Средство для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта и способ его получения

Средство для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта и способ его получения

Реферат

Изобретение относится к области медицины, а именно к препаратам для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), полученным на основе пробиотических микроорганизмов и/или их метаболитов. Препараты данной группы при введении в организм оказывают позитивное воздействие на физиологические, биохимические и иммунные реакции хозяина через стабилизацию и оптимизацию функциональной активности нормальной микрофлоры ЖКТ и могут быть использованы в прикладной биотехнологии, медицине, пищевой промышленности, ветеринарии и смежных отраслях.

В настоящее время для нормализации деятельности ЖКТ в макроорганизм перорально вводят препараты, содержащие живые микроорганизмы, в частности биопрепараты на основе молочнокислых микроорганизмов [ЕР 0097484, 1984 кл. А23С 1/05: ЕР 0043962, 1980 кл. А23С 19/086: US 4289888, 1979, кл. А23С 9/123]. Как правило, в состав таких препаратов входят: клетки бактерий, остатки культуральной жидкости (КЖ), жиры, белки, лактоза, камедь и другие добавки. Конкретный состав таких композиций определяется особенностями используемых микроорганизмов и характером поставленной задачи.

Недостатком указанных препаратов является их относительно невысокая биологическая активность, связанная с процессом инактивации живых микрооргаганизмов при их прохождении через верхние отделы ЖКТ (желудок, двенадцатиперстная кишка), а также отсутствие стабильности их биологических свойств как при получении, так и при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности лечебно-профилактических процедур.

Более стабильными при хранении являются пробиотические препараты, содержащие в качестве активного начала спорообразующие бактерии. Широкое распространение получили пробиотик Бактисубтил (фирма "Marion Merrell", Франция) и его аналог Флонивин БС (фирма "Galenika", Сербия), содержащие культуру штамма Bacillus cereus IP 5832 (коллекция Института Пастера, Париж), а также Энтерогермин (фирма "Sanofi Winthrop", Италия) и Цереобиоген ("Xing Jian", Китай), действующим началом которых являются различные штаммы В. cereus [Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных.// Микробиол. Журн., 1992, т.54, №6, с.82-93]. Недостатком указанных пробиотиков является ограниченность их спектра действия, так как они направлены против относительно узкой группы возбудителей заболеваний.

Известен лечебно-профилактический биопрепарат «Бактиспорин», применяемый для лечения широкого круга заболеваний. Он содержит высушенную лиофильным способом биомассу бактерий штамма Bacillus subtilis 3H и защитную среду на основе сахарозожелатиновой смеси или лактозы [RU 2130316, 1999]. Однако биопрепарат также имеет низкую эффективность против таких возбудителей острых кишечных инфекций, как Pseudomonas spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp.

Известны препараты «Биоспорин» и «Ирилис», которые характеризуются высокой антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Препараты содержат живые клетки штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, а также наполнитель [RU 1722502, 1992; RU 2264454, 2005]. Недостатком этих препаратов является чувствительность входящих в их состав микроорганизмов к антибиотикам, что исключает возможность их сочетанного применения с антибактериальными средствами. Терапевтические дозы антибиотиков априори вызывают гибель патогенных форм бактерий и неизбежное подавление функциональной активности живых штаммов пробиотических микроорганизмов. Это приводит к существенному снижению и/или отсутствию ожидаемого клинического эффекта, что ограничивает практическое применение таких схем лечения.

Из аналогов по технической сущности и заявляемому эффекту наиболее близким к заявляемому изобретению является препарат «Бактистатин» [RU 2287335, 2006], принимаемый перорально в виде капсул. В состав препарата входят (мас.%): стерилизованная культуральная жидкость (СКЖ), содержащая метаболиты штамма Bacillus subtilis - 0,1÷2,0, цеолит - 68,0÷85,0, гидролизат соевой муки (ГСМ) - 15,0÷30,0 и стеарат кальция (СК) - 0,5÷5,0.

Действие препарата «Бактистатин» базируется на том, что при его транзитном прохождении по ЖКТ в заданной зоне происходит разрушение защитной желатиновой капсулы и выделение в полость кишечника иммобилизованных на частицах цеолита компонентов пробиотика. В процессе движения частиц цеолита по ЖКТ с пористой поверхности адсорбента постепенно высвобождаются биологически активные соединения, что позволяет поддерживать в ЖКТ активность биологических компонентов пробиотика не менее суток, которое необходимо для восстановления и стимуляции функциональной активности нормальной микрофлоры кишечника. При этом эффект постепенного высвобождения с поверхности цеолита компонентов препарата приводит к появлению открытых поверхностей его структуры, что обеспечивает включение механизмов ионного обмена и избирательной адсорбции токсичных соединений.

Препарат получают следующим образом. Микроорганизмы В.subtilis выращивают методом глубинного культивирования. Затем культуральную жидкость (КЖ) с микроорганизмами подвергают центрифугированию и стерилизации, а полученную стерилизованную КЖ, содержащую метаболиты продуцента, смешивают с ГСМ, цеолитом и СК (как вариант, стерилизации подвергают смесь КЖ с цеолитом). Образовавшуюся смесь подвергают лиофилизации, при которой происходит иммобилизация биологически активных компонентов препарата на частицах цеолита, и фасуют в капсулы.

Недостатками препарата Бактистатина и способа его получения являются:

- нестабильность состава, обусловленная применением глубинного культивирования бактерий B.subtilis, при котором накопление в КЖ метаболитов продуцента зависит от большого количества факторов, а также наличие в препарате высокомолекулярных белков и пептидов, которые повышают вероятность развития аллергических реакций;

- относительно быстрое снижение активности препарата при длительном хранении без специального оборудования;

- возможность наличия в КЖ споровых форм продуцента, что заставляет применять жесткие методы стерилизации, приводящие одновременно к разрушению биологически активных веществ, составляющих действующее начало препарата.

Задачей, решаемой авторами изобретения, является создание стандартного по составу комплексного пробиотического средства, обладающего более высокой активностью и стабильностью при хранении, а также более экономичного и технологичного способа его получения.

Технический результат изобретения в отношении заявляемого «средства» заключается в том, что в качестве источника метаболитов и/или других биологически активных веществ (БАВ) используют не культуральную жидкость, содержащую метаболиты продуцента, а продукты расщепления клеток микроорганизмов литическими ферментами («лизат») в следующих соотношениях ингредиентов конечного средства (мас.%): цеолит - 70,0÷80,0; гидролизат соевой муки (ГСМ) - 15,0÷25,0; стеарат кальция (СК) - 0,5÷1,5; литические ферменты - 0,05÷3,5; лизат клеток продуцента - остальное.

Было показано, что значительное подавление роста тестовых культур микроорганизмов Sh.sonnei и S.aureus (таблица 1) по сравнению с препаратом-аналогом может быть достигнуто независимо от природы микроорганизмов. Литические ферменты либо остаются в композиции после завершения лизиса как часть лизата, либо, в частности, при введении в состав заявляемого средства низких концентраций лизата (менее 0,05÷0,1%) вводятся в композицию в виде вносимых извне ферментных препаратов.

Лучшие результаты по воздействию на указанные тестовые культуры микроорганизмов были достигнуты при использовании средства, получившего условное наименование «СЛ08», содержащего (мас.%): лизата клеток Bacillus subtilis - 0,10; литических ферментов - 0,5; цеолита - 76,0; гидролизата соевой муки - 22,4; стеарата кальция - 1,0. Средство «СЛ08» было снабжено кишечно-растворимой капсулой, покрытой кислотно-защитным слоем.

Технический результат изобретения в отношении «способа» заключается в том, что после культивирования выделяют клетки микроорганизмов и подвергают их воздействию литических ферментов в течение 2÷10 часов при температуре

+20,0÷50,0°С, после чего смешивают с вспомогательными веществами, а затем фасуют в желатиновые капсулы (по 0,5 или 1,0 г).

В результате использования заявляемого способа на стадии отделения клеток микроорганизмов от питательной основы из дальнейшей переработки исключается попадание нежелательных компонентов культуральной среды в конечную субстанцию «средства». Под воздействием литических ферментов происходит повышенное контролируемое выделение полезных метаболитов клеток, одновременно обеспечивается деструкция потенциальных аллергенов (белки, полисахариды и т.д.), а также исключается возможность попадания в конечный препарат живых микроорганизмов и спор. При этом нет необходимости использовать жесткие режимы стерилизационной обработки БАВ препарата, а стерилизация цеолита и/или ГСМ может проводиться обычными методами - например, автоклавированием или сухим жаром.

Кроме того, процесс последовательного перемешивания биологически активных компонентов заявляемого средства исключает применение последующей процедуры сушки получаемой конечной субстанции лиофильным или любым другим способом.

Таким образом, реализация вышеописанной технологии получения препарата на основе ферментативного лизата клеток микроорганизмов обеспечивает постоянство биохимических характеристик состава заявляемого «средства»; исключает последующее появление в конечном продукте живых клеток; повышает устойчивость композиции при хранении; упрощает процесс получения конечной субстанции композиции за счет исключения стадии сушки.

Пример 1. Микроорганизмы B.subtilis ВКПМ №В-2335(3) выращивали методом поверхностного культивирования. После окончания процесса культивирования проводили механическое отделение клеток от культуральной среды. Затем клетки подвергали разрушению при помощи литического фермента субтилизина (0,8 мас.%) в течение 2 часов при температуре +50°С. Полученный ферментативный лизат клеток смешивали с ГСМ, цеолитом и СК. Перед смешиванием ГСМ и цеолит подвергали стерилизации сухим жаром. В результате был получен препарат следующего состава (мас.%): лизата клеток B.subtilis - 0,25; литических ферментов - 0,75; цеолита - 78,0; гидролизата соевой муки - 20,0; стеарата кальция - 1,0. Выход конечного продукта 200±5 кг.

Пример 2. Микроорганизмы B.subtilis штамм ВКПМ №8-2335(3) выращивали методом глубинного культивирования. После окончания процесса культивирования проводили отделение клеток от культуральной среды центрифугированием. Затем клетки подвергали разрушению при помощи литического фермента папаина (0,1 мас.%) в течение 3 часов при температуре +42°С. Полученный ферментативный лизат клеток B.subtilis смешивали с ГСМ, цеолитом и СК. Перед смешиванием ГСМ и цеолит подвергали стерилизации сухим жаром. В результате был получен препарат следующего состава (мас.%): лизат клеток - 0,5; ГСМ - 20,2; цеолит - 78,2; СК - 1,0; литические ферменты - 0,1. Выход конечного продукта 180±5 кг.

Пример 3. Микроорганизмы B.subtilis штамм ТПИ 13-07.06.21-ДЕП/ВГНКИ выращивали методом поверхностного культивирования. После окончания процесса культивирования проводили механическое отделение клеток от культуральной среды. Затем клетки подвергали разрушению при помощи литического фермента пепсина (0,2 мас.%) в течение 6 часов при температуре +35°С. Полученный ферментативный лизат клеток B.subtilis смешивали с ГСМ, цеолитом и СК. Перед смешиванием ГСМ и цеолит подвергали стерилизации в автоклаве. В результате был получен препарат следующего состава (мас.%): лизат клеток - 1,65; ГСМ - 16,8; цеолит - 80,0; СК - 1,5; литические ферменты - 0,05. Выход конечного продукта 215±5 кг.

Пример 4. Микроорганизмы B.subtilis штамм ВКПМ №В4759 (3) выращивали методом поверхностного культивирования. После окончания процесса культивирования проводили отделение клеток от культуральной среды сепарацией. Затем клетки подвергали разрушению при помощи литического фермента нейтральной протеазы (2,08 мас.%) в течение 4 часов при температуре +37°С. Полученный ферментативный лизат клеток B.subtilis смешивали с ГСМ, цеолитом и СК. Перед смешиванием ГСМ и цеолит подвергали стерилизации сухим жаром. В результате был получен препарат следующего состава (мас.%): лизат клеток - 1,3; ГСМ - 25,0; цеолит - 72,4; СК - 0,5; литические ферменты - 0,8. Выход конечного продукта 140±5 кг.

Пример 5. Микроорганизмы смешанной культуры Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (культура Yo-Flex® для производства йогурта, компания Christian Hansen/Дания) выращивали методом глубинного культивирования. После окончания процесса культивирования проводили отделение клеток от культуральной среды сепарацией. Затем клетки подвергали разрушению при помощи литического фермента трипсина (2,1 мас.%) в течение 4 часов при температуре +37°С. Полученный ферментативный лизат клеток Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus смешивали с ГСМ, цеолитом и СК. Перед смешиванием ГСМ и цеолит подвергали стерилизации сухим жаром. В результате был получен препарат следующего состава (мас.%): лизат клеток - 2,5; ГСМ - 20,5; цеолит - 74,6; СК - 1,2; ферменты - 1,2. Выход конечного продукта 170±5 кг.

Пример 6. Микроорганизмы B.subtilis штамм ВКПМ №В4759 (3) выращивали методом поверхностного культивирования. После окончания процесса культивирования проводили отделение клеток от культуральной среды сепарацией. Затем клетки подвергали разрушению при помощи литического фермента Биопрон (Нагасэ/Япония - 1,1 мас.%) в течение 10 часов при температуре +37°С. Полученный ферментативный лизат продуцента B.subtilis смешивали с ГСМ, цеолитом и СК. Перед смешиванием ГСМ и цеолит подвергали стерилизации сухим жаром. В результате был получен препарат следующего состава (мас.%): лизат клеток - 0,1; ГСМ - 22,4; цеолит - 76,0; СК - 1,0; литические ферменты - 0,50. Выход конечного продукта 140±5 кг.

Пример 7. Микроорганизмы смешанной культуры Lactococcus lactis подвиды lactis и cremoris, Leuconostoc mesenteroides подвид cremoris и Leuconostoc pseudomesenteroides (культура eXact® для производства сметаны, творога и сыра, компания Christian Hansen/Дания) выращивали методом глубинного культивирования. После окончания процесса культивирования проводили отделение клеток от культуральной среды микрофильтрацией. Затем клетки подвергали разрушению при помощи литического фермента химотрипсина (0,28 мас.%) в течение 2 часов при температуре +32°С. Полученный ферментативный лизат клеток смешивали с ГСМ, цеолитом и СК. Перед смешиванием ГСМ и цеолит подвергали стерилизации сухим жаром. В результате был получен препарат следующего состава (мас.%): лизат клеток - 0,08; ГСМ - 24,0; цеолит - 73,9; СК - 1,5; литические ферменты - 0,52. Выход конечного продукта 185±5 кг.

Пример 8. Микроорганизмы B.subtilis штамм ТПИ 9 выращивали методом глубинного культивирования. После окончания процесса культивирования проводили отделение клеток от культуральной среды микрофильтрацией. Затем клетки подвергали разрушению при помощи протеолитического фермента кислой протеазы (1,2 мас.%) в течение 2 часов при температуре +32,0°С. В получаемый продукт вносили протеолитический бактериальный препарат Протозайм МН (фирма «Danisco», Нидерланды) - 1,5 мас.% и амилолитический бактериальный препарат Зимаджунт НТ340 (фирма «Enmex», Мексика) - 2,0 мас.%. Полученный ферментосодержащий лизат клеток B.subtilis смешивали с ГСМ, цеолитом и СК. Перед смешиванием ГСМ и цеолит подвергали стерилизации сухим жаром. В результате был получен препарат следующего состава (мас.%): лизат клеток - 0,02; ГСМ - 25,0; цеолит - 70,0; СК - 1,48; ферменты - 3,5. Выход конечного продукта 180±5 кг.

Пример 9. Микроорганизмы смешанной культуры Lactobacillus acidophilus, Bifldobacterium lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, Bifidobacterium longum, Lactobacillus casei и Lactobacillus rhamnosus (культура Nu-Trish® для производства широкого ассортимента биопродуктов, компания Christian Hansen/Дания) выращивали методом глубинного культивирования. После окончания процесса культивирования проводили механическое отделение клеток от культуральной среды. Затем клетки подвергали разрушению при помощи панкреатина (0,5 мас.%) в течение 2 часов при температуре +20°С. В получаемый продукт вносили протеолитический бактериальный препарат Нейтраза (фирма «Novozymes», Дания) - 1,5 мас.% и амилолитический бактериальный препарат Ликвамил (фирма «Genencor», США) - 1,1 мас.%. Полученный ферментативный лизат клеток смешивали с ГСМ, цеолитом и СК в следующих соотношениях (мас.%): лизат клеток - 0,95; ГСМ - 15,0; цеолит - 80,0; СК - 1,45. Перед смешиванием ГСМ и цеолит подвергали стерилизации сухим жаром. Выход конечного продукта 160±5 кг.

Пример 10. Микроорганизмы Saccharomyces cerevisiae, раса 9 выращивали методом глубинного культивирования. После окончания процесса культивирования проводили механическое отделение клеток от культуральной среды. Затем клетки подвергали разрушению при помощи протеолитической композиции ферментов дрожжевых катепсинов (0,23 мас.%) в течение 10 часов при температуре 50°С. В получаемый продукт вносили протеолитический бактериальный препарат Протосубтилин Г3x - 1 мас.% и амилолитический бактериальный препарат Амилосубтилин Г3х - 0,45 мас.%. Полученный ферментативный лизат клеток S.cerevisiae смешивали с ГСМ, цеолитом и СК в следующих соотношениях (мас.%): лизат клеток - 0,05; ГСМ - 21,3; цеолит - 76,0; СК - 1,2. Перед смешиванием ГСМ и цеолит подвергали стерилизации сухим жаром. Выход конечного получаемого продукта 195±5 кг.

Пример 11. Изучение воздействия компонентного состава заявляемого средства на ингибирование роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры.

В таблице 1 приведены результаты влияния одинаковых доз препаратов (500 мг), полученных на основе заявляемого средства и препарата аналога, введенных в мясопептонный агар (МПА), на ингибирование роста Sh.sonnei и S.aureus 1479. Представленные результаты показывают, что, практически, во всех случаях происходит более эффективное ингибирование роста указанных микроорганизмов по сравнению с препаратом аналогом. Вместе с тем, при введении в МПА препарата, полученного по примеру №6 в следующих соотношениях компонентов (мас.%): лизат - 0,10; цеолит - 76,0; ГСМ - 22,4; литические ферменты - 0,50 и СК - 1,0, обеспечивается максимальное ингибирование роста Sh.sonnei (20,9 мм) и S.aureus 1479 (26,6 мм). В дальнейшем исследования проводились на препарате вышеуказанной рецептуры, получившей условное наименование «СЛ08».

Необходимо отметить наличие близких по величине эффектов ингибирования роста бактерий Sh.sonnei и S.aureus 1479 на МПА, которые были получены при введении в состав заявляемого средства лизатов других микроорганизмов. Следовательно, реализация технологии получения заявляемого средства на основе ферментативного лизата клеток различных видов микроорганизмов позволяет создать сходные по компонентному составу метаболитные препараты, обладающие как пробиотическими, так и пребиотическими свойствами.

Таблица 1
Влияние компонентных составов заявляемого средства и препарата-аналога на рост микроорганизмов на среде МПА
№ примера	Состав заявляемого средства, мас.%	Зона угнетения роста Sh.sonnei через 24 ч, мм	Зона угнетения роста S.aureus 1479 через 24 ч, мм
Лизат	Цеолит	ГСМ	Литические ферменты	СК
1	0,25	78,0	20,0	0,75	1,0	18,2	25,7
2	0,5	78,2	20,2	0,10	1,0	19,2	18,2
3	1,65	80,0	16,8	0,05	1,5	18,5	19,3
4	1,3	72,4	25,0	0,80	0,5	17,4	22,2
5	2,5	74,6	20,5	1,2	1,2	19,8	25,6
6	0,10	76,0	22,4	0,50	1,0	20,9	26,6
7	0,08	73,9	24,0	0,52	1,5	20,2	24,1
8	0,02	70,0	25,0	3,5	1,48	16,4	24,7
9	0,95	80,0	15,0	2,6	1,45	16,7	24,9
10	0,05	76,0	21,3	1,45	1,2	19,4	25,6
Препарат-аналог (оптимальный состав для сравнения)
-	СКЖ 1,0	78	20	-	1,0	16,7	24,2

Пример 12. Сопоставление компонентного состава заявляемого средства и препарата-аналога «Бактистатин»

Анализировали состав образцов заявляемого средства, полученного по примеру №1, и препарата-аналога (ПА) при одинаковом содержании в нем (мас.%): цеолита - 78, ГСМ - 20,0 и СК - 1,0. В таблице 2 представлены результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии анализа веществ в образцах, содержащих ферментативный лизат клеток продуцента (ФЛКП, заявляемое средство) и СКЖ (Бактистатин). В таблице 3 показано содержание БАВ в конечных продуктах (готовых субстанциях) заявляемого средства и препарата-аналога «Бактистатин».

Таблица 2
Содержание БАВ в стерилизованной культуральной жидкости (СКЖ) и в ферментативном лизате клеток продуцента (ФЛКП)
Наименование анализируемых показателей	СКЖ	ФЛКП
Содержание белка*, мкг/см-3	541,5	496,0
Протеолитическая активность (ПА), ед. ПА, дм-3	8,7	2,2
Амилолитическая активность (АА), ед. АА, дм-3	42,7	19,2
Суммарная концентрация общих аминокислот, мкг/см-3	568,8	2540
Суммарная концентрация свободных аминокислот, мкг/см-3	60,8	357,0
Концентрация гексозаминов, мкг/см-3	104,9	92,1
Концентрация глюкозаминов, мкг/см-3	95,6	87,1
Концентрация диаминопимелиновой кислоты, мкг/см-3	19,6	7,6
Концентрация аденина / Ха**, мкг/см-3	12,2/3,2	20,8/0,2
Концентрация гуанина / Хг**, мкг/см-3	0/16,3	0,6/5,7
Концентрация тимина / Хт**, мкг/см-3	8,2/0	6,2/1,0
Концентрация урацила / Ху**, мкг/см-3	11,4/8,6	4,7/1,6
Концентрация цитозина / Хц**, мкг/см-3	0,0/12,1	0,0/3,9
Примечания: *содержание белка определяли по методу Лоури; **Ха, Хг, Хт, Ху, Хц - неидентифицированные производные аденина, гуанина, тимина, урацила и цитозина в пересчете на основное вещество.

Таблица 3
Содержание БАВ в конечных субстанциях препарата-аналога «Бактистатин» и заявляемого средства
Наименование анализируемых показателей	Препарат «Бактистатин»	Заявляемое средство
Протеолитическая активность (ПА), ед. ПА/г	2,00	1,8
Амилолитическая активность (АА), ед. АА/г	30,20	21,2
Суммарная концентрация общих аминокислот, мг/г	109,00	610,00
Суммарная концентрация свободных аминокислот, мг/г	2,06	12,5
Концентрация общих гексозаминов, мг/г	50,2	62,3
Концентрация общих глюкозаминов, мг/г	45,6	41,2
Концентрация диаминопимелиновой кислоты, мкг/г	2,90	2,01
Концентрация свободного/связанного аденина, мг/г	0,02/0,26	0,26/0,20
Концентрация свободного/связанного гуанина, мг/г	0,00/1,03	0,10/2,02
Концентрация свободного/связанного тимина, мг/г	0,47/0,00	3,01/0,09
Концентрация свободного/связанного урацила, мг/г	0,08/1,06	0,35/0,11
Концентрация свободного/связанного цитозина, мг/г	0,00/1,82	0,00/1,15

Анализ результатов хроматографического анализа веществ, содержащихся как в образцах ФЛКП и СКЖ (таблица 2), так и в конечных готовых субстанциях препаратов (таблица 3) показывают, что в составе действующего начала заявляемого средства находятся все основные группы биохимических соединений, которые были обнаружены в действующем начале препарата-аналога «Бактистатин». При этом содержание нуклеиновых оснований (продукты расщепления нуклеиновых кислот), диаминопимелиновой кислоты и гексозаминов (продукты расщепления клеточной стенки продуцента), а также аминокислот (продукты расщепления клеточного белка) в составе заявляемого средства существенно выше, что свидетельствует о большей биологической ценности последнего. Кроме того, при получении заявляемого средства на основе ферментативного лизата клеток B.subtilis обеспечивается постоянство компонентного состава продукта за счет контролируемой концентрации вегетативных форм клеток данного микроорганизма при их обработке литическими ферментами, что в последующем также исключает возможность появления в конечной субстанции живых клеток.

Пример 13. Оценка иммунотропных эффектов заявляемого средства и препарата-аналога

Функциональная активность врожденного иммунитета неспецифична и реализуется за счет: механической защиты (кожа, слизистые оболочки); фагоцитоза; разрушения инфицированных клеток (комплемент, естественные киллеры); секреции цитокинов (интерферон, интерлейкины); синтеза антибактериальных пептидов, хемокинов и т.д. [Пальцев М.А., Онищенко Г.Г., Зверев В.В., Иванов А.А. и др. Биологическая безопасность./ М. Медицина.: 2006; 220-238; Pirofski L.A., Casadevall A. Immunomodulators as an antimicrobial tool. Curr. Opin. Microbiol. 2006; 9: 489-495; Cristofaro P., Opal S.M. Role of Toll-like receptors in infection and immunity: clinical implications. Drugs. 2006; 66: 15-29.]. Для активации этой системы могут использоваться как иммунотропные препараты микробного происхождения, содержащие лизаты микробных тел, так и частично очищенные клеточные элементы (липополисахариды, пептидогликаны) или биологически активные фрагменты, полученные путем синтеза (мурамилдипептид, глюкозаминмурамилдипептид). Применение таких препаратов позволяет активировать неспецифические факторы иммунитета, которые также принимают участие в формировании антиинфекционной защиты организма.

Была проведена оценка изменений факторов неспецифического иммунитета на фоне энтерального введения в организм заявляемого средства «СЛ08», полученного по примеру №6, и препарата-аналога «Бактистатин». Для решения поставленной задачи определяли функциональную активность факторов неспецифической резистентности организма при различной продолжительности введения заявляемого средства и препарата-аналога.

Исследования проведены на белых беспородных мышах-самцах массой 16-18 г, полученных из питомника «Рапполово». В процессе эксперимента животных распределили на две группы и содержали в стандартных условиях на полноценном рационе питания. Первой группе животных энтерально вводили «СЛ08» по следующей схеме: 1 раз в сутки, доза - 1,5 мг/мышь, продолжительность введения - 1, 5, 10 и 20 дней. Второй группе животных энтерально вводили Бактистатин по аналогичной схеме. До введения препаратов, а также на следующий день после окончания соответствующей продолжительности их курсового введения у животных обеих групп проводили взятие крови для оценки динамики изменений факторов неспецифической резистентности. При этом определяли следующие показатели: переваривающую активность гранулярных лейкоцитов, концентрации лизоцима и миелопероксидазы.

Переваривающую активность гранулярных лейкоцитов периферической крови животных оценивали следующим образом. Для этого от каждого животного соответствующей группы производили взятие крови в центрифужную пробирку, содержавшую 0,1 мл раствора гепарина в разведении 1:10. Для исключения свертывания крови полученную суспензию тщательно перемешивали. Общий объем суспензии составлял 1,0 мл. Затем в пробирку вносили 0,1 мл тест-объекта фагоцитоза - односуточную культуру M.lysodeicticus в концентрации 10⁹ КОЕ/мл, выращенную на мясопептонном агаре при температуре 37,0°С. Полученную смесь крови с тест-объектом помещали в термостат на 15 минут. По истечении этого времени делали мазок крови на предметном стекле. После этого пробирку с кровью снова помещали в термостат на 15 минут. По истечении этого времени делали еще один мазок крови на предметном стекле. Мазки высушивали при комнатной температуре, фиксировали в 96° этаноле и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Мазки просматривали в световом микроскопе под иммерсией (объектив ×40).

В мазках, полученных, соответственно, через 15 и 30 мин, подсчитывали на 100 гранулоцитов количество фагоцитирующих клеток, содержащих 1 или более поглощенных объектов фагоцитоза. В качестве оцениваемого показателя определяли индекс переваривания (ИП), представляющий собой отношение количества фагоцитирующих клеток в мазке через 30 мин инкубации крови с тест-объектом фагоцитоза к количеству фагоцитирующих клеток в мазке через 15 мин инкубации крови с тест-объектом фагоцитоза. Значения ИП определяли по формуле:

где А - количество фагоцитирующих клеток на 100 просчитанных в мазке гранулярных лейкоцитов, поглотивших тест-объект в течение 15 мин инкубации; В - количество фагоцитирующих клеток на 100 просчитанных в мазке гранулярных лейкоцитов, поглотивших тест-объект в течение 30 мин инкубации. При удовлетворительном функционировании гранулярных лейкоцитов периферической крови значения ИП всегда >1. Эту величину выражали в относительных единицах (о.е.).

Концентрацию лизоцима в сыворотке крови определяли следующим образом. Кровь от животного собирали в центрифужную пробирку и получали сыворотку. Далее, 0,1 мл сыворотки крови переносили в бактериологическую пробирку, в которую добавляли 0,9 мл физиологического раствора. Полученную смесь перемешивали и к ней добавляли 1,5 мл суспензии тест-объекта (культуры M.lysodeicticus), которую предварительно стандартизовали на ФЭК-56М до экстинкции 0,66 (против зеленого светофильтра №6). Тест-объект выращивали на мясопептонном агаре в течение 24 ч в термостате при температуре +37,0°С. Готовую суспензию, содержащую тест-объект и исследуемую сыворотку, перемешивали и помещали в термостат на 30 мин при температуре +37,0°С. По завершении времени инкубации пробирки с материалом вынимали из термостата и определяли его экстинкцию на ФЭК-56М. Полученные в ходе определения величины экстинкции с помощью специиальных таблиц переводили в значения, характеризующие концентрацию лизоцима в сыворотке крови, и выражали в мкг/мл.

Уровень миелопероксидазы в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом. Кровь от животного собирали в центрифужную пробирку и получали сыворотку. Затем 0,1 мл сыворотки крови переносили в лунку с плоским дном панели для ИФА и в эту же лунку вносили 0,1 мл 5% раствора бензидина. В контрольную лунку вместо исследуемой сыворотки вносили 0,1 мл физиологического раствора. Исследуемые пробы аккуратно перемешивали в планшетах и помещали в термостат на 60 мин при температуре 37,0°С. По окончании времени инкубации планшеты доставали из термостата и просматривали на вертикальном спектрофотометре фирмы «Dynatech» при длине волны 492 нм. Концентрацию миелопероксидазы в сыворотке крови получали в единицах экстинкции и выражали в единицах активности (ЕА/мл).

Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с помощью пакета анализа данных, включенного в электронные таблицы Excel. При этом использовали однофакторный дисперсионный анализ с фиксированными эффектами [Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. СПб.; ВМедА: 2005; 292.; Медик В.А., Токмачев М.С., Фишман Б.Б. Статистика в медицине и биологии./ Под ред. Ю.М. Комарова. T.1. Теоретическая статистика. М.: 2000; 412].

В таблице 4 представлены результаты сравнительной оценки динамики изменений факторов неспецифической резистентности у животных первой и второй группы при различной продолжительности энтерального введения заявляемого средства и препарата-аналога. Анализ результатов показывает, что динамика изменений значения факторов неспецифической резистентности животных первой и второй группы на фоне введения указанных препаратов практически идентична. Об этом свидетельствует отсутствие статистически значимых различий (Р>0,05) между значениями исследуемых факторов, регистрируемых у животных двух групп через 1, 5, 10 и 20 дней после введения заявляемого средства и препарата-аналога.

Вместе с тем, динамика развития изменений факторов неспецифического иммунитета у животных двух групп по отношению к фону (контрольные значения факторов до введения препаратов) имеет статистически значимые различия (Р<0,05). Это свидетельствует о достоверном повышении функциональной активности факторов неспецифического иммунитета у животных на фоне энтерального введения заявляемого средства и препарата-аналога.

Максимальная активность факторов неспецифической резистентности у двух групп животных отмечается на 5-10 день после введения препаратов. Затем, на 20 сутки применения препаратов происходит снижение функциональной активности этих показателей. Возможно, что при продолжительном введении препаратов (более 20 дней) начинают развиваться иммунодепрессивные эффекты, которые объясняются невозможностью бесконечной стимуляции как всей системы иммунитета, так и ее отдельных компонентов. Одинаковая динамика развития степени выраженности и направленности изменений факторов неспецифического иммунитета у животных, которым энтерально вводили заявляемое средство и препарат-аналог, а также сходство компонентного состава данных препаратов доказывают возможность использования заявляемого средства по показаниям, которые были приведены для препарата-аналога.

Таким образом, практическое применение заявляемого средства на основе ферментативного лизата продуцента Bacillus subtilis в виде лекарственного средства и/или пищевой добавки, получаемого по заявляемой технологии, является, по сравнению с препаратом-аналогом, более целесообразным.

Дальнейшая оценка возможности повышения функциональной активности указанных факторов неспецифического иммунитета была проведена на фоне энтерального введения в организм животных заявляемого средства, полученного по примеру №10, и препарата-аналога «Бактистатин». Для этого использовали аналогичную схему эксперимента (дозы препаратов, группы животных и т.д.), которая была представлена выше. Однако в этом случае продолжительность энтерального введения животным заявляемого средства и препарата-аналога составляла: 1, 5 и 10 дней. Кроме того, образцы вводимых препаратов имели основные различия по источникам получения микробных метаболитов, а также содержанию (мас.%) в их составе лизата клеток и литических ферментов (таблица 1).

Таблица 4
Факторы неспецифической резистентности животных при различной продолжительности энтерального введения заявляемого средства и препарата-аналога
Названия факторов неспецифической резистентности	Длительность введения препаратов животным, сутки/дни	Значения факторов при введении «СЛ08»	Значения факторов при введении Бактистатина
Индекс переваривающей активности гранулярных лейкоцитов, относительные единицы, о.е.	0 фон, контроль	1,21±0,015δ=0,05 (N=12)	1,21±0,015δ=0,05 (N=12)
1
5
10
20
Концентрация лизоцима в сыворотке крови, мкг/мл	0 фон, контроль	6,95±0,025δ=0,50 (N=12)	6,95±0,025δ=0,50 (N=12)
1
5
10
20
Концентрация миелопероксидазы в сыворотке крови, ЕА/мл	0 фон, контроль	1,57±0,10δ=0,063 (N=12)	1,57±0,10δ=0,063 (N=12)
1
5