Синтетическая молекула нуклеиновой кислоты (варианты), экспрессионный вектор для клеток млекопитающего, клетка млекопитающего хозяина и способ экспрессии человеческого белка антигена эпидермального фактора роста-2 (her2/neu) или его укороченной формы

Синтетическая молекула нуклеиновой кислоты (варианты), экспрессионный вектор для клеток млекопитающего, клетка млекопитающего хозяина и способ экспрессии человеческого белка антигена эпидермального фактора роста-2 (her2/neu) или его укороченной формы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в общем случае относится к терапии рака. Более конкретно, настоящее изобретение относится к синтетическим полинуклеотидам, кодирующим человеческий ассоциированный с опухолью полипептидный антиген эпидермального фактора роста 2/neu, обозначенный в настоящем описании hHER2.opt, причем полинуклеотиды являются кодон-оптимизированными для экспрессии в клеточной среде человека. Настоящее изобретение также относится к синтетическим полинуклеотидам, кодирующими укороченную форму антигена HER2/neu, в настоящем описании обозначенную как hHER2ECDTM.opt, причем полинуклеотиды являются кодон-оптимизированными для экспрессии в клеточной среде человека. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам и хозяевам, содержащим указанные синтетические полинуклеотиды. Настоящее изобретение также предоставляет аденовирусные векторные и плазмидные конструкции, несущие hHER2.opt, и их использование в вакцинах и фармацевтических композициях для профилактики и лечения рака.

Уровень техники

Эпидермальный фактор роста-2 представляет собой трансмембранный ассоциированный с опухолью антиген, кодируемый HER2/neu протоонкогеном (также называемым c-erbB-2), который является членом семейства рецепторов эпидермального фактора роста рецепторов клеточной поверхности. Ген HER2 первоначально был выделен из нейроглиобластомы крысы (Shih et al., Nature 290:261-264 (1981)), а позже клонирован и описан из человеческих клеток (Coussens et al., Science 230:1132-39(1985); King et al., Science 229:974-76 (1985)).

Кроме того, HER2/neu классифицирован как член семейства HER рецепторных тирозинкиназ, которые состоят из четырех рецепторов, принимающих участие в регуляции клеточного роста и дифференцировке. Рецепторы HER способствуют поддержанию нормального роста клеток путем связывания лигандов фактора роста в виде димеров. В частности, человеческий HER2 формирует гетеродимеры с другими членами семейства EGFR (HER1, HER3 и HER4) (Klapper et al., Adv Cancer Res 77:25-79 (2000)). После димеризации hHER2 и автофосфорилирования тирозина генерируются сайты сцепления для цитоплазматических сигнальных молекул и инициируется рекрутирование вторичных сигнальных молекул. Таким образом, инициируются каскады внутриклеточной сигнализации, которые в результате приводят к активации генов, играющих важную роль в росте клетки.

Низкие уровни экспрессии транскрипта HER2/neu и кодированного белка 185 кДа обычно детектируют во взрослых эпителиальных клетках различных тканей, включая кожу, и молочную железу, и ткани желудочно-кишечного тракта, половых путей и мочеполового тракта (Press et al., Oncogene 5:953-962 (1990)). Более высокие уровни экспрессии HER2/neu также детектируют в соответствующих эмбриональных тканях во время эмбрионального развития (Press et al., см. выше).

Некоторые исследования позволяют рассматривать антиген HER2 в качестве привлекательной мишени для активной специфической иммунотерапии. Во-первых, обычно происходит сверхэкспрессия или амплификация гена HER2/neu в различных злокачественных опухолях, таких как карциномы молочной железы, яичников, мочевого пузыря, толстой кишки и простаты, и аденокарцинома легких (см. Disis и Cheever, Adv. Cancer Research 71:343-371 (1997)). Сверхэкспрессия HER2/neu коррелирует с неблагоприятным прогнозом и с более высокой частотой рецидивов у раковых пациентов (Slamon et al., Science 244:707-712 (1989)). Амплификация человеческого HER2 приводит к увеличенной активности МАР-киназы и клеточной пролиферации и способствует агрессивному поведению раковых клеток (Ben-Levy et al., Embo J 13(14):3302-11 (1994)). Высокий уровень экспрессии HER2, наблюдаемый в клетках опухолей, является полной противоположностью низкому уровню, ассоциированному с нормальными зрелыми тканями.

Кроме того, многие раковые пациенты, страдающие от злокачественных опухолей, ассоциированных со сверхэкспрессией HER2/neu, имели иммунные ответы на белок HER2. Анти-hHER2 цитотоксические Т лимфоциты (CTL) были выделены у пациентов с раком молочной железы и яичников (Ioannides et al., Cell Immunol 151(1):225-34 (1993); Peoples et al., Proc Natl Acad Sci USA 92(14):6547-51 (1995)). Были определены некоторые HLA-A2.1-ассоциированные пептиды hHER2, и пептид-специфичные Т-клетки могут быть генерированы in vitro (Fisk et al., Cancer Res 57(1):8-93 (1997); Yoshino et al., Cancer Res 54(13):3387-90 (1994); Lustgarten et al., Hum Immunol 52(2):109-18 (1997)).

Вышеуказанные данные демонстрируют, что у раковых пациентов активируются анти-ErbB-2 иммунные эффекторные механизмы, и подчеркивают потенциальное преимущество усиления такой иммунной реактивности. Эффективная вакцина, вызывающая иммунный ответ к HER2/neu, должна как усиливать такую невосприимчивость к уровню, который является защитным и/или профилактическим, так и преодолевать самотолерантность.

Исходя из вышеперечисленного, HER2/neu был исследован в качестве мишени при разработке иммунологической терапии злокачественных опухолей. Анти-HER2 моноклональные антитела исследовали как средства терапии рака молочной железы, при этом подходы с использованием каждого из антител демонстрировали различные уровни успеха (обсуждение см. Yarden, Oncology 61 (suppl 2):1-13 (2001)).

Кроме того, сообщалось о вакцинах на основе пептидов и ДНК, нацеленных на HER2/neu. Amici et al. (патент США 6127344) раскрыли способ индуцирования иммунитета к HER2/neu путем введения вектора экспрессии, содержащего кДНК человеческого HER2/neu полной длины, функционально связанную с промотором цитомегаловируса человека. Morris et al. (WO 2004/041065) раскрывают способ вакцинации дендритными клетками, модифицированными аденовирусными векторами, экспрессирующими несигнальный ген HER2/neu. Cheever и Disis раскрывают способы иммунизации людей пептидами HER2 против HER2/neu-ассоциированных видов рака (патент США 5846538). Кроме того, вакцины на основе пептидов HER2/neu были изучены на моделях грызунов (например, см. Disis and Cheever, Adv. Cancer Res. 71:343-71 (1997)).

Развитию и коммерциализации многих вакцин препятствовали трудности, связанные с получением высоких уровней экспрессии экзогенных генов в успешно трансформированных организмах хозяев. Следовательно, несмотря на идентификацию нуклеотидных последовательностей дикого типа, кодирующих белок hHER2, описанный выше, была бы крайне желательной разработка легко воспроизводимого источника человеческого белка HER2, который использует hHER2-кодирующие нуклеотидные последовательности, оптимизированные для экспрессии в предполагаемой клетке хозяина, причем указанный источник предоставляет возможность для разработки противораковой вакцины, которая является эффективной и которой не препятствует самотолерантность.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для выработки или усиления иммунитета к белковым продуктам, экспрессируемым геном человеческого HER2, который ассоциирован с многочисленными видами аденокарциномы, включая рак молочной железы и яичников. В частности, настоящее изобретение предоставляет полинуклеотиды, кодирующие человеческий белок HER2 или укороченную форму человеческого белка HER2, который содержит внеклеточный и трансмембранный домены белка HER2 (далее в настоящем описании hHER2ECDTM), причем указанные полинуклеотиды являются кодон-оптимизированными для экспрессии высокого уровня в человеческой клетке. Настоящее изобретение также предоставляет аденовирусные вектора и вектора на основе плазмид, содержащие синтетические полинуклеотиды, и раскрывает применение указанных векторов в иммуногенных композициях и вакцинах для профилактики и/или лечения HER2-ассоциированного рака. Полинуклеотиды, раскрытые в настоящем описании, являются более эффективными, чем полинуклеотиды HER2 дикого типа, в выработке клеточного и гуморального иммунного ответа на человеческий HER2.

Настоящее изобретение также относится к синтетическим молекулам нуклеиновых кислот (полинуклеотидам), содержащим последовательность нуклеотидов, которые кодируют человеческий антиген эпидермального фактора роста-2 (далее в настоящем описании hHER2), как представлено в SEQ ID NO:2, причем синтетические молекулы нуклеиновых кислот являются кодон-оптимизированными для экспрессии высокого уровня в человеческой клетке (далее в настоящем описании hHER2.opt). Настоящее изобретение также относится к синтетическим молекулам нуклеиновых кислот (полинуклеотидам), содержащим последовательность нуклеотидов, которые кодируют человеческий HER2ECDTM, как представлено в SEQ ID NO:14, причем синтетические молекулы нуклеиновых кислот являются кодон-оптимизированными для экспрессии высокого уровня в человеческой клетке. Молекулы нуклеиновых кислот, раскрытые в настоящем описании, могут быть трансфицированы в выбранную клетку хозяина, причем рекомбинантная клетка хозяина обеспечивает источник для значительных уровней экспрессированного функционального белка hHER2 (SEQ ID NO:2) или белка hHER2ECDTM (SEQ ID NO:14).

Настоящее изобретение также относится к синтетической молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мРНК, которая экспрессирует человеческий белок HER2. Предпочтительный аспект этой части настоящего изобретения раскрыт на фиг.1, на которой показана молекула ДНК (SEQ ID NO:1), кодирующая белок hHER2 (SEQ ID NO:2). Предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является кодон-оптимизированной для экспрессии высокого уровня в человеческой клетке. Последовательность такого предпочтительного полинуклеотида также содержит мутацию, которая подавляет активность тирозинкиназы (AAA2257GCC, K753A). Нуклеотидные последовательности, которые не содержат такую мутацию, также входят в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к синтетической молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мРНК, которая экспрессирует человеческий белок HER2ECDTM. Предпочтительный аспект этой части настоящего изобретения раскрыт на фиг.6А, на которой показана молекула ДНК (SEQ ID NO:9), которая кодирует белок hHER2ECDTM (SEQ ID NO:14). Предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения является кодон-оптимизированной для экспрессии высокого уровня в человеческой клетке.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам и рекомбинантным клеткам хозяина, как прокариотическим, так и эукариотическим, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, раскрытых в настоящем описании.

Настоящее изобретение также относится к способу экспрессии кодон-оптимизированного человеческого белка HER2 в рекомбинантной клетке хозяина, предусматривающему: (а) введение вектора, содержащего синтетический полинуклеотид, кодирующий человеческий белок HER2, в подходящую клетку хозяина, причем синтетический полинуклеотид является кодон-оптимизированным для оптимальной экспрессии в человеческой клетке; и (b) культивирование клетки хозяина в условиях, которые предоставляют возможность для экспрессии указанного человеческого белка HER2.

Настоящее изобретение также относится к способу экспрессии кодон-оптимизированного человеческого белка HER2ECDTM в рекомбинантной клетке хозяина, предусматривающему: (а) введение вектора, содержащего синтетический полинуклеотид, кодирующий человеческий белок HER2ECDTM, в подходящую клетку хозяина, причем синтетический полинуклеотид является кодон-оптимизированным для оптимальной экспрессии в человеческой клетке; и (b) культивирование клетки хозяина в условиях, которые предоставляют возможность для экспрессии указанного человеческого белка HER2ECDTM.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ профилактики или лечения рака, предусматривающий введение млекопитающему вакцинного вектора, содержащего синтетическую молекулу нуклеиновой кислоты, причем синтетическая молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, которая кодирует человеческий белок-антиген (hHER2) эпидермального фактора роста-2, как представлено в SEQ ID NO:2, или человеческий белок HER2ECDTM, как представлено в SEQ ID NO:14, причем синтетическая молекула нуклеиновой кислоты является кодон-оптимизированной для экспрессии высокого уровня в человеческой клетке.

Настоящее изобретение также относится к аденовирусному вакцинному вектору, содержащему аденовирусный геном с делецией в участке Е1 и вставку в участке Е1, причем вставка содержит кассету экспрессии, содержащую: (а) кодон-оптимизированный полинуклеотид, кодирующий человеческий белок HER2 или человеческий белок HER2ECDTM; и (b) промотор, функционально связанный с полинуклеотидом.

Настоящее изобретение также относится к вакцинной плазмиде, содержащей плазмидную часть и часть кассеты экспрессии, причем часть кассеты экспрессии содержит: (а) синтетический полинуклеотид, кодирующий человеческий белок HER2 или человеческий белок HER2ECDTM, причем синтетический полинуклеотид является кодон-оптимизированным для оптимальной экспрессии в человеческой клетке; и (b) промотор, функционально связанный с полинуклеотидом.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ защиты млекопитающего от рака или лечения млекопитающего, страдающего HER2-ассоциированным раком, предусматривающий: (а) введение млекопитающему первого вектора, содержащего: i) кодон-оптимизированный полинуклеотид, кодирующий человеческий белок HER2 или человеческий белок HER2ECDTM; и ii) промотор, функционально связанный с полинуклеотидом; (b) ожидание в течение заданного периода времени; и (с) введение млекопитающему второго вектора, содержащего: i) кодон-оптимизированный полинуклеотид, кодирующий человеческий белок HER2 или человеческий белок HER2ECDTM; и ii) промотор, функционально связанный с полинуклеотидом.

Как используется в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают в себя ссылку на формы множественного числа, если только контекстом четко не определено иное.

Как используется в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, употребляются нижеследующие определения и аббревиатуры:

Термин “промотор” относится к сайту узнавания на нити ДНК, с которой связывается РНК-полимераза. Промотор формирует инициирующий комплекс с РНК-полимеразой для инициации и управления транскрипционной активностью. Комплекс может быть модифицирован посредством активирующих последовательностей, называемых “энхансерами”, или посредством ингибирующих последовательностей, называемых “молчащими”.

Термин “кассета” относится к нуклеотидной или генной последовательности, которая должна быть экспрессирована из вектора, например нуклеотидная или генная последовательность, кодирующая белок HER2 или белок HER2ECDTM. В общем случае, кассета содержит генную последовательность, встроенную в вектор, который в некоторых вариантах осуществления предоставляет регуляторные последовательности для экспрессии нуклеотидной или генной последовательности. В других вариантах осуществления нуклеотидная или генная последовательность предоставляет регуляторную последовательность для своей экспрессии. В других вариантах осуществления вектор предоставляет некоторые регуляторные последовательности, а нуклеотидная или генная последовательность предоставляет другие регуляторные последовательности. Например, вектор может предоставлять промотор для транскрипции нуклеотидной или генной последовательности, а нуклеотидная или генная последовательность предоставляет последовательность терминации транскрипции. Регуляторные последовательности, которые могут быть предоставлены вектором, включают в себя, без ограничений, энхансеры, последовательности терминации транскрипции, акцепторную и донорную последовательности для сплайсинга, интроны, последовательности для связывания с рибосомой и дополнительные поли(А)-последовательности. Кассета в принципе аналогична кассетной ленте; каждая кассета имеет свою собственную последовательность. Таким образом, при смене кассеты вектор будет экспрессировать другую последовательность. Благодаря сайтам рестрикции на 5' и 3' концах кассета может быть легко вставлена, удалена или заменена другой кассетой.

Термин “вектор” относится к некоторым средствам, при помощи которых фрагменты ДНК могут быть введены в организм хозяина или ткань хозяина. Существуют различные типы векторов, включающие плазмиды, вирусы (включая аденовирусы), бактериофаги и космиды.

Термин “первая генерация”, как используется в отношении аденовирусных векторов, описывает указанные аденовирусные вектора, которые являются репликационно-дефектными. Первая генерация аденовирусных векторов обычно имеет делетированный или инактивированный участок гена Е1 и предпочтительно имеет делетированный или инактивированный участок гена Е3.

Обозначение “pV1J-hHER2.opt” относится к плазмидной конструкции, раскрытой в настоящем описании, содержащей ранний (IE) промотор ЦМВ человека с интроном А, кодон-оптимизированный ген человеческого HER2 полной длины, последовательности полиаденилирования и терминации транскрипции, выделенные из гормона роста крупного рогатого скота, и минимальную основу pUC (см. пример 2).

Обозначение “pV1J-hHER2ECDTM.opt” относится к плазмидной конструкции, раскрытой в настоящем описании, содержащей ранний (IE) промотор ЦМВ человека с интроном А, укороченный кодон-оптимизированный ген человеческого HER2, содержащий внеклеточный и трансмембранный домены гена HER2, последовательности полиаденилирования и терминации транскрипции, выделенные из гормона роста крупного рогатого скота, и минимальную основу pUC (см. пример 2).

Обозначение “pV1J-hHER2.wt” относится к конструкции, как описано выше, за исключением того, что данная конструкция содержит ген человеческого HER2 полной длины дикого типа вместо кодон-оптимизированного гена человеческого HER2.

Обозначение “pV1J-hHER2ECDTM.wt” относится к конструкции, как описано выше, за исключением того, что данная конструкция содержит укороченный ген человеческого HER2 дикого типа, причем указанный укороченный ген содержит последовательность нуклеотидов, которая кодирует внеклеточный и трансмембранный домены белка HER2, вместо кодон-оптимизированного гена человеческого HER2 полной длины.

Обозначения “MRKAd5-hHER2.opt”, “MRKAd5-hHER2ECDTM.opt” и “MRKAd5-hHER2.wt” относятся к трем конструкциям, раскрытым в настоящем описании, которые содержат Ad5 аденовирусный геном с делетированными участками Е1 и Е3. В конструкции “MRKAd5-hHER2.opt” участок Е1 замещен кодон-оптимизированным геном человеческого HER2 полной длины в направлении, параллельном Е1, под управлением промотора ЦМВ человека без интрона А, за которым следует сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота. Конструкция “MRKAd5-hHER2ECDTM.opt”, по существу, является такой, как описано выше, за исключением того, что участок Е1 генома Ad5 замещен кодон-оптимизированной укороченной версией гена человеческого HER2, причем укороченный ген HER2 содержит последовательность нуклеотидов, которая кодирует внеклеточный и трансмембранный домены рецептора HER2. Конструкция “MRKAd5-hHER2.wt”, по существу, является такой, как описано выше, за исключением того, что участок Е1 генома Ad5 замещен последовательностью человеческого HER2 дикого типа полной длины (см. пример 11).

Термин “эффективное количество” обозначает достаточное количество вакцинной композиции, которую вводят для продуцирования адекватных уровней полипептида для получения иммунного ответа. Специалистам в данной области техники известно, что этот уровень может изменяться.

Термин “лечение” относится как к терапевтическому, так и к профилактическому лечению или профилактике. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже имеет расстройства, а также тех, кто предрасположен к расстройствам, или тех, у кого расстройство должно быть предупреждено.

“Расстройство” представляет собой любое состояние, которое улучшается при лечении способами или вакцинами и иммуногенными композициями, раскрытыми в настоящем описании. Этот термин включает хронические и острые расстройства или заболевания, включающие такие патологические состояния, при которых млекопитающие имеют предрасположенность к рассматриваемому расстройству. Способы и вакцины настоящего изобретения предназначены для лечения расстройств или состояний, связанных с нарушенной HER2/neu-ассоциированной экспрессией или сигнализацией, включая, без ограничений, рак молочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, рак яичников и рак легких.

“Консервативная аминокислотная замена” относится к замещению одного аминокислотного остатка другим, химически аналогичным, аминокислотным остатком. Примеры таких консервативных замен представляют собой: замену одного гидрофобного остатка (изолейцина, лейцина, валина или метионина) другим; замену одного полярного остатка другим полярным остатком с таким же зарядом (например, аргинина лизином; глутаминовой кислоты аспарагиновой кислотой).

“hHER2.wt” и “hHER2.opt” относятся к человеческому антигену эпидермального фактора роста-2 и кодон-оптимизированному человеческому антигену эпидермального фактора роста-2 соответственно.

“hHER2ECDTM.wt” и “hHER2ECDTM.opt” относятся к укороченному человеческому антигену эпидермального фактора роста-2 и укороченному кодон-оптимизированному человеческому антигену эпидермального фактора роста-2 соответственно. Укороченные формы HER2, “hHER2ECDTM.wt” и “hHER2ECDTM.opt”, содержат внеклеточный и трансмембранный домены человеческого белка HER2.

Термин “млекопитающее” относится к любому виду млекопитающих, включая человека.

Аббревиатура “Ag” относится к антигену.

Аббревиатуры “Ab” и “mAb” относятся к антителу и моноклональному антителу соответственно.

Аббревиатура “ОРС” относится к открытой рамке считывания гена.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показана нуклеотидная последовательность кодон-оптимизированного полинуклеотида (hHER2.opt, SEQ ID NO:1), которая кодирует человеческий белок HER2. См. пример 1. На панели В показана установленная аминокислотная последовательность человеческого белка HER2 (SEQ ID NO:2).

На фиг.2 показана идентификация иммунодоминантных Т-клеточных эпитопов в человеческом белке HER2 при помощи анализа ELISPOT и внутриклеточного окрашивания (ICS). BALB/c мыши, иммунизированные Ad5-hHER2, были проанализированы на индуцирование человеческого HER2-специфичного клеточного иммунитета. Количество Т-клеток, секретирующих IFN-γ против человеческого HER2, определяли способом ELISPOT в спленоцитах из групп мышей (указанных в первом столбце) с использованием пулов или единичных пептидов. Отображенные данные являются репрезентативными для нескольких независимых экспериментов. Значения выражены в виде количества колоний, формирующих пятно, (SFC)/10⁶ общего количества спленоцитов за вычетом фоновых значений, определенных в отсутствие пептидов (обычно менее чем 10 SFC/10⁶ общего количества спленоцитов). Количества, более чем в три раза превышающие фон, измеренный в контрольных экспериментах без антигенных пептидов, рассматривались как положительные значения и указаны жирным шрифтом. Частоту Т- клеток CD4⁺ или CD8⁺, секретирующих IFN-γ, измеряли способом ICS. Отображенные данные являются репрезентативными для нескольких независимых экспериментов. Значения выражены в виде 1000×[(IFN-γ CD3⁺ и CD4⁺ или CD8⁺)/(CD3⁺ и CD4⁺ или CD8⁺)]. Значения, превышающие 1%, рассматривались как положительные и указаны жирным шрифтом. Последовательности, охваченные пулом или одиночным пептидом, используемые в исследованиях, указаны слева. Номера относятся к позиции аминокислотного остатка человеческого белка HER2.

На фиг.3 показана экспрессия in vitro hHER2 после трансфекции в (А) человеческие эмбриональные клетки HEK-293 почки и (В) мышиные миобласты С2С7. Данные выражены в виде среднего геометрического каналов флуоресценции за вычетом сигнала, генерируемого пустой плазмидой pV1JnsA. Для клеток С2С7 данные нормализованы по эффективности трансфекции pEGFP ДНК.

На фиг.4 показан иммунный ответ на человеческий HER2 у мышей BALB/c. На панели (А) показано, что кодон-оптимизированный HER2 давал значительно улучшенные значения ELISPOT в сравнении с HER2 дикого типа. Показаны результаты иммунизации четырех групп, каждая из которых содержит двух мышей, плазмидой pV1J-hHER2.wt или pV1J-hHER2.opt (50 мкг/дозу, введенной способом электроинъекции в четырехглавую мышцу). Спустя две недели после последней инъекции определяли частоту IFN-γ-секретирующих Т-клеток в мышиных спленоцитах с помощью анализа IFN-γ ELISPOT, используя пептиды hNeu15.3 (аа 63-71, включая эпитоп CD8⁺), hNeu301 (аа 1202-1214, включая эпитоп CD8⁺) и hNeu42 (аа 165-179, включая эпитоп CD4⁺). Показаны результаты из 2,5×10⁵ и 5×10⁵ спленоцитов с двумя репликами каждого протестированного количества. Средние значения вычислены путем вычитания фонового уровня, определенного в отсутствие пептидов (обычно менее чем 10 SFC/10⁶ общего количества спленоцитов). Результаты выражены в виде количества SFC/10⁶ общего количества спленоцитов. На панели (В) показано, что pV1J-hHER2.opt вырабатывает существенно улучшенный IgG1 и IgG2а гуморальный ответ в сравнении с pV1J-hHER2.wt. Образцы сыворотки собирали на 6 неделе (за день перед первой иммунизацией, предварительное взятие крови) и на 14 неделе (две недели спустя после последней инъекции) из групп, состоящих из 4 мышей, иммунизированных pV1J-hHER2.wt или pV1J-hHER2.opt плазмидной ДНК. Титры анти-hHER2 антител в объединенных сыворотках из каждой группы мышей измеряли при помощи ELISA, используя димерный внеклеточный домен hHER2 (HER2-ECD) в качестве целевого антигена. Для детектирования связанных мышиных антител использовали АР-конъюгированные козьи анти-мышиные IgG1 или IgG2а.

На фиг.5 показано сравнение р185-специфичного Т-клеточного ответа, вырабатываемого у мышей иммунизацией pV1J-HER2 и Ad5-HER2. Мыши BALB/c дикого типа и трансгенные мыши BALB/c, сверхэкспрессирующие крысиный HER2 (обозначенный как NeuT, см. Lucchini et al., Cancer Lett 64(3):203-9 (1992)), были иммунизированы в возрасте 6 и 9 недель либо pV1J-hHER2.wt ДНК (50 мкг/дозу, инъецированную в четырехглавую мышцу) с последующей электростимуляцией, либо Ad5-hHER2.wt. В возрасте 12 недель определяли количество IFN-γ-секретирующих анти- человеческих клеток с помощью анализа ELISPOT из пулов мышей, используя указанные пептиды. Отображенные данные являются репрезентативными для нескольких независимых экспериментов. Значения выражены так же, как на фиг.1.

На панели А фиг.6 показана нуклеотидная последовательность кодон-оптимизированного полинуклеотида (hHER2ECDTM.opt, SEQ ID NO:9), которая кодирует укороченный человеческий белок HER2, причем указанный белок содержит внеклеточный и трансмембранный домены белка HER2. На панели В показан второй полинуклеотид, который кодирует внеклеточный и трансмембранный домены белка HER2, причем второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность “дикого типа”, которая не была кодон-оптимизирована (hHER2ECDTM.wt, SEQ ID NO:10).

На фиг.7 показан результат анализа клеточно-опосредованного ответа, индуцированного у макаки-резус, иммунизированной смесью из трех плазмид, экспрессирующих человеческие антигены HER2, CEA и EpCAM, причем указанные плазмиды содержат нуклеотидные последовательности, которые являются кодон-оптимизированными для экспрессии высокого уровня в человеческих клетках. Те же самые животные затем были иммунизированы смесью трех Ad5 векторов, экспрессирующих последовательность дикого типа каждого из трех антигенов. Клеточно-опосредованный иммунный ответ, направленный против высокогомологичного (98,2% сходство последовательностей) белка HER2 макаки-резус, измеряли при помощи IFN-γ ELISPOT ежемесячно в течение одного года. Значения выражены в виде SFC/10⁶PBMC за вычетом фоновых значений, определенных в отсутствие пептидов. Значения, которые существенно отличались (р<0,05) от фона, как измеренные в контрольных экспериментах без антигенных пептидов, и превышали произвольным образом выбранное пороговое значение 55 SFC/10⁶PBMC, указаны жирным шрифтом.

На фиг.8 показано сравнение клеточно-опосредованного иммунного ответа, выработанного у мышей посредством иммунизации pV1J-hHER2.opt и pV1J-hHER2ECDTM.opt. Значения относятся к частоте IFN-γ-секретирующих клеток селезенки, как измерено при помощи ELISPOT. Отображенные данные получены от трех животных и являются репрезентативными для нескольких независимых экспериментов. Значения выражены в виде SFC/10⁶ общего количества клеток селезенки за вычетом фоновых значений, определенных в отсутствие пептидов (обычно менее чем 5 SFC/10⁶ клеток селезенки). Значения, которые существенно отличались (р<0,05) от фона, как измеренные в контрольных экспериментах без антигенных пептидов, и превышали произвольным образом выбранное пороговое значение 25 SFC/10⁶ клеток селезенки, указаны жирным шрифтом.

Подробное описание изобретения

Человеческий эпидермальный фактор роста-2 (hHER2) обычно ассоциирован с несколькими различными типами опухолей, включая карциномы молочной железы, яичников, желудка и толстой кишки. Настоящее изобретение относится к композициям и способам для выработки или усиления иммунитета к белковым продуктам, экспрессируемым геном hHER2, причем нарушенная экспрессия hHER2 ассоциирована с карциномой или ее развитием. Ассоциация нарушенной экспрессии hHER2 с карциномой не требует того, чтобы белок hHER2 экспрессировался в ткани опухоли постоянно во время ее развития, поскольку аномальная экспрессия hHER2 может присутствовать при инициации опухоли и не детектироваться позже во время развития опухоли или наоборот.

С этой целью предоставлены синтетические молекулы ДНК, кодирующие человеческий белок HER2 полной длины или укороченный человеческий белок HER2, называемый в настоящем описании как HER2ECDTM. Указанный укороченный HER2 содержит внеклеточный и трансмембранный домены человеческого белка HER2. Кодоны синтетических молекул ДНК разработаны таким образом, чтобы использовать кодоны, предпочтительные для предполагаемой клетки хозяина, которая в предпочтительных вариантах осуществления является человеческой клеткой. Синтетические молекулы могут быть использованы для разработки вакцин на основе плазмиды или рекомбинантного аденовируса, которые обеспечивают эффективную иммунопрофилактику против HER2-ассоциированного рака путем нейтрализации антитела и клеточно-опосредованного иммунитета. Синтетические молекулы могут быть использованы в виде иммуногенной композиции. Настоящее изобретение предоставляет полинуклеотиды, которые при прямом введении in vivo позвоночным, включая млекопитающих, таких как приматы и люди, индуцируют у животного экспрессию кодируемых белков.

Была опубликована нуклеотидная последовательность человеческого HER2 дикого типа (Coussens et al., Science 230:1132-39 (1985); King et al., Science 229:974-76 (1985)). Настоящее изобретение предоставляет синтетические молекулы ДНК, кодирующие человеческий белок HER2 полной длины или укороченный человеческий белок HER2, HER2ECDTM, содержащий внеклеточный и трансмембранный домены hHER2. Синтетические молекулы настоящего изобретения содержат последовательность нуклеотидов, причем, по меньшей мере, один из нуклеотидов изменен таким образом, чтобы использовать кодоны, предпочтительные для человеческой клетки, таким образом предоставляя возможность для экспрессии высокого уровня hHER2 или hHER2ECDTM в человеческой клетке хозяина. Синтетические молекулы могут быть использованы в качестве источника белка hHER2 или hHER2ECDTM, который может быть использован в противораковой вакцине для обеспечения эффективной иммунопрофилактики против hHER2-ассоциированных карцином путем нейтрализации антительного и клеточно-опосредованного иммунитета. В качестве альтернативы, синтетические молекулы могут быть использованы в качестве основы ДНК вакцины или аденовирусной вакцины.

“Триплет” кодон из четырех возможных нуклеотидных оснований может существовать в более чем 60 различных формах. Поскольку эти кодоны обеспечивают сообщение только для 20 различных аминокислот (а также инициацию и терминацию транскрипции), некоторые аминокислоты могут кодироваться более чем одним кодоном - явление, известное как вырожденность кодона. По неполностью понятым причинам альтернативные кодоны не представлены однообразно в эндогенной ДНК различных типов клеток. Фактически, оказывается, существует изменчивая природная иерархия или “предпочтение” для некоторых кодонов в специфических типах клеток. В качестве одного из примеров, аминокислота лейцин определяется любым из шести ДНК кодонов, включающих CTA, CTC, CTG, CTT, TTA и TTG. Исчерпывающий анализ частот геномных кодонов для микроорганизмов выявил, что эндогенная ДНК E.coli чаще всего содержит CTG лейцин-специфичный кодон, в то время как ДНК дрожжей и миксомицетов чаще всего включает TTA лейцин-специфичный кодон. С точки зрения этой иерархии обычно предполагают, что вероятность получения высоких уровней экспрессии полипептидов, богатых лейцином, при помощи хозяина E.coli до некоторой степени будет зависеть от частоты использования кодона. Например, существует вероятность того, что ген, богатый кодонами ТТА, будет недостаточно экспрессируемым в E.coli, тогда как ген, богатый CTG, возможно будет высокоэкспрессируемым в этом хозяине. Аналогично, предпочтительным кодоном для экспрессии полипептида, богатого лейцином, в дрожжевых клетках хозяина может быть ТТА.

Значение явления предпочтения кодона обнаружено при помощи методов рекомбинантной ДНК, и это явление может служить объяснением многих ранних неудач в достижении высоких уровней экспрессии экзогенных генов в успешно трансформированных организмах хозяев - менее “предпочтительный” кодон может быть неоднократно представлен в интересующем гене, и механизм клетки хозяина, реализующий экспрессию, может не работать также эффективно. Это явление предполагает, что синтетические гены, которые разработаны таким образом, что они включают кодоны, предпочтительные для предполагаемой клетки хозяина, обеспечивают оптимальную форму чужеродного генетического материала для применения методов рекомбинантных ДНК. Таким образом, одним из аспектов настоящего изобретения является ген человеческого HER2, который является кодон-оптимизированным для экспрессии высокого уровня в человеческой клетке. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения было обнаружено, что использование альтернативных кодонов, кодирующих такую же белковую последовательность, может устранить ограничения на экспрессию экзогенного белка hHER2 в человеческих клетках. Другим аспектом настоящего изобретения является укороченный ген человеческого HER2, hHER2ECDTM, который является кодон-оптимизированным для экспрессии высокого уровня в человеческой клетке хозяина, причем указанный укороченный ген HER2 содержит нуклеотидные последовательности, которые кодируют внеклеточный и трансмембранный домены человеческого HER2.

Согласно настоящему изобретению последовательность гена человеческого HER2 и последовательность гена человеческого HER2ECDTM были преобразованы в полинуклеотидные последовательности, имеющие идентичные транслируемые последовательности в сравнении с эквивалентами дикого типа, но с альтернативным применением кодона, как описано у Lathe “Synthetic Oligonucleotide Probes Deduced from Amino Acid Sequence Data: Theoretical and Practical Considerations” J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985), которая включена в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки. Методология в общем случае состоит из идентификации кодонов в последовательности дикого типа, которая обычно не ассоциируется с высокоэкспрессируемыми человеческими генами, и замены их оптимальными кодонами для высокой экспрессии в человеческих клетках. Указанные оптимальные кодоны называются в настоящем описании кодонами “предпочтительными для человека”. Затем новую генную последовательность тестируют на нежелательные последовательности, генерируемые заменами кодонов (например, последовательности “АТТТА”, случайное образование сайтов узнавания сплайсинга интрона, нежелательные сайты рестрикционных ферментов, высокое содержание GC и т.д.). Нежелательные последовательности удаляют путем замены существующих кодонов другими кодонами, кодирующими такую же аминокислоту. Затем синтетические сегменты гена тестируют на улучшенную экспрессию.

Способы, описанные выше, были использованы для создания синтетических генных последовательностей для человеческого HER2 и человеческого HER2ECDTM, что дает в результате ген полной длины и укороченный ген, содержащие кодоны, оптимизированные для экспрессии высокого уровня в человеческих клетках. Хотя вышеописанная процедура в общем предоставляет