Противоопухолевая фармацевтическая композиция (варианты) и ее применение

Противоопухолевая фармацевтическая композиция (варианты) и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, фармацевтической промышленности и, в частности, к получению композиции, способной ингибировать рост опухолевых клеток. Данная композиция содержит полипептидные фрагменты серрализинов, полученные деградацией интактного белка, которые обладают более высокой антипролиферативной активностью, чем целые молекулы серрализина. Указанные фрагменты принадлежат C-концу серрализинов, от внутреннего метионина последовательности до конца молекулы, и их комбинация с продигиозинами усиливает противоопухолевое действие данной композиции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Химиотерапия рака традиционно направлена на ингибирование пролиферации раковых клеток. Тем не менее, в последние годы возрос интерес к противоопухолевым продуктам, которые индуцируют апоптоз, поскольку рак, как установили, является патологией, связанной с относительным дефектом апоптоза, а не избыточной пролиферацией.

Бактерии или их экстракты применяли для лечения рака почти 100 лет. Наиболее цитируемо сообщение врача и хирурга William B. Coley из the Memorial Hospital города New Cork, называемого Sloan-Kettering Memorial Hospital. Он заметил, что многие из его пациентов с несколькими типами рака чувствовали регрессию опухоли после инфицирования патогенными бактериями (Coley, W.B. 1991 - перепечатано из 1893-. Clin. Orthop. 262:3).

Устойчивость к опухолям инфицированных пациентов или животных приписали противоопухолевому иммунитету, опосредованному сопутствующими клетками (Paglia, P. and Guzman, С.A. 1998. Cancer immunol. Immunother. 46:88). Идею о том, что инфекция патогенными бактериями или простейшими может активировать регрессию рака посредством активации врожденного или адаптивного иммунитета, недавно обсуждали Hunter et al. (Hunter, C.A., Yu, D., Gee, M., Ngo, С.V., Sevignani, C., Goldschmidt, M., Golovkina, T.V., Evans, S., Lee, W.F. and Thomas-Tekhonenko, A. 2001. J. Immunol. 166:5878). Они продемонстрировали, что ткани, инфицированные T. Gondii, вырабатывают некоторые растворимые антиангиогенные факторы, предотвращающие формирование кровеносных сосудов в опухолях, которые могут представлять потенциальный терапевтический интерес. Данный процесс формирования новых капилляров, известный как ангиогенез, стал важным центром внимания для внедрения новых способов лечения рака и его метастазов. Поиск антиангиогенных факторов является основанием для новых противораковых терапевтических стратегий (Folkman, J. 2003. Seminars in Cancer Biology. 13:159). Недавно применение анаэробных бактерий в качестве химиотерапевтических и избирательных противососудистых средств привело к значительной регрессии подкожных (sc) опухолей у мышей. Данное лечение называют сочетанной бактериолитической терапией (COBALTO) (Dang, L.H., Bettegowda, C., Huso, D.L., Klnzler, K.W. and Vogelstein, B. 2001. Proc Natl Arad Sci USA. 98: 15155). Тем не менее, живые бактерии вызывают значительную токсичность и побочные реакции, которые ограничивают их применение против рака у человека.

За последние годы появилось несколько сообщений, указывающих на то, что анаэробные бактерии выделяют окислительно-восстановительные белки, которые индуцируют апоптоз клеток опухоли (Yamada, Т., Goto, M., Punj, V., Zaborina, O. and Chen, M.L. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 14088; Goto, M., Yamada, Т., Kimbara, K., Homer, J., Newcomb, M., Gupta, Т.К. and Chakrabarty, A.M. 2003. Mol Microbiol. 47:549). Предположили, что окислительно-восстановительные белки можно включить в группу растворимых белков, которые секретировали предки прокариотических клеток, и их функциями могла являться элиминация предков эукариотических клеток (Punj, V. and Chakrabarty, A.M. 2003. Cellular Microbiology. 5:225). В целом мало известно относительно выработки растворимых секретируемых факторов данными прокариотическими организмами, которые могут специфическим образом действовать на раковые клетки, вызывая их смерть и, параллельно, регрессию опухоли.

Serratia marcescens является факультативной анаэробной бактерией. Из нескольких ее штаммов получили несколько препаратов с противоопухолевыми свойствами; наиболее изученными являются: [a] ImuVert^® (Budagov, R.S. and Ulianova, L.P. 2001. Radiats Biol Radioecol Russian. 41:38), препарат рибосомальных мембран, которые активируют иммунную систему пациента; [b] протеаза из Serratia Mr 56000 (Wu, J., Akaike, Т., Hayashida, K., Okamoto, Т., Okuyama, A. and Maeda, H. 2001. Jpn. J. Cancer Res. 92:439), которая индуцирует смерть клеток посредством некроза в зависимости от экспрессии α-2-макроглобулина; и [с] продигиозины, семейство пигментов, которые действуют как иммуносупрессоры и антиканцерогены посредством индукции апоптоза (Montaner, В. and Perez Tomas, R. 2003. Curr Cancer Drug Targets. 3:57; Perez Tomas, R. у Montaner, B. 2003. Histol Histopathol. 18:379). Авторы настоящего изобретения получили непротеолитические фрагменты серрализинов с более высокой цитотоксической активностью, чем целые молекулы. Это позволяет сочетать данные фрагменты с низкими дозами продигиозина, снижая токсичность, сообщенную для пигмента, и повышая антипролиферативное действие на опухолевые клетки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Композиции по данному изобретению способны ингибировать рост опухолевых клеток и составлены из полипептидных фрагментов серрализинов с более высоким антипролиферативным действием, чем целые молекулы серрализинов, которые можно сочетать с продигиозинами, что усиливает их противоопухолевое действие.

В данном изобретении описано получение препарата MG2327, в котором совместно присутствуют как полипептиды, так и продигиозины, который обладает широким спектром цитотоксического действия на линии малигнизированных клеток, с избирательным действием на трансформированные опухолевые клетки и, в особенности, на клетки, активированные для роста. Изучение чувствительности на разных линиях клеток, опухолевых или нет, демонстрирует, что линии нормальных клеток являются только слабочувствительными к препарату MG2327, в то время как клетки, полученные из меланомы, карциномы гортани, фибросарком, карцином печени и карциномы шейки матки (положительные или нет на вирус папилломы человека) являются очень чувствительными. Карциномы гематопоэтического происхождения являются менее чувствительными. Клетки HUVEC, активированные для роста, являются более чувствительными к MG2327, чем неактивированные. Препарат MG2327 способен действовать специфично на фактор, экспрессируемый или сверхэкспрессируемый в процессе деления клетки. Данные факторы образуют терапевтические мишени против рака и других заболеваний пролиферативного происхождения. Более того, данные факторы также образуют мишени для ранней диагностики заболеваний, вызываемых избыточной пролиферацией, или неконтролируемой пролиферацией дифференцированных или недифференцированных клеток. Составы с контролированным высвобождением, содержащие данные молекулы, можно направить на данные пролиферирующие мишени, действуя специфичным способом на них, потому что нормальные клетки более устойчивы к их действию.

Чтобы продемонстрировать противоопухолевую активность препарата MG2327, мышам BALB/c вводили внутрибрюшинной инокуляцией опухолевые клетки CB Hep.1 миелоидного происхождения, способные вызывать асцитические опухоли у мышей (Fontirrochi, G., Duenas, M., Fernandez de Cossio, M.E., Fuentes, P., Perez, M., Mainet, D., Ayala, M., Gavilondo, J.V. and Duarte, C. 1993. Biotecnol Aplic. 10: 24-30). Через 10 суток мышам инъецировали внутрибрюшинно препарат MG2327 или PBS. 60% животных, обработанных из расчета 1 мг/кг, выжили, в то время как только 25% контролей оставались живыми спустя 45 суток после начала обработки (фиг.8). Полную регрессию опухоли наблюдали у обработанных выживших животных, демонстрировавших здоровое состояние, в то время как у контролей опухоли прогрессировали, формируя большие плотные образования, и мыши демонстрировали ухудшение общего состояния.

Мыши BALB/c, с опухолью миелоидного происхождения, обработанные однократной дозой препарата MG2327 из расчета 1 мг/кг массы, выжили с полной регрессией. Та же самая доза повышает выживаемость, при значительном уменьшении объема опухоли, мышей BALB/c с опухолью, произошедшей от трансформированного фибробласта E6/E7. MG2327 защищает мышей BALB/c от приживления миелоидных опухолей.

Препарат MG2327 получили в результате оптимизации условий культивирования для выработки антипролиферативных молекул, которые образуют защитное вещество от приживления и развития злокачественных опухолей, таким образом, в качестве индуктора выработки антипролиферативных, апоптотических и антиангиогенных молекул в нормальных и опухолевых клетках, что можно успешно применять в профилактике и лечении рака, более того, других заболеваний, связанных с данными явлениями. Штамм CMIB 4202 сверхэкспрессирует растворимые белки в диапазоне 45-50 и 20-30 кДа (50 и 25 кДа посредством SDS-PAGE, с коэффициентом детерминации 0,984). Для фракции 25 кДа, обозначенной как p25, показали зависимую от дозы сильную антипролиферативную активность в эксперименте, выполненном на линии клеток HEp-2, инкубированных с ЭДТА, в то время как фракция 50 кДа, обозначенная как p50, не ингибирует рост. Однако при инкубации с 5 мкМ Zn₂SO₄ для фракции p50 показали антипролиферативную активность, но менее сильную, чем для фракции p25. IC₅₀ фракций p25 и p50 представляли собой 0,48 нМ и 16 нМ соответственно.

Выделенные белковые биомолекулы с антипролиферативным действием (полипептиды и продигиозин) получали согласно настоящему изобретению посредством только одной стадии хроматографии: ионного обмена с применением ступенчатого градиента NaCl. Применяли матрицу из сефарозы Fast Flow DEAE или QAE, уравновешенную 50 мМ фосфатным буфером, pH 8,00. Элюцию осуществляли ступенчатым градиентом NaCl: 50 мМ фосфатный буфер-0,1 M NaCl, pH 8,00; 50 мМ фосфатный буфер-0,2 M NaCl, pH 8,00; 50 мМ-2 M NaCl, pH 8,00, и в конце элюировали фракцию пигмента, абсорбированную на матрице, этанолом от абсолютного до 70%. Результаты подтверждают, что белковый компонент препарата 25 кДа обладает большей способностью, чем белковый компонент 50 кДа того же препарата, ингибировать рост клеточных опухолей, и оба обладают in vitro биологической активностью в индивидуальной форме.

Деградация p50 приводила к появлению фрагментов нескольких молекулярных масс, которые включали в себя фрагменты 25 кДа. Повышенную деградацию p50 получали посредством высокой температуры, и образование p25 было пропорционально данному повышению температуры, в то время как повышение температуры уменьшало p50. Поликлональные антитела к p50, полученные в овце, узнавали p25 в анализе вестерн-блоттингом; таким образом, p25 возникает как продукт деградации белка p50. Количество продуктов деградации возрастало пропорционально антипролиферативной активности продуктов деградации. Данные результаты подтверждают, что аутолиз p50 способен давать фрагменты деградации с антипролиферативной активностью более сильной, чем у исходной молекулы p50. Кроме того, белок p25 также индуцирует полную регрессию злокачественных опухолей миелоидного происхождения. Фрагменты p50 можно генетически конъюгировать посредством некоторой уже известной методологии фрагментов антител и создавать иммунотоксины, применимые для лечения заболевания пролиферативной этиологии. Также данный фрагмент сам по себе или в сочетании с другими белковыми молекулами можно применять в качестве носителя изнутри клеток или специфических рецепторов. Фрагмент p50 также может подвергаться воздействию внешней среды отрегулированной системы высвобождения для поддержания направленного контроля от специфичных мишеней.

Протеолитическую активность p50 ингибировали 7 мМ ЭДТА и продемонстрировали, что p50 является металлопротеазой, принадлежащей к семейству серрализинов, как идентифицировано масс-спектрометрией.

Основное сходство обнаружили у вида с идентификатором PRZN_SERSP и PRZN_SERMA в базе данных белков Swissprot. Белок p25, очищаемый хроматографией, не обладал ферментативной активностью, и он соответствует некаталитической карбоксиконцевой области серрализинов.

Белковые компоненты и продигиозин составили в одну и ту же композицию, которая значительно повышала (p<0,005), ингибирующий эффект по сравнению с индивидуальными компонентами данного состава. Композиции получили, поддерживая то же соотношение белков и продигиозина, которое использовали для оценки индивидуальных компонентов. В такой композиции продигиозин можно обнаружить в концентрации 0,1-100 нМ и фрагменты серрализина между 0,1-150 мкг/мл.

Получение композиции, содержащей полипептидные фрагменты, полученные из серрализинов, с повышенным антипролиферативным эффектом по сравнению с целыми молекулами серрализинов, и сочетание фрагментов серрализинов и продигиозинов, которое избирательно усиливает биологическую активность композиции.

Кроме того, данные полипептидные фрагменты обладают апоптотическим действием на раковые клетки. Данное апоптотическое действие включает в себя фрагментацию митохондрий, микротрубочек и ДНК, усиливающую сигнал программируемой клеточной гибели, с применением уменьшенных доз данной композиции. Данные события также наблюдали с сочетанной композицией полипептида и продигиозина.

Антиангиогенное действие MG2327 и антипролиферативных фрагментов полипептидов оценивали способом формирования трубчатой структуры в матригеле. Микроциркуляторные эндотелиальные клетки человека (HMEC) инкубировали с нецитоксическими концентрациями MG2327 и его фракций p25 и р50. Окончательный результат оценивали, принимая во внимание длину сформированных трубчатых структур и количество соединений между ними. Для этого применяли программу обработки изображений Pro Express 4.5. Результат подтверждает, что обработка композицией MG2327 позволяет объяснить, что обработка белком и его антипролиферативными полипептидами ингибирует в значительной степени (p<0,05, ANOVA) дифференцировку или созревание эндотелиальных клеток, демонстрируя, что MG2327, а также выделенные из него полипептиды, обладают антиангиогенной активностью.

Апоптотическая, антиангиогенная активность и избирательность являются одними из характеристик, наиболее важных для рассматриваемой композиции по данному изобретению, в качестве потенциального лекарственного и защитного средства против рака.

Продемонстрировали, что сочетание фрагментов серрализинов и продигиозинов является более сильным и избирательным, чем индивидуальные компоненты, в качестве противораковых средств. Данные полипептиды можно применять для получения рекомбинантных токсинов и иммунотоксинов для профилактики и лечения рака или других заболеваний, связанных с пролиферацией эндотелиальных и трансформированных клеток.

Данные полипептиды и их возможное сочетание с продигиозинами применимы в фармацевтической промышленности для получения вакцинных препаратов, лекарственных или диагностических средств для применения у человека или животных против рака и других патологий пролиферативного типа, которые являются высоко избирательными и обладают широким спектром действия.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Взаимодействием S. marcescens с опухолевыми клетками CB Hep.1 получают бактериальные штаммы с высокой антипролиферативной способностью и с модифицированной экспрессией белка. A - Выживаемость клеток. Через 72 часа выживаемость клеток подсчитывали способом MTT. Для штамма CMIB 4202 показали сильное антипролиферативное действие на опухолевые клетки человека HEp-2, в то время как действие штамма SM1995 являлось очень слабым. Данные результаты являлись усреднением трех независимых экспериментов с применением четырех повторностей на образец. B - Электрофорез SDS-PAGE (окрашивание серебром). CMIB 4202 сверхэкспрессировал растворимые белки, мигрировавшие приблизительно 25 и 50 кДа.

Фиг.2. Антипролиферативная активность фракций 25 и 50 кДа на линии клеток HEp-2. Жизнеспособность клеток определяли способом MTT и выражали в процентах относительно контрольных клеток. Фракции выделяли из гелей, содержащих SDS (окрашенных имидазол-цинком) и ренатурировали. Для фракции приблизительно 25 кДа показали сильную антипролиферативную активность (IC₅₀ 0,35 нМ/мл), в то время как p50 оказалась неспособной ингибировать рост. При добавлении 5 мкМ Zn₄SO₂ к p50 наблюдали возрастание антипролиферативной активности (IC₅₀ 45 нМ/мл), хотя ниже, чем у p25. Кривые построили на основе средних значений пяти независимых экспериментов и начертили с соответствующим стандартным отклонением (SD).

Фиг.3. Кинетика экспрессии белка и продигиозина штаммом CBMI 4202. Экспрессия продигиозинов в культурную среду происходит в течение переходного периода от фазы роста к стационарной фазе, где CBMI 4202 достигает более высокого времени удвоения. A - Кинетика времени удвоения клеток. B - Эффективность экспрессии продигиозина (продукт/биомасса). C - Кинетика антипролиферативного действия на клетки Hep-2, определяемая способом MTT. D - Кинетика роста клеток, определяемая по оптической плотности и биосинтезу белка.

Фиг.4. Чувствительность опухолевых и нормальных клеток человека к обработке MG2327. Нормальные клетки обладают низкой чувствительностью, и клетки гематопоэтического происхождения менее чувствительны, чем остальные из анализируемых клеточных линий. В то же время, клетки, активированные для роста (HUVEC bFGF), и клетки, полученные из опухолевых злокачественных повреждений, являются более чувствительными.

Фиг.5. Анализы выживаемости мышей BALB/c после обработки или без обработки препаратом MG2327 и введения опухоли CBHep1. A - Доза 1 мг/кг индуцировала регрессию опухоли у 60% обработанных животных, в то время как 100% необработанных животных умерли в течение 60 суток. B - Через сорок пять суток после инокуляции опухолевых клеток, необработанные животные демонстрировали крайне ослабленное состояние, с наличием твердых опухолей и асцита, в то время как животные, обработанные из расчета 1 мг/кг не демонстрировали признаков опухолей и жили дольше 300 суток.

Фиг.6. Противоопухолевое действие MG2327 на опухолевой модели 3T316. A - На графике ежесуточного среднего значения для каждой группы выявлены статистически значимые отличия между объемами опухолей обработанных и необработанных животных (p<0,003). Анализ роста опухоли в течение времени не показал значительных вариаций (p=0,109) для группы, обработанной MG2327, в то время как отрицательная контрольная группа демонстрировала значительное увеличение данного параметра (p=0,04). B - Выживаемость обработанных и необработанных животных.

Фиг.7. Выделение белковых активных фракций из MG2327. (A) Электрофорез SDS-PAGE (12,5%). Результаты окрашивания по Кумасси. На дорожке 1 показан образец, соответствующий элюции 0,2 M NaCl, pH 8,00, где белковая полоса, соответствующая 50 кДа, может заслуживать внимания. На дорожке 2 показана белковая полоса 25 кДа. Окрашивание осуществляли по способу Кумасси. (B) Антипролиферативное действие на HEp-2 белков p50 и p25 на опухолевых клетках человека. Отношение доза-эффект для p25, p50 и MG2327 выражали в виде концентрации общего белка.

Фиг.8. Антипролиферативные эффекты активных фракций, выделенных из MG2327, на клетки HEp-2. Для белков 50 и 25 кДа, содержащихся в MG2327, показана активность ингибирования роста. Сочетание данных белков с продигиозинами уменьшало дозу, способную ингибировать рост 50% опухолевых клеток при сравнении с контролем (IC₅₀).

Фиг.9. SDS-PAGE и вестерн-блоттинг. (A) Образец белка, полученный из MG2327. Образец анализировали в геле SDS-PAGE (12%) и окрашивали серебром. (B) Белковые полосы приблизительно 50 и 25 кДа (стрелки) вырезали из сходного геля, окрашенного имидазол-цинком, ренатурировали и снова разделяли в новом SDS-PAGE. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и вестерн-блоттинга проявили с помощью антитела к p50. Поликлональные антитела, полученные в козе, являлись способными узнавать p25 и продукты деградации p50, и не узнавать полосы неродственных белков (Neg C).

Фиг.10. Аутолиз p50. A - Электрофорез SDS-PAGE: 1-24°C, 2-37°C, 3-45°C, 4-60°C, 5-4°C. B - Денситометрический анализ p50 и p25 продемонстрировал, что с увеличением температуры инкубации уменьшается интенсивность полосы p50, в то время как увеличивается интенсивность полосы p25.

Фиг.11. p50, очищенный хроматографией на сефарозе Fast Flow DEAE. p50 (элюированный 0,2 M NaCl) дает продукты деградации с более высокой антипролиферативной активностью, чем родительская молекула.

Фиг.12. Ферментативная активность p25 и p50, полученных разными хроматографиями. A - Для p25 не продемонстрирована активность, в то время как для p50 показана ферментативная активность. B - 7 мМ ЭДТА полностью ингибировала ферментативную активность p50.

Фиг.13. MG2327 индуцировал зависящую от времени фрагментацию ДНК опухолевых клеток P3X63Ag8. Спустя 6 часов инкубации можно наблюдать олигонуклеосомные фрагменты, и их количество возрастает со временем, достигая обычного апоптотического профиля с олигонуклеосомными фрагментами 180-200 пар оснований к 24 часам.

Фиг.14. Ультраструктура клеток миеломы мыши P3X63AG8, обработанных и необработанных (контрольные клетки) препаратом MG из расчета 22 мкг/мл. (A) На электронной микрофотографии контрольных клеток миеломы мыши P3X63Ag8 показаны цитоплазма и ядро данных клеток, с показанной ультраструктурой, обычной для нормальных клеток, и ультраструктура митохондрий, обычная для нормальных клеток: митохондриальный матрикс обладал более высокой плотностью, чем окружающая цитоплазма (B) К 2 часам после обработки посредством MG в цитоплазме присутствовали вакуолизированные тельца (которые отчасти происходят из измененных митохондрий набухание митохондрий и разрушение крист нормальное ядро (C, D) Агрегацию митохондрий и индивидуальные кристы, которые становятся слившимися также наблюдали после двух часов обработки в (В). (Е) Электронные микрофотографии с апоптотической морфологией: конденсация (маргинация и фрагментация хроматина и апоптотические тельца (Δ) к 6 часам после обработки посредством MG2327. (F) Апоптоз выявляли по компактизации хроматина, в ядре наблюдали периферические бляшки конденсированного хроматина. {Обратите внимание, что набухание митохондрий и разрушение крист, всех цитоплазматических мембран присутствовало во все разные моменты времени}. Увеличения: ×6000 (Е), ×10000 (A, B, D), ×15000 (C) и ×40000 (F).

Фиг.15. Влияние MG2327, p25 и p50 (очищенных хроматографией) и их фракций на дифференцировку эндотелиальных клеток в матригеле. Клетки HMEC культивировали в условиях активации (10 нг/мл EGF, 1 мкг/мл гидрокортизона) в присутствии сходных концентраций MG2327 (A), p50 (B) и p25 (C), без обработки (E) и без активации (D). На диаграмме (F) сгруппированы результаты 3 независимых экспериментов, демонстрируя ингибирующую активность MG2327 и его компонентов на формирование трубчатых сетей в матригеле. Как MG2327, так и p50 полностью обращали индуцированную активацию до уровня неактивированных клеток (ANOVA MG2327, p50 и CN p>0,05. Клетки, обработанные p25, демонстрировали более низкий показатель формирования сети, чем наблюдаемый для MG2327 и p50 (непарный t p=0,0107 и p=0,0498 соответственно).

Фиг.16. Выживаемость BALB/c, иммунизированных или нет MG2327, и с введенными клетками миеломы X63. При применении 3 и 6 доз из расчета 1 мг/кг MG2327, у 100% иммунизированных животных произошло отторжение миелоидной опухоли.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение штамма CMIB 4202

Для получения штаммов бактерий, вырабатывающих противоопухолевые молекулы, дикий тип Serratia Marcescens SM1995, выделенный из брюшной поверхности мышей BALB/c, смешали с опухолевыми клетками CBHEp.1 (Aleman, M.R., Valdes, R., Perez, M., Ibarra, N., Reyes, В., Gonzalez, M., Mendoza, O., Padilla, S., Agraz, A. and Rodriguez, M.P. 2000. Biopharm 13:48-52) и инокулировали внутрибрюшинно мышам BALB/c, предварительно инокулированным 10 сутками ранее тяжелым жидким вазелином. Спустя восемь суток после инокуляции смесями клеток производили каждые 2 суток извлечения из асцитов. Анализировали кинетику роста опухоли, и осуществляли микробиологический контроль асцита каждого животного, дающего представление о регрессии опухоли.

Выделенные бактерии выращивали в различных средах и условиях культивирования. Супернатанты культуры стерилизовали фильтрованием, применяя мембранные фильтры 0,22 мкМ, и их токсичность оценивали на клетках CBHEp.1. Штамм с более высокой цитотоксичностью отдали на хранение под инвентарным номером CMIB4202 в the Collection of Microorganism with Biotechnological Importance of the Center of Genetic Engineering and Biotechnology, Habana city, Cuba. CMIB4202 и его родительский штамм SM1995 культивировали в параллели в ферментерах на 5 л в средах с пептон-глицерином при 28°C. Для стерильного фильтрата CMIB 4202 показана активность, зависимая от дозы, в то время как фильтрат SM1995 обладает только незначительной активностью на линии раковых клеток человека HEp-2 (фиг.1A) в анализе антипролиферативности с применением способа MTT (Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., Mcmahon, J., Vistica, D., Warren, J. Т., Bokesch, H., Kenney, S. and Boyd, M.R. 1990. J. Natl. Cancer. Inst. 82:1107).

Штамм CMIB 4202 сверхэкспрессировал растворимые белки в диапазонах 45-50 и 20-30 кДа (50 и 25 кДа, как определено посредством SDS-PAGE, с коэффициентом детерминации 0,984), фиг.1B.

Для фракции p25, выделенной из полос, присутствующих в гелях с SDS, окрашенных имидазол-цинком (Hardy, E., Santana, H., Sosa, A., Hernandez, L., Fernandez-Padron, C. and Castellanos-Serra, L. 1996. Analytical Biochemistry. 240:150), показали сильную антипролиферативную активность на HEp-2, зависимую от дозы, в то время как фракция p50 не ингибирует рост клеток.

Тем не менее, для p50 при инкубации с 5 мкМ Zn₂SO₄ продемонстрировали антипролиферативную активность, но более низкую по сравнению с наблюдаемой для p25 (фиг.2). IC₅₀ фракций p25 и p50 являлись 0,48 нМ и 16 нМ, соответственно.

С целью сравнить способность обоих штаммов экспрессировать белки применяли факториал ANOVA. Значение вероятности взаимодействия не являлось значимым (p=0,93). С другой стороны, вероятность обоих основных эффектов показала, что оба белка экспрессированы в существенно отличающихся количествах (р=0,01) и что это количество сильно зависит от штамма (р=0,0004). Более того, имелись существенные различия в экспрессии этих белков между обоими штаммами (р<0,001).

Пример 2. Получение антипролиферативного препарата MG2327

Для получения антипролиферативного препарата части штамма S. marcensces CMIB 4202 получили 1 л культуры микроорганизма, и культуральные среды оптимизировали для получения интересующих молекул (фиг.3). Культуру CMIB 4202 центрифугировали при 12000 g и 4°C 30 минут. Супернатант собирали и затем фильтровали через молекулярный фильтр 0,2 мкм в стерильных условиях. Объем супернатанта уменьшали в 10 раз в тех же самых стерильных условиях. Объем супернатанта уменьшали в 10 раз, применяя мембрану с пределом исключения 10 кДа и диализуя против PBS при 4°C в течение 24 часов в физиологических условиях. Диализованное вещество фильтровали в стерильных условиях и распределяли по флаконам по 5 мл. Препарат хранили при 4°C и назвали MG2327.

Увеличение загрузки ферментера до 5 л осуществляли в условиях, уже определенных в скрининге: среды пептон-глицерин при 28°C 14 часов, аэрация 1 vvm, 250 об/мин и начальная оптическая плотность 0,1. pH культуральных сред доводили до физиологического, и ферментацию осуществляли при свободном pH. Остальное осуществляли в той же форме, как в скрининге.

Пример 3. Характеристика антипролиферативной активности препарата MG2327 in vitro

Для характеристики антипролиферативной активности MG2327 in vitro оценивали панель линий клеток человека (табл.1). Всего 2000 клеток, за исключением PBMC (20000), высевали в 96-луночные культуральные планшеты и добавляли различные концентрации MG2327. Через 72 часа количество выживших клеток оценивали добавлением MTT (Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., Mcmahon, J., Vistica, D., Warren, J.Т., Bokesch, H., Kenney, S. and Boyd, M.R. 1990. J Natl Cancer Inst. 82:1107). Растворимые продукты формазана детектировали при 540 нм в многоканальном спектрофотометре для прочтения планшетов. Для MG2327 показали широкий диапазон цитотоксической активности против анализируемых линий клеток человека. IC₅₀ находился в диапазоне мкг/мл.

Таблица 1 Клетки и культуральные среды,применяемые при исследовании in vitro
FIBHUM	ФИБРОБЛАСТЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ КРАЙНЕЙ ПЛОТИ ЧЕЛОВЕКА, P 3-6	DMEM, 15% FBS*, ИНСУЛИН 30 мкг/мл
H82	Карцинома легкого человека	RPMI 1640, 10% FBS
MDA-MB145S	Аденокарцинома молочной железы человека	DMEM, 10% FBS
Colo-205	Карцинома толстой кишки человека	RPMI 1640, 10% FBS
HT1080	Фибросаркома человека	DMEM, 10% FBS
Hela	Карцинома шейки матки человека	DMEM, 10% FBS
HEp-2	Карцинома гортани человека	MEM, 10% FBS
HepG2	Гепатокарцинома человека	DMEM, 10% FBS
A375	Меланома человека	DMEM, 10% FBS
PBMC	Периферические мононуклеарные клетки человека	RPMI 1640, 10% FBS, IL-2
HuT78	T-клеточная лимфома кожи человека	RPMI 1640, 10% FBS
HL60	Промиелоцитарный лейкоз человека	RPMI 1640, 10% FBS
K562	Эритролейкоз человека	RPMI 1640, 10% FBS
CRL 1682	Аденокарцинома поджелудочной железы человека	RPMI 1640, 10% FBS
A 431	Аденокарцинома наружных женских половых органов человека	RPMI 1640, 10% FBS
SiHa	Карцинома шейки матки человека	RPMI 1640, 10% FBS
CaSki	Карцинома шейки матки человека	RPMI 1640, 10% FBS
HUVEC	Эндотелиальные сосудистые клетки человека	M199 30% FBS 10 нг/мл bFGF
*FBS: Фетальная бычья сыворотка

Избирательность MG2327 сравнивали с коммерческим лекарственным средством доксорубицином (DXR), применяя линию клеток HT1080 (из фибросаркомы) и первичные фибробласты. Антипролиферативный анализ применяли, как описано выше. Серийные разведения DXR и препарата MG2327 применяли от 10 мкг/мл и строили кривую по пяти точкам. Показатель смертности рассчитывали для каждой точки как отношение между процентной долей смертности для HT1080 и процентной долей смертности для первичных фибробластов. Более сильные различия детектировали при более низких тестируемых концентрациях (MG2327 9:1, DXR 1,7:1). MG2327 являлся очень избирательным при концентрациях ниже 2 мкг/мл.

Клетки HEp-2, происходящие из карциномы гортани, являются очень устойчивыми к противоопухолевым средствам, применяемым в клинике, по сравнению с другими анализированными линиями клеток. По этой причине авторы настоящего изобретения применяли их как модель для изучения in vitro эффектов препарата MG2327. Сравнение кривых цитотоксичности, построенных для клеток HEp-2, обработанных известными противоопухолевыми средствами, продемонстрировало сходные результаты (40%) пролиферации при 3 мкг/мл для препарата MG2327, цисплатина (CDDP), доксорубицина (DXR), винкристина (VC), винбластина (VB) и таксола (TX) (p>0,05, критерий ANOVA). В тех же самых условиях для других противоопухолевых средств, подобных ара-C, метотрексату (MTC), блеомицину (Bleo) и циклофосфамиду (CPA), не продемонстрировали эффект. CDDP является одним из противоопухолевых средств, разрешенных FDA для лечения рака гортани, и анализ кривых выживаемости для препарата MG2327 и CDDP показал сходные значения для IC₁₀, IC₅₀ и IC₉₀.

Изучение чувствительности разных канцерогенных линий клеток и неканцерогенных (фиг.4) показало, что линии нормальных клеток являются мало чувствительными, в то время как меланома, карцинома гортани, фибросаркома, гепатокарцинома и карцинома шейки матки (носитель вируса папилломы человека) являются очень чувствительными. Карциномы гематопоэтического происхождения являются менее чувствительными. Активированные для роста клетки HUVEC являются более чувствительными к препарату MG2327, чем не активированные.

Предыдущий результат продемонстрировал, что препарат MG2327 обладает широким спектром цитотоксического действия на линии злокачественных клеток, с избирательным влиянием на опухолевые/трансформированные клетки, и клетки, активированные для роста.

Пример 4. Противоопухолевая активность препарата MG2327

Для демонстрации противоопухолевой активности препарата MG2327 авторы настоящего изобретения применяли мышей BALB/c, которым прививали внутрибрюшинно (i.p.) опухолевые клетки CB Hep.1 миелоидного происхождения, способные давать начало мышиным асцитным опухолям (Fontirrochi, G., Duenas, M., Fernandez de Cossio, M.E., Fuentes, P., Perez, M., Mainet, D., Ayala, M., Gavilondo, J.V. and Duarte, C. 1993. Biotecnol Aplic. 10:24-30). Спустя 10 суток мышам инъецировали i.p. MG2327 или PBS. Шестьдесят процентов животных, обработанных из расчета 1 мг/кг массы, выжили, в то время как только 25 процентов контролей жили до 45 суток после начальной обработки (фиг.5). Полную регрессию опухоли наблюдали у всех обработанных выживших животных, которые демонстрировали здоровое состояние, в то время как у контролей опухоли прогрессировали, формируя большие плотные образования, и животные демонстрировали нездоровое общее состояние.

У мышей BALB/c, несущих опухоль из фибробластов, трансформированных E6/E7, возрастала выживаемость после обработки препаратом MG2327, демонстрируя значительное уменьшение объема опухоли.

Также для оценки противоопухолевой активности MG2327 применяли модель рака, ассоциированного с вирусом папилломы человека (HPV16), разработанную Hernandez et al. (Hernandez, P., Merina, N., Lopez-Ocejo, O. and Arana, M.J. 2000. Biochem Biophys Res Commun. 270:119-124). Две группы мышей BALB/c инокулировали подкожно (s.c.) 2·10⁶ клеток 3Т316 в левую брюшную область. Через 48 часов дозу из расчета 0,75 мг/кг массы MG2327 или PBS вводили s.c, близко к первоначальной инокуляции клетками в контрольной группе; ежесуточные измерения производили циркулем. Объем опухоли подсчитывали с применением общепринятой формулы: V=0,52·a²·b, где a представляет собой ширину, а b представляет собой длину горизонтального периметра опухоли (Hernandez, P., Merina, N., Lopez-Ocejo, O. and Arana, M.J. 2000. Biochem Biophys Res Commun. 270:119-124). Характер изменения показан на фиг.6.

Различия во времени развития опухоли являлись статистически значимыми (p=0,0054) между обработанными и необработанными животными. Изучение отношения время:обработка посредством критерия ANOVA показало, что та же самая величина различия не сохраняется между обработанными и необработанными группами; это указывает на существование различия, связанного с примененной к животным обработкой.

При применении критерия Уилкоксона к парным данным измерений между 21 и 45 сутками для каждой группы авторы настоящего изобретения детектировали значимое увеличение объема опухоли для контрольной группы (p=0,043), что не имеет места в случае обработанной группы (фиг.6A). Для анализа существования значимых различий между группами в каждой точке оценивания, авторы настоящего изобретения применяли U-критерий Манна-Уитни, которым детектировали значимые различия, за исключением первой точки (p<0,01). Также авторы настоящего изобретения детектировали важное различие в скорости роста опухоли. Кривые роста приводили к одной линии, и наклоны вычисляли из уравнения, полученного наилучшим приближением. Сравнение наклонов показывает, что опухоль в контрольной группе росла со скоростью значительно выше наблюдаемой скорости для обработанной группы (p=0,0088).

Мыши контрольной группы умерли между 45 и 64 сутками вследствие прививания опухоли, в то время как животные в обработанной группе начали умирать на 52 сутки, с 20% выживших, которые остались со временем (170 суток), фиг.6B.

При приведении данных по выживаемости к Байесовской иерархической модели (регрессия Вейбула с 500 итерациями) авторы настоящего изобретения получили статистически значимое различие (p=0,02447), которое подтвердили, когда показали, что доверительные интервалы среднего времени выживаемости полностью не пересекались.

Пример 5. Фракционирование препарата MG2327. Выделение небелковых биомолекул

Для определения состава препарата MG2327 осуществляли его молекулярное фракционирование и оценивали его способность ингибировать in vitro рост клеток линии опухолевых клеток человека Hep-2.

Полисахаридную фракцию (tr=6,85 минут) отделяли хроматографией в геле Aminex HPX 87-N (размеры: 300×7,8 мм, элюция: 0,5 мл/мин). Применяли образцы фруктозы tr=13,15 минуты, глюкозы tr=12,12 минуты, дисахарида tr=9,40 минуты, трисахарида tr=8,24 минуты, полисахарида tr=7,01 минуты. Фракцию пигмента отделяли на колонке butyl-TSK MERCK, уравновешенной 20 мМ фосфата, pH=7, в котором остаток задерживался на матрице, с которой затем элюировали, используя абсолютный этанол. Спектр поглощения (100% этанол, pH 5,00) полученного продукта демонстрировал полосу с максимумом при 470 и 490 нм, и максимальный пик при 537 нм, которые соответствуют характерному описанию для мономеров и ди