначает Cl и R¹ обозначает этил, тогда R² отличен от пропила;

(ii) когда R³ обозначает бром и R¹ обозначает пропил, тогда R² отличен от пропила;

(iii) когда R³ обозначает Cl или бром и R¹ обозначает бутил, тогда R² отличен от бутила; и

(iv) когда R¹ обозначает C_1-4 алкил, CH₂CN или (CH₂)₃CF₃, тогда R² отличен от разветвленного алкила.

Соединения полезны для лечения заболеваний, где недостаточная активация рецептора HM74A способствует развитию заболевания или где активация рецептора будет иметь полезный эффект, в частности заболеваний, связанных с метаболизмом липидов, включая дислипидемию или гиперлипопротеинемию, такую как диабетическая дислипидемия и смешанная дислипидемия, сердечную недостаточность, гиперхолестеринемию, сердечно-сосудистое заболевание, включая атеросклероз, артериосклероз и гипертриглицеридемию. Как таковые соединения могут также быть использованы как терапевтические средства для лечения заболевания коронарных артерий, тромбоза, стенокардии, хронической почечной недостаточности, периферического сосудистого заболевания и инсульта, а также сердечно-сосудистых показаний, связанных с сахарным диабетом типа II, диабета типа I, резистентности к инсулину, гиперлипидемии, нервной анорексии, ожирения. Также соединения согласно настоящему изобретению могут найти применение как агонисты или частичные агонисты HM74A (модуляторы HM74A).

В особых вариантах осуществления R¹ выбирают из водорода, С_1-4 алкила, CH₂CN и (CH₂)₃CF₃; в более частных случаях осуществления R¹ выбирают из водорода и метила.

В некоторых вариантах осуществления R² выбирают из незамещенного С_3-10 алкила, C_1-6 алкила, замещенного одним или более CN, C_1-10 алкила, замещенного одним или более фтором, C₅ алкенила, неразветвленного C₄ алкенила и С_1-4 алкила, замещенного циклоалкилом. В частности, R² выбирают из незамещенного C_3-10 алкила; (CH₂)_1-5CN; C_2-5 алкила, замещенного одним или более фтором; C₅ алкенила; и С_1-4 алкила, замещенного циклоалкилом. Более предпочтительно R² выбирают из незамещенного C_4-6 н-алкила, например пентила; (CH₂)_1-3CN, например (CH₂)CN или (CH₂)₃CN; C_3-4 алкила, замещенного одним или более фтором, в частности, где концевой атом углерода полностью насыщен фтором, например (CH₂)_2-3CF₃; и C₅ алкенила, в частности, где имеется только одна двойная связь, например, где двойная связь расположена между четвертым и пятым атомами углерода (терминальный алкенил).

В предпочтительных вариантах осуществления R³ обозначает галоген. Более предпочтительно R³ выбирают из хлора и брома. Наиболее предпочтительно R³ обозначает хлор.

Следует понимать, что настоящее изобретение включает любую комбинацию отдельных вариантов осуществления и охватывает все комбинации частных случаев заместителей, описанных выше.

Конкретные соединения согласно настоящему изобретению включают:

(8-хлор-2,6-диоксо-1,2,6,7-тетрагидро-3H-пурин-3-ил)ацетонитрил,

3-бутил-8-хлор-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-1-метил-3-пентил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(4,4,4-трифторбутил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-бром-1-метил-3-пентил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(3,3,3-трифторпропил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-1-пропил-3-(2,2,2-трифторэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

3-бутил-8-хлор-1-метил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

(3-бутил-8-хлор-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1H-пурин-1-ил)ацетонитрил,

8-хлор-3-(2-циклопропилэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-1,3-бис(4,4,4-трифторбутил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

4-(8-хлор-1-метил-2,6-диоксо-1,2,6,7-тетрагидро-3H-пурин-3-ил)бутаннитрил,

8-хлор-1-этил-3-(2,2,2-трифторэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

1-метил-2,6-диоксо-3-пентил-2,3,6,7-тетрагидро-1H-пурин-8-карбонитрил,

8-хлор-3-пропил-1-метил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(3-метилбутил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-пентил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-пропил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

3-бутил-1-метил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1H-пурин-8-карбонитрил,

8-хлор-3-(4-пентен-1-ил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-гексил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

4-(8-хлор-2,6-диоксо-1,2,6,7-тетрагидро-3H-пурин-3-ил)бутаннитрил,

8-хлор-3-гексил-1-метил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

3-бутил-8-хлор-1-этил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

[8-хлор-3-(2-циклопропилэтил)-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1H-пурин-1-ил]ацетонитрил,

(8-хлор-2,6-диоксо-3-пропил-2,3,6,7-тетрагидро-1H-пурин-1-ил)ацетонитрил,

8-хлор-1-(4,4,4-трифторбутил)-3-(2,2,2-трифторэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(2,2,2-трифторэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

2,2'-(8-хлор-2,6-диоксо-6,7-дигидро-1H-пурин-1,3(2H)-диил)диацетонитрил,

8-хлор-1-метил-3-(4,4,4-трифторбутил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(2-циклогексилэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

1,3-дибутил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1Н-пурин-8-карбонитрил,

1,3-дибутил-8-йод-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(4-метилпентил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(6-метилпентил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-октил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-децил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(циклогексилметил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

(+/-)-8-хлор-3-(3-метилпентил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(2-циклопентилэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(циклопропилметил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

(+/-)-8-хлор-3-(2-метилбутил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

(+/-)-8-хлор-3-(2-метилпентил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(циклобутилметил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(циклопентилметил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(3-циклопропилпропил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(2-циклобутилэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(4-фторбутил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(3-фторпропил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(5-фторпентил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

4-(8-хлор-1-метил-2,6-диоксо-1,2,6,7-тетрагидро-3Н-пурин-3-ил)бутаннитрил,

3-(3-бутен-1-ил)-8-хлор-3,7-дигидро-1Н-пурин-2,6-дион,

6-(8-хлор-2,6-диоксо-1,2,6,7-тетрагидро-3Н-пурин-3-ил)-2,2-диметилгексаннитрил,

8-хлор-3-(6-фторгексил)-3,7-дигидро-1Н-пурин-2,6-дион.

В настоящем описании и в формуле изобретения слова «содержит» и «включает», а также их варианты, такие как «содержат», «содержащий», «включают» и «включающий», должны пониматься включительно. То есть следует понимать, что могут быть включены другие элементы или составляющие, не упомянутые особо, если это позволяет контекст.

В настоящем описании термин «галоген» относится к фтору, хлору, брому и йоду.

В настоящем описании термин «алкил» (в значении группы или части группы) относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, если не указано иное, содержащей указанное число атомов углерода. Например, С₃-С₁₀алкил означает прямую или разветвленную углеводородную цепь, содержащую по меньшей мере 3 и не более 10 атомов углерода. Примеры используемых алкилов включают, но не ограничены ими, метил (Ме), этил (Et), н-пропил и изопропил. Термин «н-алкил» относится к неразветвленной углеводородной цепи.

В настоящем описании термин «циклоалкил» относится к углеводородному кольцу, содержащему от 3 до 6 атомов углерода, не содержащему гетероатомов или сопряженных двойных связей. Примеры используемых циклоалкилов включают, но не ограничены ими, циклопропил и циклогексил.

В настоящем описании термин «алкенил» относится к прямой или разветвленной углеводородной цепи, содержащей указанное число атомов углерода, которая содержит одну или более двойных связей.

В настоящем описании, когда указано, что группа является «замещенной» другой группой или имеющей «одно или более замещений», следует понимать, что замещение может иметь место в любом положении в этой группе.

В настоящем описании термин «физиологически функциональное производное» относится к любому фармацевтически приемлемому производному соединения согласно настоящему изобретению, например его амиду, и включает любую фармацевтически приемлемую соль соединения формулы (I) и любой фармацевтически приемлемый сольват соединения формулы (I), который при введении млекопитающему, такому как человек, способен приводить (прямо или косвенно) к соединению формулы (I) или его активному метаболиту или остатку. Специалисту будет понятно, что соединения формулы (I) могут быть модифицированы, чтобы получить их физиологически функциональные производные в любой из функциональных групп в соединениях, и что соединения формулы (I) могут быть, таким образом, модифицированы в более чем одном положении.

В настоящем описании термин «фармацевтически приемлемый», используемый относительно ингредиента (активного ингредиента или эксципиента), который может быть включен в фармацевтическую композицию для введения пациенту, относится к ингредиенту, являющемуся приемлемым в отношении совместимости с любым другим ингредиентом, присутствующим в фармацевтической композиции, и в отношении отсутствия вреда для реципиента.

В настоящем описании термин «сольват» относится к комплексному соединению переменной стехиометрии, образованному растворенным веществом (в настоящем изобретении соединением формулы (I), его солью или физиологически функциональным производным) и растворителем. Такие растворители для целей настоящего изобретения не должны оказывать влияния на биологическую активность растворенного вещества. Используемый растворитель может быть фармацевтически приемлемым растворителем. Примеры подходящих фармацевтически приемлемых растворителей включают воду, этанол и уксусную кислоту. Примером растворителя, который может использоваться, является вода, в случае которой сольват может быть назван гидратом рассматриваемого растворенного вещества.

Следует понимать, что для фармацевтического использования «соль или сольват», упомянутые выше, будут фармацевтически приемлемой солью или сольватом. Однако другие соли или сольваты могут найти применение, например, для получения соединения формулы (I) или для получения его фармацевтически приемлемой соли или сольвата.

Фармацевтически приемлемые соли включают описанные Berge, Bighley and Monkhouse, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19. Подходящие фармацевтически приемлемые соли включают соли щелочного металла, образованные присоединением оснований щелочного металла, таких как гидроксиды щелочного металла. Примерами подходящих солей щелочного металла является соль натрия или соль калия. Другие подходящие фармацевтически приемлемые соли включают соли щелочноземельных металлов, такие как соль кальция или соль магния, соли аммония; или соли с органическими основаниями, такими как этаноламин, триэтаноламин, этилендиамин, триэтиламин, холин и меглумин; или соли с аминокислотами, такими как аргинин, лизин и гистидин.

Соединения формулы (I) имеют потенциальную терапевтическую полезность для лечения и облегчения симптомов многих заболеваний, связанных с метаболизмом липидов, включая дислипидемию или гиперлипопротеинемию, такую как диабетическая дислипидемия и смешанная дислипидемия, сердечную недостаточность, гиперхолестеринемию, сердечно-сосудистое заболевание, включая атеросклероз, артериосклероз и гипертриглицеридемию, сахарный диабет типа II, диабет типа I, резистентность к инсулину, гиперлипидемию, нервную анорексию, ожирение. Как таковые соединения могут также использоваться как терапевтические средства для лечения заболеваний коронарных артерий, тромбоза, стенокардии, хронической почечной недостаточности, периферического сосудистого заболевания и инсульта.

Кроме того, также предполагается, что рецепторы HM74 и HM74A вовлечены в воспаление. Воспаление обозначает группу сосудистых, клеточных и неврологических реакций на травму. Воспаление может быть охарактеризовано как движение воспалительных клеток, таких как моноциты, нейтрофилы и гранулоциты, в ткани. Это обычно ассоциируется со сниженной барьерной функцией эндотелия и отеком в ткани. Воспаление относительно заболевания обычно упоминается как хроническое воспаление и может длиться всю жизнь. Такое хроническое воспаление может проявляться непосредственно через симптомы заболевания. Цель противовоспалительной терапии состоит в том, чтобы уменьшить это хроническое воспаление и обеспечить физиологический процесс лечения и восстановления ткани.

Примеры воспалительных заболеваний или состояний, для которых соединения согласно настоящему изобретению могут демонстрировать пригодность, включают воспалительные заболевания или состояния сустава, особенно артрит (например, ревматоидный артрит, остеоартрит, отторжение суставного протеза), или желудочно-кишечного тракта (например, неспецифический язвенный колит, Болезнь Крона и другие воспалительные кишечные и желудочно-кишечные заболевания, гастрит и воспаления слизистой оболочки, возникающие в результате инфекции, энтеропатия, вызванная нестероидными противовоспалительными препаратами), легкого (например, респираторный дистресс-синдром взрослых, астма, муковисцидоз или хроническое обструктивное легочное заболевание), сердца (например, миокардит), нервной ткани (например, рассеянный склероз), поджелудочной железы (например, воспаление, связанное с сахарным диабетом и его осложнениями), почки (например, гломерулонефрит), кожи (например, дерматит, псориаз, экзема, крапивница, ожоговое повреждение), глаза (например, глаукома), а также пересаженных органов (например, отторжение) и заболевания многих органов (например, системная красная волчанка, сепсис) и воспалительное осложнение вирусных или бактериальных инфекций и воспалительных состояний, связанных с атеросклерозом и после гипоксических или ишемических инсультов (с реперфузией или без), например, в мозге или при ишемической болезни сердца.

В частности, соединения по изобретению полезны для лечения и профилактики воспаления, диабета и сердечно-сосудистых заболеваний или состояний, включая атеросклероз, артериосклероз, гипертриглицеридемию и смешанную дислипидемию.

Никотиновая кислота имеет значительный профиль побочных эффектов, возможно потому, что ее вводят в больших количествах (количества граммов в сутки). Самым общим побочным эффектом является прилив крови к коже. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения соединения могут проявлять уменьшенные побочные эффекты по сравнению с никотиновой кислотой. HM74A был идентифицирован как рецептор с высоким сродством к никотиновой кислоте, в то время как HM74 является рецептором с более низким сродством. Соединения согласно настоящему изобретению могут найти применение в качестве селективных агонистов или частичных агонистов HM74A; в этом случае они проявляют большее сродство к HM74A, чем к HM74.

Способность соединений формулы (I) к активизации HM74A можно показать, например, используя следующий фермент и цельноклеточные тесты in vitro:

Тестирование in vitro

Для переходных трансфекций клетки HEK293T (клетки HEK293, стабильно экспрессирующие большой T-антиген SV40) выдерживали в DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина. Клетки высевали в 90 мм культуральные чашки и выращивали до слияния на 60-80% (18-24 ч) до трансфекции. Человеческий HM74A (номер доступа GenBank AY148884) субклонировали в вектор экспрессии у млекопитающих (pcDNA3; Invitrogen) и трансфицировали с использованием реагента Lipofectamine. Для трансфекции 9 мкг ДНК смешивали с 30 мкл Lipofectamine в 0,6 мл Opti-MEM (Life Technologies Inc.) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего добавляли 1,6 мл Opti-MEM. Клетки подвергали воздействию смеси Lipofectamine/ДНК в течение 5 ч и добавляли 6 мл 20% (об./об.) эмбриональной телячьей сыворотки в DMEM. Клетки собирали через 48 ч после трансфекции. Обработку токсином коклюша выполняли дополнением в среду в количестве 50 нгмл^-1 за 16 ч. Все исследования переходной трансфекции включали ко-трансфекцию рецептора вместе с G_i/o G белком, G_o1α.

Для генерации стабильных линий клеток вышеупомянутый способ использовали для трансфекции клеток CHO-K1, высеянных в шестилуночные чашки и выращенных до 30% слияния. Эти клетки выдерживали в среде DMEM F-12 НАМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 2мМ глутамина. Через 48 ч после трансфекции среду дополняли 400 мкг/мл Geneticin (G418, Gibco) для отбора клеток, резистентных к антибиотику. Клональные линии клеток CHO-K1, стабильно экспрессирующие HM74A, подтверждали измерениями связывания [³⁵S]-GTPγS после добавления никотиновой кислоты.

Получение мембраны P2 - Фракции частиц Р2, содержащие плазматическую мембрану, получали из клеточных паст, замороженных при -80°C после сбора. Все процедуры выполняли при 4°C. Клубок клеток ресуспендировали в 1 мл 10 мМ Nhis-HCl и 0,1мМ ЭДТА, рН 7,5 (буфер A), и гомогенизацией в течение 20 с с Ultra Turrax, с последующим проходом (5 раз) через иглу калибра 25. Клеточный лизат центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут в микроцентрифуге для осаждения ядер и неповрежденных клеток, и фракции частиц P2 получали микроцентрифугированием при 16000 g в течение 30 мин. Фракции частиц P2 ресуспендировали в буфере A и сохраняли при -80°C до востребования.

Тесты связывания [ ³⁵ S]-GTPγS проводили при комнатной температуре в формате с 384 лунками, основываясь на способах, описанных ранее (Wieland, T. and Jakobs, K. H. (1994) Methods Enzymol. 237, 3-13). Кратко, стандарт или тестируемые соединения разбавляли и добавляли в планшет с 384 лунками в объеме 10 мкл. Мембраны (HM74A или HM74) разбавляли в тестовом буфере (20мМ HEPES, 100мМ NaCl, 10мМ MgCl₂, pH 7,4), дополненном сапонином (60 мкг/мл), шарики Leadseeker WGA (Amersham; 250 мкг/лунку) и 10 мкМ GDP, так чтобы в объеме 20 мкл, добавленном к каждой лунке, содержалось 5 мкг мембран. [³⁵S]-GTPγS (1170 Ci/ммоль, Amersham) разбавляли (1:1500) в тестовом буфере и 20 мкл добавляли в каждую лунку. После добавления меченого лиганда планшеты запечатывали, обрабатывали импульсами и инкубировали в течение 4 часов при комнатной температуре. В конце инкубационного периода планшеты считывали на аппарате Leadseeker (VIEWLUX PLUS; Perkin-Elmer), чтобы определить уровни специфического связывания.

Тестирование in vivo

Агонисты HM74A проверяли на самцах крыс (200-250 г) Spague-Dawley, которых держали голодными в течение по меньшей мере 12 часов до исследования. Соединения вводили внутривенно (5 мл/кг) или пероральным скармливанием (10 мл/кг). Пробы крови (0,3 мл забор из вены хвоста) брали до введения и в три момента времени после введения (время в пределах от 15 минут до 8 часов после введения). Каждую пробу крови помещали в пробирки с гепарином (Becton Dickinson Microtainer, PST LH) и центрифугировали (10000 g в течение 5 минут) для получения образца плазмы. Образцы плазмы анализировали в отношении уровней неэтерифицированных жирных кислот (NEFA) с использованием коммерчески доступного набора (Randox). Ингибирование плазменных уровней NEFA относительно уровней перед введением соединений использовалось как заместитель для активности агониста HM74A.

Чтобы определить, показали ли соединения HM74A реакцию прилива крови, связанную с никотиновой кислотой, их вводили анестезированным морским свинкам. Самцов морских свинок Dunkin Hartley (300-800 г) держали голодными в течение 12 часов до анестезии смесью кетамина гидрохлорида (Vetalar, 40 мг/кг внутримышечно), ксилазина (Rompun, 8 мг/кг внутримышечно) и натрия пентобарбитона (Sagatal, 30 мг/кг внутрибрюшинно). После анестезии проводили трахеотомию и животных механически вентилировали комнатным воздухом (10-12 мл/кг, 60 вдохов/минуту). Яремную вену и сонную артерию канюлировали для внутривенного введения тестируемого соединения и отбора крови соответственно. Инфракрасный температурный зонд (Extech Instruments) помещали на 3-5 мм от края левого уха. Температуру регистрировали каждую минуту, начиная с 5 минут до введения тестируемого соединения и до 40 минут после введения тестируемого соединения. Данные автоматически собирали на компьютере Psion и затем переводили для анализа данных в крупноформатную таблицу Excel. До и в частые моменты времени после введения соединения пробы крови (0,3 мл) отбирали через каротидную артериальную канюлю и помещали в пробирки Microtainer (BD), содержащие гепарин-литий. Образцы тщательно перемешивали на барабанной мешалке для крови и затем сохраняли на льду до центрифугирования при 1200 г в течение 5 минут.

Никотиновая кислота (10 мг/кг внутривенно) приводит в среднем (± среднее стандартное отклонение) к повышению ушного температурного эквивалента до 10,42 + 1,44 (область под кривой; произвольные единицы; n=6). Для сравнения, соединение примера 30 (10 мг/кг внутривенно) приводит в среднем (± среднее стандартное отклонение) к повышению ушного температурного эквивалента до 1,52 + 0,39 (область под кривой; произвольные единицы; n=6), сокращение 85%.

Соединения согласно формуле (I) синтезировали (см. далее примеры синтеза) и проверяли в одном или более тестов, обсужденных выше. Все проиллюстрированные в примерах соединения имеют pEC₅₀ 4,9 (+/- 0,3 лог. единиц) или более и эффективность 30% или более. Некоторые конкретные соединения иллюстрируются ниже.

Общие способы очистки и анализа

Масс-спектры (МС) регистрировали на масс-спектрометре Fisons VG Platform с использованием способов положительной ионизации электрораспылением [(ES+ve с получением молекулярных ионов MH⁺ и М(NH₄)⁺] или отрицательной ионизации электрораспылением [(ES-ve с получением молекулярного иона (М-Н)^-].

Спектры ¹Н ЯМР регистрировали, используя спектрометр Bruker DPX 400 МГц, используя тетраметилсилан в качестве внешнего стандарта.

Хроматография Biotage^TM относится к очистке, выполняемой с использованием оборудования, выпускаемого Dyax Corporation (Flash 40i или Flash 150i), и картриджей, заполненных KPSil.

Масс-направленная автопрепаративная хроматография относится к способам, где материал очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке HPLCABZ+ 5 мкм (5 см × 10 мм i.d.) с 0,1% HCO₂H в воде и 95% MeCN, 5% воды (0,5% HCO₂H) с использованием следующих условий градиентного элюирования: 0-1,0 минута 5% B, 1,0-8,0 минут 5→30% B, 8,0-8,9 минут 30% B, 8,9-9,0 минут 30→95% B, 9,0-9,9 минут 95% B, 9,9-10 минут 95→0% B при скорости потока 8 мл.мин^-1 (система 2). Коллектор фракций Gilson 202 приводили в действие масс-спектрометром VG Platform при обнаружении заданной массы.

Препаративная ВЭЖХ относится к способам, в которых материал очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке HPLCABZ+ 5 мкм (10 см × 21,2 мм i.d.) с 0,1% HCO₂H в воде (A) и MeCN (0,5% HCO₂H) (B), используя настройки условий градиентного элюирования, выраженные как градиент «от x до y» со следующей системой градиента: 0-1,45 минут x% B, 1,45-20 минут x→y% B, 20-24 минуты y→95% B, 24-30 минут 95% B, 32-34 минуты 95→x% B при скорости потока 8 мл.мин^-1. Коллектор фракций Gilson 233 приводили в действие УФ (254 нм).

SPE (твердофазная экстракция) относится к использованию картриджей, выпускаемых International Sorbent Technology Ltd.

Strata Phenyl SPE относится к использованию картриджей, выпускаемых Phenomenex. Соединение загружали в картридж, предварительно обработанный MeCN и уравновешенный 5% MeCN в воде. Соединение элюировали 0,1% HCO₂H в воде и MeCN (0,5% HCO₂H) в подходящем градиенте на Combiflash Optix 10.

Как указано выше, соединения формулы (I) могут найти применение в медицине или ветеринарии, в частности, в качестве активаторов HM74A, для контроля дислипидемии и гиперлипопротеинемии.

Таким образом, следующий объект настоящего изобретения относится к соединению формулы (I) или его физиологически функциональному производному для применения в медицине или ветеринарии, особенно для лечения нарушений, связанных с метаболизмом липидов, включая дислипидемию или гиперлипопротеинемию, такую как диабетическая дислипидемия и смешанная дислипидемия, сердечную недостаточность, гиперхолестеринемию, сердечно-сосудистое заболевание, включая атеросклероз, артериосклероз и гипертриглицеридемию, сахарный диабет типа II, диабет типа I, резистентность к инсулину, гиперлипидемию, нервную анорексию, ожирение. Как таковые соединения также могут быть использованы для лечения заболевания коронарных артерий, тромбоза, стенокардии, хронической почечной недостаточности, периферического сосудистого заболевания и инсульта.

Следующий объект настоящего изобретения относится к соединению формулы (I) или его физиологически функциональному производному для применения для получения лекарственного средства для лечения нарушений, связанных с метаболизмом липидов, включая дислипидемию или гиперлипопротеинемию, такую как диабетическая дислипидемия и смешанная дислипидемия, сердечной недостаточности, гиперхолестеринемии, сердечно-сосудистого заболевания, включая атеросклероз, артериосклероз и гипертриглицеридемию, сахарного диабета типа II, диабета типа I, резистентности к инсулину, гиперлипидемии, нервной анорексии, ожирения. Как таковые соединения также могут быть использованы для лечения заболевания коронарных артерий, тромбоза, стенокардии, хронической почечной недостаточности, периферического сосудистого заболевания и инсульта.

Следует понимать, что указания на лечение распространяются также на профилактику, профилактику рецидива и подавление симптомов, а также лечение установленных состояний.

Согласно другому аспекту изобретение относится к применению соединения формулы (II)

и его физиологически функционального производного, в которой:

R¹ выбирают из водорода и C_1-4 алкила, который может быть необязательно замещен одной или более группами, выбранными из CN и CF₃;

R² выбирают из незамещенного C_2-10 алкила, C_1-10 алкила, замещенного одной или более группами, выбранными из фтора и CN, C₅ алкенила, неразветвленного C₄ алкенила и C_1-4 алкила, замещенного циклоалкилом;

и R³ выбирают из галогена и CN;

для получения лекарственного средства для лечения нарушений, связанных с метаболизмом липидов, включая дислипидемию или гиперлипопротеинемию. В частности, изобретение относится к применению соединения формулы (II) для получения лекарственного средства для лечения диабетической дислипидемии или смешанной дислипидемии, сердечной недостаточности, гиперхолестеринемии, сахарного диабета типа II, диабета типа I, резистентности к инсулину, гиперлипидемии, нервной анорексии, ожирения, заболевания коронарных артерий, тромбоза, стенокардии, хронической почечной недостаточности, инсульта и сердечно-сосудистого заболевания, включая атеросклероз, артериосклероз и гипертриглицеридемию.

В одном варианте осуществления изобретение относится к соединению формулы (II) для применения для лечения нарушений, связанных с метаболизмом липидов, включая дислипидемию или гиперлипопротеинемию. В частности, изобретение относится к применению соединения формулы (II) для получения лекарственного средства для лечения диабетической дислипидемии или смешанной дислипидемии, сердечной недостаточности, гиперхолестеринемии, сахарного диабета типа II, диабета типа I, резистентности к инсулину, гиперлипидемии, нервной анорексии, ожирения, заболевания коронарных артерий, тромбоза, стенокардии, хронической почечной недостаточности, инсульта и сердечно-сосудистого заболевания, включая атеросклероз, артериосклероз и гипертриглицеридемию.

В частных вариантах осуществления R¹ выбирают из водорода, C_1-4 алкила, CH₂CN и (CH₂)₃CF₃. В более частных вариантах осуществления R¹ выбирают из водорода и метила.

В определенных вариантах осуществления R² выбирают из незамещенного C_3-10 алкила, C_1-10 алкила, замещенного одной или более группами, выбранными из фтора и CN, C₅ алкенила, неразветвленного C₄ алкенила и C_1-4 алкила, замещенного циклоалкилом. В частности, R² выбирают из незамещенного C_3-10 алкила, C_1-6 алкила, замещенного одним или более CN, C_1-10 алкила, замещенного одним или более фтором, C₅ алкенила, неразветвленного C₄ алкенила и С_1-4 алкила, замещенного циклоалкилом. Более предпочтительно R² выбирают из незамещенного C_3-10 алкила; (CH₂)_1-5CN; C_2-5 алкила, замещенного одним или более фтором; C₅ алкенила; и С_1-4 алкила, замещенного циклоалкилом. Наиболее предпочтительно R² выбирают из незамещенного C_4-6 н-алкила, например пентила; (CH₂)_1-3CN, например (CH₂)CN или (CH₂)₃CN; C_3-4 алкила, замещенного одним или более фтором, в частности, где концевой атом углерода полностью насыщен фтором, например (CH₂)_2-3CF₃; и C₅ алкенила, в частности, где имеется только одна двойная связь, например где двойная связь расположена между четвертым и пятым атомами углерода (терминальный алкенил).

В особых вариантах осуществления R³ обозначает галоген. Более предпочтительно R³ выбирают из хлора и брома. Наиболее предпочтительно R³ обозначает хлор.

Конкретные соединения для использования для лечения или для получения лекарственного средства для лечения заболеваний метаболизма липидов, включая дислипидемию или гиперлипопротеинемию, включают:

(8-хлор-2,6-диоксо-1,2,6,7-тетрагидро-3H-пурин-3-ил)ацетонитрил,

3-бутил-8-хлор-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-1-метил-3-пентил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(4,4,4-трифторбутил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-бром-1-метил-3-пентил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(3,3,3-трифторпропил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-1-пропил-3-(2,2,2-трифторэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

3-бутил-8-хлор-1-метил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

(3-бутил-8-хлор-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1H-пурин-1-ил)ацетонитрил,

8-хлор-3-(2-циклопропилэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-1,3-бис(4,4,4-трифторбутил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

4-(8-хлор-1-метил-2,6-диоксо-1,2,6,7-тетрагидро-3H-пурин-3-ил)бутаннитрил,

8-хлор-1-этил-3-(2,2,2-трифторэтил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

1-метил-2,6-диоксо-3-пентил-2,3,6,7-тетрагидро-1H-пурин-8-карбонитрил,

8-хлор-3-пропил-1-метил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-(3-метилбутил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-пентил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-пропил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

3-бутил-1-метил-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1H-пурин-8-карбонитрил,

8-хлор-3-(4-пентен-1-ил)-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

8-хлор-3-гексил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

4-(8-хлор-2,6-диоксо-1,2,6,7-тетрагидро-3H-пурин-3-ил)бутаннитрил,

8-хлор-3-гексил-1-метил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

3-бутил-8-хлор-1-этил-3,7-дигидро-1H-пурин-2,6-дион,

[8-хлор-3-(2-циклопропилэтил)-2,6-диоксо-2,3,6,7-тетрагидро-1H-пурин-1-ил]ацетонитрил,

(8-хлор-2,6-диоксо-3-пропил-2,3,6,7-тетрагидро-1H-пурин-1-ил)ацетонитрил,

8-хлор-1-(4,4,4-трифторбутил)-3-(2,2,2-трифторэти