Новые флуоресцентные белки из entacmaea quadricolor и способ их получения

Новые флуоресцентные белки из entacmaea quadricolor и способ их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылки на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США, серийный номер 60/761807, поданной 25 января 2006 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Область изобретения

Настоящее изобретение относится, в основном, к области биологии и химии. В частности, изобретение направлено на флуоресцентные белки.

Уровень техники

Флуоресцентные белки, включая зеленый флуоресцентный белок (Green Fluorescent Protein, GFP), его мутанты и гомологи, сегодня широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров in vivo в биомедицинских исследованиях, что детально рассмотрено Lippincott-Schwartz и Patterson в Science (2003) 300(5616): 87-91.

Флуоресцентные белки - это белки, которые способны к флуоресценции при облучении светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.

GFP гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A. victoria) был описан Johnson et al. в J Cell Comp Physiol. (1962), 60: 85-104, как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет. кДНК, кодирующая A. victoria GFP, была клонирована Prasher et al. (Gene (1992), 111(2): 229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP самостоятельно образовывать хромофор (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805). Эти сведения открывают широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологии в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.

GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805, and Heim et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504), как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaether and Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).

Были проведены многочисленные исследования для улучшения свойств GFP и для получения GFP-реактивов, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Были разработаны новые версии GFP, такие как ДНК "гуманизированного" GFP, белковый продукт которого имеет повышенный синтез в клетках млекопитающих (Haas, et al., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Один такой гуманизированный белок, мутантный вариант GFP, представляет собой "усиленный зеленый флуоресцирующий белок" (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664). Другие мутанты являются синими, циановыми и желто-зелеными спектральными вариантами GFP.

Однако, несмотря на широкое использование GFP, другие флуоресцентные белки со свойствами, сходными или отличными от GFP, были бы полезны в данной области, в частности, белки с новыми спектрами или большей интенсивностью флуоресценции. В 1999 г., гомологи GFP были клонированы из не биолюминесцентных видов Anthozoa (Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). Это открытие продемонстрировало, что эти белки не являются обязательно компонентом биолюминесцентной системы. GFP-подобные белки из Anthozoa обладали большим спектральным разнообразием, включая циановые, зеленые, желтые, красные флуоресцентные белки и фиолетово-синие нефлуоресцирующие хромопротеины (CP) (Matz et al., Bioessays (2002), 24(10): 953-959). В дальнейшем кДНК GFP-подобных белков были клонированы из ряда гидроидных медуз и из копепод (Shagin et al., Mol Biol Evol. (2004), 21(5): 841-850). Сегодня GFP-подобные белки включают более 120 флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее чем 25% идентичности по аминокислотной последовательности.

Кристаллическая структура GFP дикого типа и GFP S65T мутанта была разрешена и проявила, что третичная структура GFP представляет собой бочонок (Ormo et al., 1996, Science 273: 1392-1395; Yang, et al., 1996, Nature Biotech 14: 1246-1251). Этот бочонок состоит из бета-слоев, образующих компактную встречно-параллельную структуру, внутри которой располагается альфа-спираль, содержащая хромофор. Было подтверждено сделанное ранее предположение (Cody et al., Biochemistry (1993) 32, 1212-1218), что хромофор формируется путем окислительной циклизации трех консервативных аминокислотных остатков. Все протестированные GFP-подобные белки имеют такую же бета-бочку, как GFP (Ormo et al. Science (1996) 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Struct Biol (2000), 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Natl Acad Sci USA (2001) 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb) (2003), 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem (2003), 278: 44626-44631; Wilmann et al. J Biol Chem (2005), 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry (2005), 44, 202-212; Quillin et al. Biochemistry (2005), 44: 5774-5787).

Полезность флуоресцентных белков как инструмента молекулярной биологии делает востребованным поиск других флуоресцентных белков, с другими или улучшенными свойствами по сравнению с известными флуоресцентными белками. Таким образом, востребовано получение новых флуоресцентных белков, которые проявляют свойства, недоступные у известных флуоресцентных белков, а также кодирующих их ДНК.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих новый флуоресцентный белок из Entacmaea quadricolor (EqFP578) и его функциональные мутанты, то есть EqFP578-подобные белки. В некоторых воплощениях указанная нуклеиновая кислота может быть выделена из Entacmaea quadricolor. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота по настоящему изобретению получена методами генной инженерии.

В некоторых воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют флуоресцентный белок дикого типа из Entacmaea quadricolor как в SEQ ID NO: 02 (EqFP578). Пример нуклеотидной последовательности показан в SEQ ID NO: 01.

В некоторых воплощениях обеспечивается выделенная нуклеиновая кислота, которая имеет последовательность, специфически гибридизующуюся с определенной частью или с целой комплементарной цепью SEQ ID NO: 01.

В некоторых воплощениях нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют флуоресцентный белок, который содержит аминокислотную последовательность, которая по существу сходна или идентична последовательности белка EqFP578 (SEQ ID NO: 02). Соответственно, выделенные нуклеотидные последовательности, кодирующие природные аллельные варианты SEQ ID NO: 01, также входят в рамки настоящего изобретения.

В некоторых воплощениях указанные нуклеиновые кислоты кодируют функциональные мутанты EqFP578, которые имеют по существу сходные или измененные биохимические или спектральные характеристики по сравнению с EqFP578 дикого типа.

В некоторых воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют мутантные белки, которые содержат аминокислотную последовательность, по существу такую же, как последовательность EqFP578 (SEQ ID NO: 02), и отличаются от EqFP578 (SEQ ID NO: 02) по крайней мере одной аминокислотной заменой.

В предпочтительных воплощениях указанная аминокислотная замена выбрана из группы, состоящей из R32G и S131P; указанный мутантный флуоресцентный белок имеет улучшенный фолдинг при 37°C по сравнению с EqFP578. В предпочтительных воплощениях указанный мутант содержит обе эти замены.

В предпочтительных воплощениях указанный мутант также содержит другие фолдинговые мутации, например, выбранные из группы, состоящей из E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, I93V, F110L, N112D, I115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H171I, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R и R231K. Эти мутации улучшают фолдинг белка и скорость созревания хромофора, приводя к более быстрому образованию флуоресцентного сигнала in vivo.

В других предпочтительных воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют полученный с помощью методов генной инженерии флуоресцентный белок, имеющий модифицированную N- и/или C-концевую часть вне хромофорного домена EqFP578, где указанный белок проявляет уменьшенную способность к агрегации по сравнению с EqFP578 дикого типа. В предпочтительных воплощениях модифицированный N-конец содержит замену K6T, и C-концевой - замену R231S. В некоторых воплощениях модифицированный N-конец также содержит дополнительную аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из MGEY и MGED.

В некоторых воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют полученный с помощью методов генной инженерии функциональный флуоресцентный белок, который содержит по крайней мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из R155E, Q159D, S173N, F192V, F194Y, где указанный функциональный флуоресцентный белок имеет уменьшенную способность к олигомеризации по сравнению с EqFP578 дикого типа. В предпочтительных воплощениях указанный функциональный флуоресцентный белок также содержит замену N122R, которая еще сильнее уменьшает склонность белка к олигомеризации. В предпочтительных воплощениях указанный функциональный флуоресцентный белок содержит все указанные замены и также содержит одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, I93V, F110L, N112D, I115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H171I, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R и R231K, где эти замены улучшают сворачиваемость (фолдинг) белка и повышают интенсивность флуоресценции in vivo.

В некоторых воплощениях выделенные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют полученный с помощью методов генной инженерии функциональный флуоресцентный белок, который содержит по крайней мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из H197R, S158G, N143S, N143H, N143F и N143Y, где указанный функциональный флуоресцентный белок имеет измененные спектры испускания и возбуждения флуоресценции, чем соответствующий белок дикого типа.

Примеры молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, которые кодируют полученные с помощью методов генной инженерии функциональные мутанты EqFP578, включают SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15 или кодируют SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16.

Молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода или гибридизуются с ними, также входят в рамки настоящего изобретения.

В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Кроме того, также обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты по настоящему изобретению.

В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные белки по настоящему изобретению, которые кодируются нуклеиновыми кислотами указанными выше.

В некоторых воплощениях функциональные флуоресцентные белки по настоящему изобретению включают аминокислотную последовательность, которая по существу такая же или идентичная последовательности флуоресцентного белка дикого типа из Entacmaea quadricolor, имеющего SEQ ID NO: 02 (EqFP578). Белки, представляющие интерес, включают EqFP578 дикого типа и его мутанты, которые имеют по существу сходные или измененные биохимические и/или спектральные свойства по сравнению с EqFP578 дикого типа.

В предпочтительных воплощениях указанная аминокислотная замена выбрана из группы, состоящей из R32G и S131P; указанный мутантный флуоресцентный белок имеет улучшенный фолдинг при 37°C по сравнению с EqFP578. В предпочтительных воплощениях указанный мутант содержит обе эти замены.

В предпочтительных воплощениях указанный мутант также содержит другие фолдинговые мутации, например, выбранные из группы, состоящей из E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, I93V, F110L, N112D, I115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H171I, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R и R231K. Эти мутации улучшают сворачиваемость (фолдинг) белка и скорость созревания хромофора, приводя к более быстрому образованию флуоресцентного сигнала in vivo.

В других предпочтительных воплощениях полученный с помощью методов генной инженерии флуоресцентный белок имеет модифицированную N- и/или C-концевую часть вне хромофорного домена EqFP578, при этом указанный белок проявляет уменьшенную способность к агрегации по сравнению с EqFP578 дикого типа. В предпочтительных воплощениях модифицированный N-конец содержит замену K6T, и C-концевой - замену R231S. В некоторых воплощениях модифицированный N-конец также содержит дополнительную аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из MGEY и MGED (SEQ ID NO: 17 и 18, соответственно).

В некоторых воплощениях полученный с помощью методов генной инженерии функциональный флуоресцентный белок по настоящему изобретению содержит по крайней мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из R155E, Q159D, S173N и F192V, при этом указанный функциональный флуоресцентный белок имеет уменьшенную способность к олигомеризации по сравнению с EqFP578 дикого типа. В предпочтительных воплощениях указанный функциональный флуоресцентный белок также содержит замену N122R, которая еще сильнее уменьшает склонность белка к олигомеризации. В предпочтительных воплощениях указанный функциональный флуоресцентный белок содержит все указанные замены и также содержит одну или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из E36G, K42R, F53V, K67R, T68A, L79F, I93V, F110L, N112D, I115L, R138L, G152S, H157R, Y169H, H171I, C172A, F174L, K188R, H193Y, M216V, K220R и R231K, где эти замены улучшают сворачиваемость (фолдинг) белка и повышают интенсивность флуоресценции in vivo.

В некоторых воплощениях полученный с помощью методов генной инженерии функциональный флуоресцентный белок по настоящему изобретению содержит по крайней мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из H197R, S158G, N143S, N143H, N143F и N143Y, при этом указанный функциональный флуоресцентный белок имеет измененные спектры испускания и возбуждения флуоресценции, чем соответствующий белок дикого типа.

Примеры флуоресцентных белков, представляющих интерес, включают SEQ ID NO: 02, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16.

Кроме того, обеспечиваются набор, содержащий нуклеиновые кислоты или векторы или экспрессионные кассеты, включающие указанные нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению.

Кроме того, обеспечиваются антитела, специфически связывающие белки по настоящему изобретению или их фрагменты.

Краткое описание фигур

Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие в равной степени эффективные воплощения.

Фиг.1 показывает множественное выравнивание EqFP578 дикого типа и его мутантов.

Фиг.2 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции EqFP578 дикого типа.

Фиг.3 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции мутанта EqFP578m1.

Фиг.4 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции мутанта M1-602.

Фиг.5 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции мутанта M1-637.

Фиг.6 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции мутанта M1-mono1.

Фиг.7 иллюстрирует спектры возбуждения (линия 1) и испускания (линия 2) флуоресценции мутанта nrM181-5 (до фотоконверсии).

Подробное описание изобретения

Если подвести итог вышеуказанному, настоящее изобретение направлено на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют флуоресцентный белок EqFP578 из Entacmaea quadricolor и его мутанты, а также на белки, кодируемые этими нуклеиновыми кислотами. Молекулы нуклеиновых кислот, представляющие интерес, выделены из Entacmaea quadricolor или получены методами генной инженерии. Белки, представляющие интерес, включают флуоресцентные белки, имеющие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16. Также представляют интерес белки, сходные по существу, или мутанты к указанным белкам. Также обеспечиваются клетки-хозяева, стабильные клеточные линии и трансгенные организмы, содержащие указанные молекулы нуклеиновых кислот. Кроме того, обеспечиваются антитела, специфичные к белкам по настоящему изобретению.

Указанные белковые и нуклеотидные композиции применяются во многих различных приложениях и методах, в частности, в приложениях мечения клеток, клеточных органелл или белков. Также указанные белковые и нуклеотидные композиции применяются в методах тестирования активности промоторов в различных условиях. Наконец, обеспечиваются наборы для их использования в таких методах и приложениях.

Определения

Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам по настоящему изобретению, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.

Как здесь используется, термин "флуоресцентный белок" означает белок, который обладает способностью к флуоресценции; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство этих белков представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора, образующегося путем автокаталитической циклизации двух или более аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Как таковые флуоресцентные белки по настоящему изобретению не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин.

Как здесь используется, термин "GFP" относится к зеленому флуоресцентному белку из Aequorea victoria, включая варианты GFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей флюоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа GFP была раскрыта в Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33).

Как здесь используется, термин "EGFP" относится к мутантному варианту GFP, имеющему две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., 1995, Nature 373: 663-664).

Термин "гуманизированный" относится к изменению нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка, сделанной для оптимизации генетического кода кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих (Yang et al., 1996, Nucleic Acids Research 24: 4592-4593).

Как здесь используется, термин “EqFP578” относится к нуклеиновой кислоте и флуоресцентному белку дикого типа из Entacmaea quadricolor, который имеет нуклеотидную и аминокислотную последовательность, показанные в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно.

Как здесь используется, термин "выделенный" означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.

Как здесь используется, термин "мутант" или "производное" относятся к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены, и/или удалены (делетированы), и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков по настоящему изобретению. Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.

Как здесь используется, "гомология" - это термин, использующийся для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.

Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности “по существу сходны” или “по существу такие же”, как референсная последовательность, если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют по крайней мере 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранной для сравнения области. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности, по крайней мере, 95% идентичности или, по крайней мере, 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, также по существу сходны. Для целей настоящего изобретения длина сравниваемых последовательностей флуоресцентных белков будет в основном, по крайней мере, 160 аминокислот; предпочтительно, по крайней мере, 200 аминокислот. Для нуклеиновых кислот длина сравниваемых последовательностей будет в основном, по крайней мере, 480 нуклеотидов; предпочтительно, по крайней мере, 600 нуклеотидов.

Идентичность последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp. 403-10 (1990). Для целей настоящего изобретения сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами, может быть использовано для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями.

Как здесь используется, термин "подобные флуоресцентные белки" относится к флуоресцентным белкам, которые имеют по существу сходную аминокислотную последовательность при сравнении с референсным флуоресцентным белком. В основном, подобный флуоресцентный белок при сравнении с последовательностью референсного флуоресцентного белка имеет продолжительную последовательность длиной, по крайней мере, 160 аминокислот, которая обладает, по крайней мере, 85% идентичностью с референсным флуоресцентным белком.

Как здесь используется, термин "EqFP578-подобный белок" относится к EqFP578 дикого типа с SEQ ID NO: 2 и его функциональным мутантам, например тем, которые имеют аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16. Как здесь используется, термин "EqFP578-подобная нуклеиновая кислота" относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует EqFP578-подобный белок (например, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15). Как здесь используется, EqFP578-подобный белок содержит аминокислотную последовательность, которая по существу сходна или идентична последовательности EqFP578 (SEQ ID NO: 02). Термин "EqFP578-подобный белок" и "EqFP578-подобная нуклеиновая кислота" также относится к укороченным и удлиненным вариантам EqFP578 или его мутантов и кодирующим их нуклеиновым кислотам.

Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "функциональный", используемый для описания флуоресцентных белков, означает, что белок имеет пригодные для использования спектры возбуждения и испускания флуоресценции (то есть обладает детектируемой флуоресценцией).

Как здесь используется, "биохимические свойства" относятся к белковому фолдингу (сворачиванию) и скорости созревания, времени полужизни, способности к агрегации, способности к олигомеризации, pH и температурной стабильности, и другим подобным свойствам.

Как здесь используется, "флуоресцентные свойства" или “спектральные свойства" относятся к коэффициенту молярной экстинкции при подходящей длине волны, к квантовому выходу флуоресценции, форме спектра возбуждения флуоресценции или спектра испускания, длине волны, соответствующей максимуму возбуждения флуоресценции, и длине волны, соответствующей максимуму испускания, отношению амплитуды возбуждения флуоресценции при двух разных длинах волн, отношению амплитуды испускания при двух разных длинах волн, времени жизни возбужденного состояния и анизотропии оптических свойств. Измеряемая разница в любом из этих свойств между EqFP578 дикого типа и его мутантами применима. Измеряемая разница может быть определена как количество любого количественного флуоресцентного свойства, например, интенсивность флуоресценции при определенной длине волны или интегральная флуоресценция на всем спектре испускания.

Как здесь используется, "скорость созревания" относится к скорости формирования зрелого флуоресцентного белка (то есть флуоресцентного белка, способного продуцировать флуоресценцию) после трансляции. Скорость созревания можно охарактеризовать полупериодом созревания. Было показано, что созревание флуоресцентного белка включает две стадии: (i) фолдинг белка, что означает формирование белковых бета-слоев с центральной альфа-спиралью, содержащей аминокислоты, которые будут формировать хромофор. Эта стадия обычно характеризуется константой скорости примерно 10^(-2)s^(-1) или полупериодом от нескольких секунд до десятков секунд; (ii) созревание хромофора, когда белковая цепь подвергается циклизации и дегидратации. Эта стадия обычно характеризуется константой скорости примерно 10^(-4)s^(-1) или полупериодом длиной в несколько минут. Таким образом, эта более медленная стадия является лимитирующей в созревании зеленого флуоресцентного белка (Reid BG, Flynn GC. Biochemistry. 1997 V. 36(22), PP. 6786-6791).

Как здесь используется, "агрегация" относится к склонности или способности экспрессированного белка формировать нерастворимый осадок (агрегаты). "Агрегацию" следует отличать от "олигомеризации". В частности, мутанты с уменьшенной способностью к агрегации, например, с увеличенной растворимостью, не обязательно имеют уменьшенную способность к олигомеризации (т.е. превращают тетрамеры в димеры или мономеры или димеры в мономеры).

Как здесь используется, "олигомеризация" относится к склонности или способности экпрессированного белка формировать комплексы (олигомеры) в результате специфического взаимодействия двух или более полипептидов. Указанное специфическое взаимодействие наблюдается в специальных условиях, например, в физиологических условиях, и относительно стабильно в этих условиях. Ссылка на "способность" белков олигомеризоваться означает, что белки могут формировать димеры, тримеры, тетрамеры или подобные комплексы в специальных условиях. Как правило, флуоресцентные белки обладают способностью к олигомеризации в физиологических условиях, хотя, как здесь описано, флуоресцентные белки могут также олигомеризоваться при других, например, pH, нежели pH при физиологических условиях. Условия, при которых флуоресцентные белки формируют олигомеры или проявляют склонность к олигомеризации, могут быть определены с помощью хорошо известных методов, таких как гель-фильтрация, или иным способом известным в данной области.

Термин "функционально связанный" или ему подобный при описании слитых белков относится к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов. Например, флуоресцентный белок по настоящему изобретению может быть слит с представляющим интерес партнером слияния. В этом случае слитый белок сохраняет флуоресцентные свойства этого флуоресцентного белка, а представляющий интерес полипептид сохраняет его первоначальную биологическую активность. В некоторых воплощениях настоящего изобретения активность как флуоресцентного белка, так и белка, представляющего интерес, может быть снижена по сравнению с активностями изолированных белков. Такие слитые белки также находят применение в рамках настоящего изобретения.

Как здесь используется, термин "специфически гибридизуется" относится к ассоциации между двумя одноцепочечными молекулами нуклеиновых кислот или в достаточной степени комплементарными последовательностями, что разрешает такую гибридизацию в предопределенных условиях, обычно использующимися в данной области (иногда используется термин "по существу комплементарный").

Ссылка на нуклеотидную последовательность "кодирующую" полипептид означает, что с нуклеотидной последовательностью в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин также включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.

Как здесь используется, нумерация аминокислотных остатков и замен соответствует нумерации аминокислотных остатков в последовательности EqFP578 дикого типа (SEQ ID NO: 2). Для мутантных белков позиция аминокислотного остатка или замены может быть определена с помощью белкового выравнивания (фиг.1).

Молекулы нуклеиновых кислот

Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный белок EqFP578, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и его мутанты. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие укороченные или удлиненные варианты EqFP578 и его мутантов, также находятся в рамках настоящего изобретения.

Специфические молекулы нуклеиновой кислоты, представляющие интерес, включают молекулы, кодирующие следующие флуоресцентные белки: красный флуоресцентный белок из Entacmaea quadricolor, имеющий последовательность SEQ ID NО: 2; и его мутанты с оптимизированными свойствами: фолдинг при 37°C, уменьшенная способность к агрегации и/или олигомеризации, и измененные спектральные характеристики. Аминокислотные последовательности этих мутантов показаны в SEQ ID NО: 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16. Примеры специфических мутантных нуклеиновых кислот по настоящему изобретению показаны в SEQ ID NО: 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15.

Каждый из этих специфических типов молекул нуклеиновой кислоты, представляющей интерес, раскрывается более детально ниже в экспериментальной части.

Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу ДНК, такую как геномная ДНК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. Как здесь используется, термин “кДНК” относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают размещением элементов последовательности, найденным в нативных зрелых видах мРНК, где элементы последовательности представляют собой экзоны и 5' и 3' некодирующие области.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный белок, могут быть синтезированы из подходящих нуклеозидтрифосфатов или выделены из биологических источников. Оба метода основаны на хорошо известных в данной области протоколах. Например, доступность информации о последовательности аминокислот (например, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16) или информации о нуклеотидной последовательности (например, SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 15) дает возможность получить выделенные молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению с помощью олигонуклеотидного синтеза. В случае информации о последовательности аминокислот несколько нуклеиновых кислот, отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода, может быть синтезировано. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области.

Синтетические олигонуклеотиды могут быть получены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкции могут быть очищены с помощью методов, хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или других методов, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК по настоящему изобретению могут быть синтезированы за следующие стадии: несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы, способные к когезии с соседним фрагментом, могут быть. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентные белки по настоящему изобретению, могут быть также клонированы из биологических источников из типа Cnidaria, предпочтительно из класса Anthozoa, более предпочтительно из подкласса Zoantharia, более предпочтительно из отряда Actiniaria и даже более предпочтительно из семейства Actiniidae, например, из Entacmaea quadricolor.

В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению представляет собой ДНК (или кДНК) молекулу, содержащую открытую рамку считывания, которая кодирует флуоресцентный белок из Entacmaea quadricolor по настоящему изобретению и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессирования флуоресцентного белка согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих белки по настоящему изобретению. Указанные нуклеиновые кислоты находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например, они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах in vitro или в клетках или организмах, находящихся в среде, отличной от той, в которой они находятся в естественных условиях.

Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высокосходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей, таких как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторной области. Такие специальные замены могут быть произведены in vitro с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах-хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы "мутантами" или "производными" исходной последовательности.

Нуклеиновая кислота, кодирующая EqFP578-подобный полипептид, аминокислотная последовательность которого является мутантной, производной, вариантом или аллельным вариантом последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2, также обеспечивается настоящим изобретением. Нуклеиновая кислота, кодирующая такой полипептид, может иметь более чем 60% гомологии с кодирующей последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, более чем примерно 70% гомологии, более чем примерно 80% гомологии, более чем примерно 90% гомологии или более чем примерно 95% гомологии.

Нуклеиновая кислота, кодирующая такой полипептид или его фрагмент, может быть выделена любым из многих известных методов. Фрагмент кДНК по настоящему изобретению может использоваться как гибридизационный зонд против библиотеки кДНК из целевого организма в условиях высокой строгости. Зонд может быть большим фрагментом или одним или несколькими короткими вырожденными праймерами. Нуклеиновые кислоты, имеющие сходство последовательности, могут быть детектированы гибридизацией в условиях высокой строгости, например, при 50°С или выше (например, 60°С или 65°С), 50% формамид, 0,1×SSC (15 мM хлорид натрия/1,5 мM натрия цитрат), 0,1% SDS. Нуклеиновые кислоты, имеющие области по существу идентичные с референсной последовательностью, например, аллельные варианты, генетически-измененные варианты нуклеиновых кислот и т.д., связываются с референсной последовательностью в гибридизационных условиях высокой строгости. Используя зонды, в частности меченые зонды их ДНК последовательности, можно выделить подобные нукле