Хроматографический лиганд

Хроматографический лиганд

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым хроматографическим лигандам, которые применимы для очистки биомолекул, таких как протеины. Данные лиганды применимы, например, для очистки антител и предпочтительно иммобилизованы на пористой основе, такой как частицы или мембрана. Следовательно, данное изобретение также включает хроматографическую матрицу, содержащую новые лиганды, способ ее получения и набор для очистки антител.

Предшествующий уровень техники

Иммунная система состоит из многих взаимозависимых типов клеток, которые совместно защищают организм против бактериальных, паразитических, грибковых, вирусных инфекций и от роста опухолевых клеток. Стражами иммунной системы являются макрофаги, которые постоянно перемещаются в кровотоке хозяина. При инфицировании или иммунизации макрофаги реагируют, захватывая возбудителей, помеченных чужеродными молекулами, известными как антигены. Это событие, опосредованное хелперными Т-клетками, определяет сложную цепь ответов, которая приводит к стимуляции В-клеток. Эти В-клетки, в свою очередь, продуцируют белки, называемые антителами, которые связываются с чужеродным возбудителем. Это связывание между антителом и антигеном помечает чужеродного возбудителя с целью разрушения посредством фагоцитоза или активации системы комплемента. Существует несколько разных классов антител, также известных как иммуноглобулины, такие как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Они отличаются не только своей физиологической ролью, но также и своими структурами. Со структурной точки зрения были широко исследованы IgG-антитела, возможно из-за той главной роли, которую они играют в зрелом иммунном ответе. Поликлональные антитела продуцируются в соответствии со стандартными методами путем иммунизации животного подходящим антигеном. В ответ животное продуцирует антитела, которые являются поликлональными. Однако в силу многих причин желательно иметь единственный клон определенного антитела, известный как моноклональные антитела. Моноклональные антитела (mAbs) продуцируются гибридными или слитыми клетками, представляющими продукт слияния между нормальной В-клеткой, которая продуцирует только одно антитело, и аномальной миеломной опухолевой клеткой. Получаемый в результате гибрид, известный как гибридома, в настоящее время используется в стандартных методах получения антител.

Биологическую активность, которой обладают иммуноглобулины, в настоящее время используют во множестве разных применений в диагностике у человека и ветеринарной диагностике, медицинской помощи и терапевтическом секторе. Фактически в последние несколько лет моноклональные антитела и рекомбинантные конструкции антител стали самым большим классом белков, исследуемых в настоящее время в клинических испытаниях и получивших одобрение FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США) в качестве терапевтических и диагностических средств. В дополнение к системам экспрессии и стратегиям продуцирования требуются эффективные протоколы очистки для получения высокочистых антител простым и рентабельным способом.

Традиционные способы выделения иммуноглобулинов основаны на селективном обратимом осаждении белковой фракции, содержащей иммуноглобулины, в то время как другие группы белков остаются в растворе. Типичными осаждающими агентами являются этанол, полиэтиленгликоль, лиотропные соли, такие как сульфат аммония и фосфат калия, и каприловая кислота. Обычно подобные методы осаждения дают очень загрязненные продукты и в то же время являются длительными и трудоемкими. Кроме того, добавление осаждающего агента к неочищенному веществу осложняет использование супернатанта для других целей и создает проблему удаления отходов, которая становится особенно важной, когда речь идет о крупномасштабной очистке иммуноглобулинов.

Альтернативным способом выделения иммуноглобулинов является хроматография, которая включает в себя семейство близких методов разделения. Особенностью, отличающей хроматографию от большинства других физических и химических методов разделения, является то, что в контакт приводят две взаимно несмешивающиеся фазы, причем одна фаза является неподвижной, а другая - подвижной. Смесь образца, введенная в подвижную фазу, подвергается ряду взаимодействий с неподвижной и подвижной фазами, в то время как она перемещается по системе при помощи подвижной фазы. Взаимодействия основаны на различиях физических или химических свойств компонентов в образце. Эти различия определяют скорость перемещения отдельных компонентов под влиянием подвижной фазы, двигающейся через колонку, содержащую неподвижную фазу. Разделенные компоненты выходят в порядке возрастания взаимодействия с неподвижной фазой. Наименее задерживающийся компонент элюируется первым, наиболее сильно удерживаемое вещество элюируется последним. Разделение достигается, когда один компонент удерживается в степени, достаточной для того, чтобы предотвратить перекрывание с зоной соседнего растворенного вещества, когда компоненты пробы элюируются с колонки. Постоянно предпринимаются попытки создать оптимальную неподвижную фазу для каждой конкретной цели разделения. Такая неподвижная фаза обычно состоит из основы или основной матрицы, к которой присоединен лиганд, содержащий функциональные, то есть связывающие, группы. Каждый вид хроматографии обычно указывается на основании принципа взаимодействия, который она использует, например аффинная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и ионообменная хроматография.

Аффинная хроматография основана на специфических взаимодействиях между целевой биомолекулой и биоспецифическим лигандом с соответствии с принципом распознавания ключ-замок. Таким образом, мишень и лиганд составляют аффинную пару, такую как антиген/антитело, фермент/рецептор и т.д. Белковые аффинные лиганды хорошо известны, например аффинная хроматография с протеином А и протеином G, обе из которых являются широко распространенными способами выделения и очистки антител. Хорошо известно, что хроматография с протеином А обеспечивает исключительную селективность, особенно в отношении моноклональных антител и, следовательно, позволяет получить высокие степени чистоты. При использовании в комбинации с ионообменными, гидрофобными взаимодействиями, стадиями на гидроксиапатите и/или гель-фильтрации, способы, основанные на протеине А, стали предпочтительным способом очистки антител для многих биофармацевтических компаний, смотри, например, WO 8400773 и US 5151350. Однако из-за пептидных связей белков матрицы с протеином А обладают в некоторой степени чувствительностью к щелочам. Кроме того, когда матрицы с протеином А используют для очистки антител от клеточной культуральной среды, протезы, происходящие из этих клеток, могут вызывать расщепление протеина А или его пептидных фрагментов.

Ионообменная хроматография часто используется в протоколах выделения иммуноглобулинов. При ионообменной хроматографии отрицательно заряженные аминокислотные боковые цепи иммуноглобулина будут взаимодействовать с положительно заряженными лигандами хроматографической матрицы. При катионообменной хроматографии, с другой стороны, положительно заряженные аминокислотные боковые цепи иммуноглобулина взаимодействуют с отрицательно заряженными лигандами хроматографической матрицы.

Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) представляет собой еще один описанный способ и используется в протоколах выделения иммуноглобулинов. Если целью является иммуноглобулиновый продукт высокой чистоты, обычно рекомендуется сочетать HIC с одной или более дополнительными стадиями. При HIC, для того чтобы иммуноглобулин эффективно связывался с НIC-матрицей, требуется добавление лиотропных солей к подвижной фазе. Связанный гемоглобин затем высвобождается из матрицы при понижении концентрации лиотропной соли. Таким образом, недостатком этого метода является необходимость добавлять лиотропную соль к необработанному веществу, так как это может вызвать проблемы и, следовательно, увеличить стоимость для крупномасштабного потребителя. Например, для необработанных веществ, таких как сыворотка, плазма и яичный желток, добавление лиотропных солей к необработанным веществам во многих случаях будет недопустимо в крупномасштабных применениях, так как соль может препятствовать любому экономически реальному применению обедненного по иммуноглобулину необработанного вещества. Дополнительной проблемой в крупномасштабных применениях будет ликвидация нескольких тысяч литров отходов.

В US 5945520 (Burton et al.) описаны хроматографические смолы смешанного режима, которые имеют гидрофобную природу при рН связывания и гидрофильный и/или электростатический характер при рН десорбции. Такая смола специально создана, чтобы связываться с целевым соединением из водного раствора, как при низкой, так и при высокой ионной силе. Это достигается с помощью выбранных ионизируемых лигандов, содержащих спейсерное плечо и по меньшей мере одну ионизируемую функциональную группу, где плотность ионизуемых лигандов на твердой матрице - основе - больше, чем более низкая из либо приблизительно 150 мкмоль/мл смолы, или 1 ммоль/г сухой массы смолы. Кроме того, гидрофобный характер смолы, содержащей указанные ионизируемые лиганды, достаточен для того, чтобы связать по меньшей мере 50% целевого соединения в водной среде при высокой и низкой ионной силе при первом рН. Иллюстративными примерами ионизируемой функциональной группы являются 4-(аминометил)пиридин, 3-(аминометил)пиридин, 2-(аминометил)пиридин, 1-(3-аминопропил)имидазол, 2-(аминометил)бензимидазол, 4-(3-аминопропил)морфолин.

Также WO 01/38228 (Belew et al.) относится к способу анионообменной адсорбции, при котором для извлечения отрицательно заряженного вещества из жидкости посредством их связывания используются тиоэфирные анионообменники. Каждый лиганд содержит положительно заряженный азот и тиоэфирную связь на расстоянии 1-7 атомов от указанного заряженного азота. Целевые вещества, такие клетки, части клеток и вещества, содержащие пептидные структуры, адсорбируются при концентрации соли около 0,25 М NaCl.

Наконец, в US 6702943 (Johansson et al.) раскрыт способ извлечения целевого вещества из жидкости путем его адсорбции на матрице, несущей множество лигандов, содержащих анионообменные группы и гидрофобные структуры. Более конкретно, лиганды содержат ароматическое кольцо вблизи положительно заряженных анионообменных групп. Целевые вещества определены как клетки, части клеток и вещества, содержащие пептидные структуры. Описанные лиганды обозначены как "высокосолевые" лиганды, благодаря их способности адсорбировать целевые вещества при высоких концентрациях соли, таких как 0,25 М NaCl.

Однако для оптимизации процесса, относящегося к очистке конкретной целевой молекулы, требуются уникальные рабочие условия, и наилучшая сепарационная матрица будет в каждом случае меняться. Например, в биотехнологической промышленности необходимо разработать конкретные процессы для очистки пептидов и белков; нуклеиновых кислот, вируса и т.д. Кроме того, при очистке антител для выбора сепарационной матрицы решающим будет тип антитела. Таким образом, все еще остается необходимость в области альтернативных сепарационных матриц обеспечить широкую возможность выбора для очистки многих новых продуктов, которые постоянно разрабатываются.

Краткое описание сущности изобретения

В одном аспекте изобретения предложен новый лиганд, который применим в отделении антител от других компонентов жидкости.

В конкретном аспекте изобретения предложен такой лиганд, который способен адсорбировать примесные белки, но не целевое антитело.

Дополнительные аспекты и преимущества данного изобретения станут понятны из подробного описания, следующего ниже.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1 показан иллюстративный хроматографический лиганд по изобретению, а именно N-бензил-N-метилэтаноламин, соединенный с основой через свой амин.

На Фиг.2 показана хроматограмма разделения моноклонального антитела на сепарационной матрице, содержащей N-бензил-N-метилэтаноламинные лиганды, иммобилизованные на Sepharose™ 6 FF и, для сравнения, сильном анионообменнике Q Sepharose™ FF, как описано ниже.

На Фиг.3а) и б) показаны результаты хроматографии, проведенной на опытных образцах лигандов со смесью mAb1-rProtein А.

На Фиг.4а)-в) показаны результаты аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) пробы с mAb 1, 1%-ным rPrA и объединенных проточных и элюатных фракций с хроматографических разделений с Фиг.3.

На Фиг.5а представлены результаты аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) для тиомикамина.

На Фиг.5б представлены результаты аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) для 2-аминобензимидазола.

На Фиг.6 представлены результаты аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC) для N-бензил-N-метилэтаноламина.

Определения

Термины "антитело" и "иммуноглобулин" в данной заявке используются взаимозаменяемо.

Термин "сепарационная матрица" используется здесь для обозначения материала, состоящего из основы, к которой присоединены один или более чем один лиганд, содержащий функциональные группы. Иногда для сепарационной матрицы в данной области используется термин "смола".

Термин "мультимодальная" сепарационная матрица относится к матрице, способной обеспечить по меньшей мере два разных, но совместно действующих сайта, которые взаимодействуют с соединением, которое следует связать. Например, один из этих сайтов может обеспечивать благоприятный тип заряд-зарядного взаимодействия между лигандом и интересующим веществом. Другой сайт может обеспечивать электронное акцепторно-донорное взаимодействие, и/или гидрофобные и/или гидрофильные взаимодействия. Электронные донорно-акцепторные взаимодействия включают такие взаимодействия, как водородная связь, тт-тт, катион-тт, перенос заряда, диполь-дипольного, индуцированный диполь и т.д. "Мультимодальные" сепарационные матрицы также известны как сепарационные матрицы "смешанного типа".

Термин "поверхность" означает здесь все наружные поверхности и включает в случае пористой основы наружные поверхности, а также поверхности пор.

Термин "элюент" используется в его традиционном в данной области техники значении, то есть буфер с подходящим значением рН и/или ионной силы для высвобождения одного или более компонентов с сепарационной матрицы.

Термин "стадия захвата" в контексте жидкостной хроматографии относится к начальной стадии процесса разделения. Чаще всего стадия захвата включает очистку, концентрирование, стабилизацию и значительную очистку от растворимых примесей. После стадии захвата может следовать промежуточная очистка, которая дополнительно уменьшает количества оставшихся примесей, таких как белки клеток-хозяев, ДНК, вирусы, эндотоксины, питательные вещества, компоненты клеточной культуральной среды, такие как пеногасители и антибиотики, и примеси, родственные продукту, такие как агрегаты, разновидности с неправильным фолдингом и агрегаты.

Термин "одноразовый" означает в данном описании, в контексте хроматографических колонок и других сепарационных матриц, матрицу, которая предназначена для однократного применения или для ограниченного количества применений. Одноразовые продукты преимущественно используются для удаления загрязнений, которые являются вредными даже в небольших количествах, и в этом случае удобно адсорбировать указанное загрязнение на матрицу и затем выбросить данную матрицу. Другой ситуацией, когда желательны одноразовые продукты, является стерильная обработка, когда матрица является стерильной или по меньшей мере асептической.

Термин "стадия тонкой очистки" относится, в контексте жидкостной хроматографии, к конечной стадии очистки, на которой удаляются следовые примеси с получением активного, безопасного продукта. Примеси, удаляемые на стадии тонкой очистки, часто представляют собой конформационные изомеры целевой молекулы или продукты предполагаемой утечки.

Термин "Fc-связывающий белок" означает белок, способный связываться с кристаллизуемой частью (Fc) антитела, и включает, например, протеин А и протеин G, или их любой фрагмент, или их слитый белок, который сохранил указанное свойство связывания.

Подробное описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение представляет собой хроматографический лиганд, содержащий ароматический этаноламин. Лиганд в соответствии с изобретением особенно полезен в очистке антител, как более подробно будет обсуждаться ниже.

В первом воплощении настоящий лиганд определен следующей формулой:

R₁-R₂-N(R₃)-R₄-R₅, где

R₁ представляет собой замещенную или незамещенную ароматическую кольцевую систему, такую как фенильная группа;

R₂ представляет собой углеводородную цепь, содержащую 0-4 атомов углерода;

R₃ представляет собой углеводородную цепь, содержащую 1-3 атомов углерода;

R₄ представляет собой углеводородную цепь, содержащую 1-5 атомов углерода; и

R₅ представляет собой ОН или Н.

Как следует из вышесказанного, группа R₁ соединена с амином через углеродную цепь R₂, которая может не содержать атомов углерода, то есть создавать связь между R₁ и амином; или содержать 1-4 атомов углерода, например 2-3 атомов углерода, которые возможно замещены. Углеродная цепь R₄, соединяющая амин с R₅, может содержать 1-5 атомов углерода, например 2-4 атомов углерода, которые возможно замещены. R₃ амина может содержать 1-3 атомов углерода, например 2 атома углерода, которые возможно замещены.

Ароматическая кольцевая система R₁ может содержать одну или более чем одну замещенную или незамещенную фенильную группу, при условии, что замещение(я) не ухудшает связывающие свойства лиганда до какой-либо существенной степени. Таким образом, R₁ может содержать одно или более чем одно ароматическое кольцо, например фениленовую, бифениленовую или нафталиненовую структуру и другие ароматические кольцевые системы. Ароматические кольца могут быть гетероциклическими, то есть содержать один или более чем один атом азота, кислорода или серы, например пиридин, пиримидин, пиррол, имидазол, пиррол, имидазол, тиофен или пиран. Иллюстративные замещенные группы R₁ выбраны из группы, состоящей из гидроксифенила (2-, 3- и 4-); 2-бензимидазолила; метилтиоксифенила (2-, 3- и 4-); 3-индолила; 2-гидрокси-5-нитрофенила; аминофенила (2-, 3- и 4-); 4-(2-аминоэтил)фенила; 3,4-дигидроксифенила; 4-нитрофенила; 3-трифторметилфенила; 4-имидазолила; 4-аминопиридина; 6-аминопиримидила; 2-тиенила; 2,4,5-триаминофенила; 4-аминотриазинила и 4-сульфонамидофенила.

В предпочтительном воплощении R₁ представляет собой незамещенный фенил. В альтернативном воплощении R₁ представляет собой фенил, замещенный одной или более группами ОН.

Кроме того, один или более из R₁, R₂, R₃ и R₄ могут быть замещены любым подходящим заместителем до тех пор, пока связывающие свойства лиганда не ухудшаются до сколько-либо существенной степени. Например, если требуется более гидрофобный лиганд, он может содержать одну или более чем одну гидрофобную группу, например группы ОН. Альтернативно, замещение может усиливать гидрофобность лиганда, и в этом случае лиганд может содержать одну или более гидрофобную группу, такую как алкил и/или фтор. Наконец, замещение можно использовать для введения одной или более дополнительных функциональных элементов, таких как заряженные элементы для усиления мультимодального характера лиганда. Кроме того, углеродные цепи R₂ и R₃ могут быть линейными или разветвленными до тех пор, пока разветвления не ухудшают связывающие свойства лиганда до какой-либо существенной степени.

В конкретном воплощении настоящего лиганда R₂ представляет собой -СН₂-. В другом воплощении R₃ представляет собой -СН₃. В еще одном воплощении R₄ представляет собой -СН₂-CH₂-СН₂- или -СН₂-СН₂-. В еще одном воплощении R₁ представляет собой незамещенный фенил.

Таким образом, в предпочтительном воплощении лиганд по изобретению содержит N-бензил-N-метилэтаноламин (ВМЕА). В альтернативном воплощении лиганд представляет собой N,N-диметилбензиламин.

Лиганд по изобретению может быть легко синтезирован специалистом в данной области стандартными методами органической химии.

Еще одним аспектом данного изобретения является способ получения сепарационной матрицы, включающий иммобилизацию множества лигандов, как описано выше, на основу. Для получения матрицы, подходящей для однократного использования, особенно в области медицины или диагностики, сепарационную матрицу, изготовленную согласно изобретению, на последующей стадии также стерилизуют. Таким образом, в одном воплощении данный способ включает приготовление матрицы, как описано выше; помещение матрицы, полученной таким образом, в колонку и стерилизацию таким образом приготовленной матрицы. Специалист в данной области может легко провести стерилизацию в подходящих условиях, например путем обработки теплом; излучением или любым другим традиционно используемым способом.

Как следует из приведенной выше формулы, в его неиммобилизованном состоянии лиганд по изобретению содержит четвертичный амин, который образует подходящий инструмент для связывания его с основой, таким образом создается связанный лиганд, который содержит четвертичный амин и фенильную группу. Следовательно, считается, что при иммобилизации лиганд по изобретению является мультимодальным анионообменным лигандом, так как в дополнение к положительно заряженной четвертичной аминной группе он также содержит ароматическую кольцевую структуру, которая является гидрофобной. Способы иммобилизации лигандов на пористые или непористые поверхности хорошо известны в данной области; смотри, например, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992. В одном воплощении плотность лигандов на поверхности основы находится в интервале, близком к интервалу, обычно используемому для традиционных ионообменных матриц.

В предпочтительном воплощении связывание лиганда с основой обеспечивается путем введения линкера между основой и линкером. Связывание можно проводить после любой традиционной методики ковалентного связывания, например при использовании эпихлоргидрина; эпибромгидрина; аллил-глицилового эфира; бис-эпоксидов, таких как бутандиолдиглициловый эфир; галоген-замещенные алифатические вещества, такие как дихлорпропанол; и дивинилсульфон. Эти способы хорошо известны в данной области и легко осуществимы специалистом.

В конкретном воплощении лиганд по изобретению связывают с основой через длинную линкерную молекулу, также известную как экстендер. Экстендеры хорошо известны в данной области и широко используются для пространственного увеличения расстояния между лигандом и основой. Экстендеры иногда называют щупом или гибким плечом, более подробное описание возможных химических структур можно найти, например, в US 6428707, который включен в данное описание посредством ссылки. Кратко, экстендер может находиться в форме полимера, такого как гомо- или сополимер. Гидрофобные полимерные экстендеры могут иметь синтетическое происхождение, то есть иметь синтетический скелет, или биологическое происхождение, то есть биополимер, имеющий скелет, встречающийся в природе. Типичные синтетические полимеры представляют собой поливиниловые спирты, полиакрил- и полиметакриламиды, поливиниловые эфиры и т.д. Типичные биополимеры представляют собой полисахариды, такие как крахмал, целлюлоза, декстран, агароза.

Основа может быть выполнена из органического или неорганического вещества и может быть пористой или непористой. В одном воплощении основу готовят из нативного полимера, такого как сшитое углеводное вещество, например агароза, агар, целлюлоза, декстран, хитозан, конджак, каррагинан, геллан, альгинат, пектин, крахмал и т.д. Основы из нативного полимера легко изготовить и могут быть возможно сшиты стандартными способами, такими как обратное гелеобразование в суспензии (S Hjertén: Biochem Biophys Acta 79(2), 93-398 (1964). В особенно предпочтительном воплощении основа представляет собой разновидность относительно жесткой, но пористой агарозы, которую готовят способом, усиливающим ее текучие свойства, смотри, например US 6602990 (Berg) или SE 0402322-2 (Berg et al.). В альтернативном воплощении основу готовят из синтетического полимера или сополимера, таких как сшитые синтетические полимеры, например стирол или производные стирола, дивинилбензол, акриламиды, акрилатные эфиры, метакрилатные эфиры, виниловые эфиры, виниламиды и т.д. Такие синтетические полимеры легко приготовить и можно сшить стандартными методами, смотри, например "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L"lndustria 70(9), 70-75 (1988)). Нативные или синтетические полимерные основы также имеются в продаже, например у GE Healthcare, Uppsala, Швеция, например, в форме пористых частиц. В еще одном альтернативном воплощении основу готовят из неорганического полимера, такого как силикагель. Неорганические пористые или непористые основы хорошо известны в данной области и могут быть легко приготовлены стандартными способами.

Подходящие размеры частиц сепарационной матрицы по настоящему изобретению могут находиться в диапазоне диаметров 5-500 мкм, например 10-100 мкм, например 20-80 мкм. В случае по существу сферических частиц средний размер частиц может находиться в интервале 5-1000 мкм, например 10-500. В конкретном воплощении средний размер частиц находится в интервале 10-200 мкм. Специалист в данной области может легко выбрать подходящий размер частиц и пористость в зависимости от способа, который собираются использовать. Например, для крупномасштабного процесса, по экономическим причинам может быть предпочтительным более пористая, но жесткая основа, которая позволит производить обработку больших объемов, особенно на стадии захвата. При хроматографии, на выбор будут оказывать влияние такие параметры способа, как размер и форма колонки. В способе со вспученным слоем матрица обычно содержит наполнители высокой плотности, предпочтительно наполнители из нержавеющей стали. Для других способов на природу матрицы могут влиять другие критерии.

Таким образом, вторым аспектом настоящего изобретения является сепарационная матрица, которая содержит лиганды, описанные выше, связанные с основой. Как очевидно специалисту в данной области, каждая основа обычно будет содержать множество лигандов. В конкретном воплощении основа содержит лиганд, как он описан выше, в сочетании со вторым типом лиганда, где лиганд по изобретению присутствует в количестве по меньшей мере приблизительно 30%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% от общего количества лиганда. Такая комбинированная лигандная сепарационная матрица может быть сконструирована для конкретного случая, когда элемент дополнительных взаимодействий улучшает ее сепарационные свойства. Второй тип лиганда может содержать одну или более чем одну заряженную группу, например катионообменник, используемый для элюирования соединений посредством отталкивания заряда; гидрофобные группы; группы, способные к образованию водородной связи; аффинные группы или подобные.

В первом воплощении матрица по изобретению находится в форме частиц, например по существу сферических, вытянутых частиц или частиц неправильной формы. В конкретном воплощении сепарационная матрица является высушенной, например находится в виде сухих частиц, которые при использовании погружают в жидкость для поддерживания их первоначальной формы. В иллюстративном воплощении такая сухая сепарационная матрица состоит из сухих агарозных частиц. Однако матрица по изобретению альтернативно может принимать любую другую форму, традиционно используемую в разделении, например монолиты; фильтры или мембраны; капилляры, чипы; поверхности и т.д.

Следовательно, во втором воплощении матрица содержит мембранную структуру, такую как единственная мембрана, пакет мембран или фильтр.

Третьим аспектом изобретения является применение сепарационной матрицы, описанной выше. В первом воплощении в настоящем изобретении используется сепарационная матрица, как описано выше, в очистке белков. В предпочтительном воплощении настоящего применения белок представляет собой антитело; фрагмент антитела; или слитый белок, содержащий антитело. В другом воплощении в настоящем изобретении используют сепарационную матрицу, как описано выше, в разделении любого другого соединения, например выбранного из группы, состоящей из полипептидов; нуклеиновых кислот, например ДНК, РНК или их олигонуклеотидов, плазмид; вируса; прионов; клеток, таких как прокариотические или эукариотические клетки; липиды; углеводы; органические молекулы, такие как небольшие органические молекулы; лекарственные мишени; диагностические маркерные молекулы. Применение более подробно будет обсуждаться ниже. В еще одном воплощении в настоящем изобретении используют сепарационную матрицу, как описано выше, в качестве основы в клеточной культуре, то есть для иммобилизации клеток, которые растут на поверхностях. Как очевидно специалисту в данной области, в данной заявке термин разделение используется для очистки; выделения и извлечения соединений, а также включает идентификацию целевого соединения, например для диагностических целей.

Четвертым аспектом настоящего изобретения является способ разделения, при котором целевое соединение, такое как антитело, отделяют от одного или более других соединений в жидком образце путем приведения подвижной фазы, содержащей указанный жидкий образец, в контакт с сепарационной матрицей, как описано выше. В предпочтительном воплощении настоящий способ осуществляют, используя принципы жидкостной хроматографии, то есть путем пропускания подвижной фазы через хроматографическую колонку, содержащую сепарационную матрицу по изобретению. В еще одном альтернативном воплощении настоящий способ осуществляют, используя периодический хроматографический процесс, при котором сепарационную матрицу добавляют в сосуд, содержащий жидкий образец. В конкретном воплощении сепарационная матрица, добавляемая в периодическом процессе, содержит сухие частицы, такие как сухие частицы агарозы. В еще одном воплощении способ осуществляют, используя принципы хроматографии в вспученном слое, то есть путем добавления подвижной фазы к вспученному слою, например псевдоожиженному слою, сепарационной матрицы, которая находится в форме по существу сферических частиц, содержащих наполнитель высокой плотности.

В первом воплощении настоящего способа нежелательные соединения адсорбируют на сепарационную матрицу, в то время как нужное соединение, такое как антитела, остается в подвижной фазе неадсорбированным. Как очевидно специалисту в данной области, природа и характер адсорбированного соединения будут зависеть от происхождения жидкого образца. Примеры соединений, адсорбированных в данном воплощении, где нужные антитела не адсорбируются, являются клетки и клеточный дебрис; белки и пептиды; нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК; эндотоксины, вирусы, остатки культуральных сред и т.д. В конкретном воплощении, настоящая сепарационная матрица представлена в хроматографической колонке, а подвижная фаза проходит через эту колонку под действием гравитации и/или прокачивания, антитела получают в проточной жидкости колонки. Таким образом, преимуществом данного воплощения является то, что для него не требуется никакого элюирования продукта - антитела из колонки. Ликвидация отдельной стадии элюирования является привлекательной с точки зрения способа, так как меньшее количество стадий приведет к более быстрому протоколу очистки и, следовательно, уменьшит стоимость данного способа. Кроме того, антитела чувствительны к некоторым условиям, которые будут, например, негативно влиять на картину фолдинга; или расщеплять их, атакуя их пептидные связи. Таким образом, даже хотя условия элюирования для анионообменников в общем случае не включают никакие экстремальные химические агенты, изменение соли и/или pH может влиять на чувствительное антитело, причем данный эффект может варьироваться от вида к виду, в зависимости от р1, распределения заряда и т.д. Следовательно, еще одним преимуществом данного воплощения является то, что оно позволяет избежать добавления элюента и приложения элюирующих условий к целевым соединениям. Для получения наиболее подходящих условий для адсорбции соединений жидкий образец объединяют с подходящим буфером или другой жидкостью с получением подвижной фазы. Настоящее воплощение преимущественно осуществляют в условиях, подходящих для анионообменной хроматографии, что обычно включает адсорбцию при относительно низкой концентрации соли. Таким образом, в одном воплощении настоящего способа проводимость подвижной фазы находится в интервале 0-25, например 10-15 мС/см. В одном воплощении pH подвижной фазы составляет приблизительно 5-6. Если желательно затем высвободить адсорбированные соединения, например для повторного использования матрицы, элюирование можно провести при более высокой концентрации соли, например, используя возрастающий ингредиент соли. Для элюирования адсорбированных соединений значение pH также или альтернативно может быть сдвинутым, например представлять собой уменьшающийся градиент pH.

Во втором или альтернативном воплощении настоящего способа целевые соединения адсорбируют на матрицу, как в традиционной жидкостной хроматографии. Матрицу затем можно повторно использовать после селективного элюирования продукта. Элюирование легко осуществить, пропуская подходящий буфер через колонку. Если требуется, до или между таким(и) пропусканием(ями) можно использовать одну или более стадий промывки. В одном воплощении рабочие условия данного воплощения такие, как при традиционном ионном обмене, то есть адсорбция с использованием подвижной фазы, имеющей низкую проводимость, и элюирование с использованием буфера с высокой проводимостью, как обсуждается выше. Специалист в данной области может легко отрегулировать эти условия путем тестирования разных условий и анализа адсорбированного(ых) соединения(й) и потока. В конкретном воплощении нужными соединениями являются антитела.

Выбирая между первым и вторым воплощением из указанных выше, специалист в данной области может легко адаптировать условия для адсорбции конкретного соединения, преимущественно путем регулирования pH и/или проводимости. Например, при разделении антител разные классы антител имеют разные заряды и картины распределения зарядов, что, вместе с целью разделения, решит, является ли более предпочтительным адсорбировать антитела или позволить им пройти через колонку без адсорбции.

Антитела, разделенные в соответствии с одним воплощением данного изобретения, могут происходить из хорошо известного источника, такого как клетки, культивируемые на поверхности, или из периодической или непрерывной клеточной культуры в ферментационных резервуарах или сосудах. Таким образом, в одном воплощении жидкость представляет собой супернатант, получаемый при ферментации клеток. Примерами соединений, от которых требуется очищать антитела, являются белки, ДНК, вирусы, эндотоксины, питательные вещества, компоненты среды для культивирования клеток, такие как пеногасители и антибиотики, и родственные продукту примеси, такие как неправильно свернутые виды и агрегаты. Стадии контакта между подвижной фазой и сепарационной матрицей по настоящему изобретению, то есть стадии адсорбции, может предшествовать стадия механической фильтрации, центрифугирования и/или хроматографии. Например, если жидкий образец представляет собой ферментационный бульон, предпочт