Суперкритический жидкий экстракт, содержащий сердечный гликозид

Суперкритический жидкий экстракт, содержащий сердечный гликозид

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА ПРЕДЫДУЩУЮ ЗАЯВКУ

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки US № 11/191650 от 28 июля 2005 г., содержание которой включено в данный текст в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к технологии приготовления лекарственного средства, включающего в себя олеандрин, который в виде суперкритического жидкого экстракта содержит сердечный гликозид. В состав лекарственного средства также входят один или два солюбилизатора, такие как сурфактанты или ПАВ, которые способствуют растворению, диспергированию и эмульсификации сердечного гликозида, а возможно, и других фармакологически активных компонентов экстракта композиции в случае его помещения в жидкую среду.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Nerium oleander является декоративным растением, широко распространенным в субтропической Азии, в юго-западной части Соединенных Штатов и в Средиземноморье. Его медицинские и токсикологические свойства давно известны. Оно используется, например, в лечении кровотечений, язв, лепры, змеиных укусов и даже для стимуляции абортов. Олеандрин, важный компонент экстракта олеандра, является мощным ингибитором роста раковых клеток человека (Afaq F et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 195:361-369, 2004). Клеточная смерть с участием олеандрина сопровождается притоком кальция, выходом цитохрома С из митохондрий, протеолитическим процессингом каспаз 8 и 3, расщеплением поли(АДФ-рибозо)полимеразы и фрагментацией ДНК.

Ранее было показано, что олаеандрин является основным цитотоксическим компонентом Nerium oleander (Newman, et al., J. Herbal Pharmacotherapy, vol.13, p.p.1-15, 2001). Олеандрин - это экзогенный сердечный гликозид, который в норме в организме не содержится. Олеандрин вызывает апоптоз в человеческих, но не мышиных раковых клеточных линиях (Pathak et al., Anti-Cancer Drugs, vol.11, p.p.455-463, 2000), ингибирует активацию NF-kB (Manna et al., Cancer Res., vol.60, p.p.3838-3847, 2000) и является посредником клеточной смерти отчасти благодаря индуцированному кальцием выходу цитохрома С (McConkey et al., Cancer Res., vol.60, p.p.3807-3812, 2000). Недавно была завершена Фаза I клинических испытаний горячего водного экстракта олеандра (Mekhail et al., Am. Soc. Clin. Oncol., vol.20, p.82b, 2001). Было получено заключение, что экстракт олеандра может безопасно вводиться в дозах до 1,2 мл/м²/д. Никаких токсических пределов доз не было обнаружено.

Сердечные гликозиды, помимо их селективной цитотоксичности в раковых клетках, также усиливают клеточный ответ на цитотоксическое действие ионизирующего излучения. Было показано, что уабаин, эндогенный сердечный гликозид организма человека, усиливает in vitro радиационную чувствительность клеток аденокарциномы легких человека A549, но является неэффективным для изменения ответа на радиацию нормальных легочных фибробластов человека (Lawrence, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., vol.15, p.p.953-958, 1988). В дальнейшем было показано, что уабаин способствует радиационной сенсибилизации раковых клеток человека различного гистологического типа, включающих в себя клетки сквамозной карциномы и меланомы (Verheye-Dua et al., Strahlenther. Oncol., vol.176, p.p.186-191, 2000). Несмотря на то, что механизм вызываемой уабаином радиационной сенсибилизации до сих пор не до конца исследован, ингибирование восстановительных механизмов повреждений от сублетальной дозы радиации и увеличение радиационно-индуцированного апоптоза являются основными предполагаемыми процессами (Lawrence, 2000; Verheye-Dua et al., 2000; Verheye-Dua et al., Strahlenther. Oncol., vol.172, p.p.156-161, 1996). Сердечный гликозид олеандрин также обладает способностью усиливать чувствительность клеток к цитотоксическому действию ионизирующей радиации. См. Патентную Заявку US сер. № 10/957875 (Newman, et al) и Nasu et al., Cancer Lett. Vol.185, p.p.145-151, 2002).

В работе Chen et al. (Breast Cancer Research and Treatment (2006), 96, 1-15) было высказано предположение, что сердечные гликозиды, такие как уабаин и дигитал, могут использоваться при разработке лекарств для лечения рака молочной железы в качестве ингибиторов Na⁺, K⁺-ATФaзы и антогонистов ЭР.

В работе Smith et al. (Biochemical Pharmacology (2000), 62, 1-4) было показано, что ANVIRZEL и его основной компонент из класса сердечных гликозидов олеандрин ингибирует экспорт ростового фактора фибробластов 2 (FGF-2) из клеточных линий рака простаты PC3 и DU145.

В работе Newman et al. (J. Experimental Therapeutics and Oncology (2006), 5, 167-181) показано, что инкубация клеток злокачественной меланомы человека BRO с олеандрином приводит к зависимому от времени образованию частиц реакционного кислорода и супероксидных анионных радикалов, которые вызывают митохондриальные повреждения и потерю клеточного запаса GSH.

Публикация предварительной патентной заявки US № 20050112059 на имя Newman et al. раскрывает усиление радиационной терапии в лечении рака посредством введения олеандрина.

Экстракция гликозидов из растений семейства Nerium традиционно производилась с использованием кипящей воды. В процессе использования кипящей воды в качестве способа экстракции для получения активных ингредиентов из Nerium oleander образуется большое число продуктов. В их число входят олеандрин, нерин и другие составляющие сердечных гликозидов. Экстракты растений полезны при лечении клеточно-пролиферативных заболеваний у животных.

Экстракты олеандрина, полученные горячей водной экстракцией Nerium oleander и продаваемые под торговым названием ANVIRZEL^TM, коммерчески доступны и содержат концентрированную или порошковую формы экстракта Nerium oleander с горячей водой. Экстракт приготавливается в соответствии с процессом, разработанным Dr. Huseyin Ziya Ozel. В патенте US № 5135745 описывается процедура приготовления экстракта растения в воде. Процесс экстракции растения Nerium Oleander включает в себя обрезание листьев, термическую обработку срезанных листьев и стеблей растения в воде в течение 2-3 часов и фильтрацию остаточного материала. Затем смесь снова нагревается. Было показано, что водный экстракт содержит несколько видов полисахаридов с молекулярной массой в интервале от 2 kD до 30 kD, олеандрин и олеандригенин, одорозид и нериталозид. В число полисахаридов входят кислые гомополигалактуронаны или арабиногалатуронаны.

Работа Muller et al. (Pharmazie. (1991) Sept. 46(9), 657-663) раскрывает результаты анализа водного экстракта Nerium oleander. Результаты показывают, что присутствующий в экстракте полисахарид является в основном галактурониевой кислотой. Другими сахаридами являются рамноза, арабиноза и галактоза. Полисахаридный состав и структура полисахаридов в горячем водном экстракте Nerium oleander также были установлены в работе Newman et al. (J. Herbal Pharmacotherapy, (2001), vol.1, p.p.1-16).

Предметом патента US № 5869060 на имя Selvaraj et al. являются экстракты растений семейства Nerium и способы их получения. Для получения экстракта растительный материал помещается в воду и подвергается кипячению. Затем необработанный экстракт отделяется от растительного вещества и стерилизуется фильтрацией. После этого полученный экстракт лиофилизуют для получения порошка.

Патент US № 6565897 (предварительная публикация US № 20020114852 и Международная Патентная Публикация № WO 2000/016793 на имя Selvaraj et al.) раскрывает процесс экстракции с горячей водой для приготовления по существу стерильного экстракта.

Работа Erdemoglu et al. (J. Ethnopharmacol. (2003) Nov. 89(1), 123-129) посвящена сравнению водной и этанольной экстракций растений, включая Nerium oleander, основываясь на их антиноцицептивной и противовоспалительной активностях.

Экстракты Nerium oleander органическим растворителем также описаны в работах Adome et al. (Afr. Health Sci. (2003) Aug. 3(2), 77-86; экстракт этанолом), el-Shazly et al. (J. Egypt Soc. Parasitol. (1996), Aug. 26(2), 461-473; экстракт этанолом), Begum et al. (Phytochemistry (1999) Feb. 50(3), 435-438; экстракт метанолом), Zia et al. (J. Ethnolpharmacol. (1995) Nov. 49(1), 33-39; экстракт метанолом) и Vlasenko et al. (Farmatsiia. (1972) Sept.-Oct. 21(5), 46-47; эстракт спиртом).

Суперкритическая жидкая экстракция включает в себя использование суперкритической жидкости в селективной экстракции определенного компонента. Суперкритическая жидкость является жидкостью или газом при атмосферных условиях, но становится суперкритической, когда подвергается сжатию выше критического давления и нагревается выше критической температуры. Суперкритические жидкости обладают повышенной силой растворения в своих суперкритических областях. Суперкритическая жидкость демонстрирует свойства, средние между свойствами газа и жидкости, и обладает способностью к растворению соединений, которые плохо растворяются или не растворяются совсем в газовой или жидкой фазе. Суперкритические жидкости являются идеальными для экстракции этих соединений, поскольку они имеют высокую растворяющую силу при высоких плотностях и демонстрируют хорошие фракционирование и отделение соединения от жидкости при пониженных плотностях, когда изменяют давление или температуру. Стандартная процедура применения экстракции суперкритическим диоксидом углерода в пищевой промышленности была описана в работе Raventos et al., в 2002 году (M. Raventos, et al., Application and Possibilities of Supercritical CO₂ Extraction in Food Processing Industry: An Overview, Food Sci. Tech. Int. Vol.8(5) (2002) 269-284), содержание которой включено в данный текст посредством ссылки.

Предварительная публикация заявки на патент US № 20040247660 на имя Singh et al. раскрывает приготовление белково-стабилизированной липосомной композиции олеандрина для использования в лечении рака.

Предварительная публикация заявки на патент US № 20050026849 по работе Singh et al. раскрывает состав водорастворимой композиции олеандрина, содержащего циклодекстрин. Эта публикация предлагает приготовление капсул, заполненных твердым веществом и содержащих циклодекстриновый комплекс олеандрина. Олеандрин предлагался в виде горячего водного экстракта или в виде химического вещества, которые затем обрабатывались циклодекстрином для образования комплекса.

Предварительная публикация заявки на патент US № 20040082521 на имя Singh et al. раскрывает приготовление белково-стабилизированной композиции наночастиц олеандрина из горячего водного экстракта. Наночастицы приготавливаются посредством образования липосомной смеси с последующим выпариванием органического растворителя.

В связи с этим способы, направленные на увеличение относительного содержания олеандрина в полученном из растений материале, являются оправданными. Из-за того, что горячая водная экстракция Nerium oleander обеспечивает лишь сравнительно низкий выход олеандрина и соответствующих сердечных гликозидов, существует необходимость разработки улучшенного способа получения концентрированной формы сердечных гликозидов, включающих в себя олеандрин.

Олеандрин содержит лактоновое кольцо, которое является кислотолабильным и предрасполагает материал к разрушению кислотой при приеме внутрь, в связи с чем следует соблюдать осторожность при приготовлении жидких композиций для минимизации кислотных образований в растворе.

Никакие из известных способов не описывают технологию приготовления лекарственной композиции, содержащей экстракт растений семейства Nerium и, в частности, Nerium oleander. Существующие известные способы не предлагают и не описывают использование для этого суперкритического жидкого экстракта, включающего сердечный гликозид, такой как олеандрин. Существует потребность в разнообразных лекарственных формах, которые могут предоставить подходящую доставку компонентов экстракта растений семейства Nerium для лечения различных заболеваний и расстройств. Также остается потребность в улучшенном процессе получения сердечных гликозидов с помощью экстракции из растительного материала.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение направлено на преодоление всех или части недостатков, свойственных существующим способам. Изобретение обеспечивает суперкритический жидкий (СЖЭ) экстракт, содержащий сердечный гликозид. Экстракт может быть получен суперкритической жидкой экстракцией растительной массы, содержащей сердечный гликозид. Растительная масса может приготавливаться из растений семейства Nerium или семейства Thevetia. Особого внимания заслуживают виды растений Nerium oleander или Thevetia nerifolia. Суперкритический жидкий экстракт может содержать как минимум еще один фармакологически активный агент, который вносит вклад в терапевтическую активность сердечного гликозида при введении экстракта субъекту. Он может вносить вклад в терапевтическую активность аддитивно или синергитически.

Изобретение также обеспечивает изготовление лекарственной композиции, содержащей СЖЭ экстракт, который включает в себя сердечный гликозид. Отдельные примеры осуществления изобретения включают в себя экстракт растения олеандр, принадлежащего к семейству Nerium, например Nerium oleander или схожего с ним, или принадлежащих к семейству Thevetia, например Thevetia nerifolia. Экстракт может быть приготовлен суперкритической жидкой диоксид-углеродной (CO₂) экстракцией растительного материала, такого как высушенный порошок растительной массы, способом, описанным здесь или в находящейся на рассмотрении патентной Заявке US с сер. № 60/653210 от 28 июля 2005 г. на имя C. Addington и в Заявке US с сер. № 11/191650 от 28 июля 2005 г. на имя C. Addington, содержание которых включено в данный текст посредством ссылок. СЖЭ экстракция может осуществляться в присутствии модифицирующего агента для усиления экстракции желаемых соединений из растительной массы.

Соответственно, данное изобретение также описывает процесс суперкритической жидкой экстракции растительной массы, содержащей сердечный гликозид. Этот процесс включает в себя:

обработку растительной массы, содержащей сердечный гликозид, суперкритической жидкостью в течение времени, достаточного для экстракции сердечного гликозида из растительной массы;

отделение растительной массы от суперкритической жидкости; и

удаление суперкритической жидкости с образованием суперкритического жидкого экстракта, содержащего сердечный гликозид.

Суперкритическая жидкость может также содержать модификатор. СЖЭ экстракт может содержать как минимум еще один фармакологически активный агент помимо сердечного гликозида. Этот дополнительный активный агент может вносить вклад в терапевтическое действие сердечного гликозида, когда экстракт вводится субъекту. Функция дополнительного активного агента может быть аддитивна или синергетична по отношению к терапевтическому действию сердечного гликозида. Растительная масса, содержащая сердечный гликозид, может включать в себя растения семейства Nerium или семейства Thevetia.

Преимущества композиции данного изобретения и его лекарственных форм состоят в возможности растворения всего экстракта (или по крайней мере большей его части) после перорального введения его в организм, сопровождающегося тем, что все его компоненты растворяются, эмульгируются или диспергируются при помещении в водную среду. Растворение, дисперсия или эмульгирование могут быть результатом простого растворения, образования мицелл или самоэмульгирования в зависимости от наполнителей, используемых в композиции. В некоторых вариантах применения изобретения растворение СЖЭ экстракта не является pH-зависимым. Другим преимуществом является по существу полное растворение всех компонентов экстракта в жидкой лекарственной композиции, содержащей СЖЭ экстракт.

В ряде вариантов осуществления изобретения композиция содержит комбинацию как минимум двух веществ, выбранных из группы, состоящей из водорастворимого (смешивающегося) вспомогательного сольвента, водонерастворимого (несмешивающегося) вспомогательного сольвента, сурфактанта, антиоксиданта, комплексообразующего агента, усилителя абсорбции и СЖЭ экстракта.

Один из аспектов изобретения направлен на создание лекарственного средства, состоящего из:

- суперкритического жидкого экстракта растительной массы олеандра; и

- как минимум одного растворителя в количестве, достаточном для растворения экстракта.

В некоторых примерах осуществления изобретения растительная масса олеандра включает в себя растения из семейства Nerium, как, например, Nerium oleander, или из семейства Thevetia, такие как Thevetia nerifolia (иначе известные как желтый олеандр). Растительная масса олеандра является массой, содержащей сердечный гликозид. Сердечным гликозидом может быть олеандрин.

Другой аспект изобретения направлен на приготовление капсул, состоящих из капсульной оболочки и лекарственного средства, здесь описанного. В некоторых примерах осуществления в состав капсул входят:

капсульная оболочка;

экстракт олеандрина, полученный путем суперкритической жидкой экстракции растений семейства Nerium; и

как минимум один растворитель в количестве, достаточном для растворения экстракта.

Капсульная композиция может быть твердой, жидкой или полутвердой. Солюбилизатор может быть однокомпонентным или включать в себя смесь из двух, трех, четырех, пяти или более компонентов. Такие компоненты могут быть выбраны из группы, состоящей из водорастворимого (смешивающегося) вспомогательного сольвента, водонерастворимого (несмешивающегося) вспомогательного сольвента, сурфактанта и антиоксиданта.

Часть примеров осуществления изобретения содержит СЖЭ экстракт и:

как минимум один смешивающийся с водой сольвент;

как минимум один антиоксидант; и

как минимум один сурфактант.

Солюбилизатором может быть по меньшей мере один сурфактант, но он может являться также комбинацией веществ, как, например, следующие: а) сурфактант и смешивающийся с водой сольвент; б) сурфактант и несмешивающийся с водой сольвент; в) сурфактант, антиоксидант; г) сурфактант, антиоксидант и смешивающийся с водой сольвент; д) сурфактант, антиоксидант и несмешивающийся с водой сольвент; е) сурфактант, смешивающийся с водой сольвент и несмешивающийся с водой сольвент; и ж) сурфактант, антиоксидант, смешивающийся с водой сольвент и несмешивающийся с водой сольвент.

Композиция может также дополнительно состоять из: а) по меньшей мере одного жидкого носителя; б) по меньшей мере одного эмульгирующего агента; в) по меньшей мере одного диспергирующего агента; г) по меньшей мере еще одного наполнителя; или д) их комбинации.

В ряде примеров осуществления смешивающимся с водой сольвентом являются низкомолекулярные (менее 6000) ПЭГ, гликоль, или спирт. В некоторых примерах осуществления сурфактантом является пегилированный сурфактант, что означает сурфактант, содержащий функциональную группу полиэтиленгликоля. До приема внутрь или помещения в жидкий раствор часть вариантов композиции являются прозрачными, а другие представляют из себя суспензии. Другие варианты изобретения образуют эмульсии, мицеллярные дисперсии или твердые дисперсии (суспензии) в гастроинтестинальном (ГИ) тракте субъекта после их перорального введения или в жидкой среде.

Лекарственные формы по изобретению адаптированы к пероральному введению субъектам и подходят для лечения злокачественных неопластических заболеваний, рака, опухолей, вирусных инфекций и других признаков, симптомов и расстройств, на которые могут терапевтически влиять сердечные гликозиды, такие как олеандрин. Употребляемый здесь термин «субъект» обозначает теплокровных животных, таких как млекопитающие, например кошек, собак, мышей, морских свинок, лошадей, коров, овец и людей. В примерах 7-9 представлены типичные процедуры для лечения СЖЭ экстрактом данного изобретения различных расстройств. С помощью СЖЭ экстракта могут лечиться такие заболевания, как рак толстой и прямой кишки, ануса, тканей головы и шеи, эзофагиальных тканей, легких (карциномы как немалых, так и малых клеток), молочной железы, желудка, поджелудочной железы, простаты, печени, почек, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, тканей яичника, карциномы, костные саркомы, мезотелиомы и неоплазмы центральной нервной системы.

Часть примеров жидкой лекарственной композиции являются безводными или изготавливаются без добавления воды. Композиция может содержать эндогенную воду, уже находящуюся в одном или нескольких компонентах композиции. В другом варианте композиция содержит воду, добавляемую в виде отдельного компонента.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Следующие чертежи составляют часть данного описания и описывают типичные примеры осуществления заявленного изобретения. На основании этих чертежей и данного описания опытный специалист сможет применить изобретение без проведения дополнительных исследований.

Фиг.1А и 1В показывают сравнительные ВЭЖХ хроматограммы экстракта, полученного традиционным способом с горячей водной, и суперкритического жидкого экстракта данного изобретения.

На фиг.2 изображен профиль растворимости покрытой энтеросолюбильным покрытием жидкостной капсулы данного изобретения.

Фиг.3 показывает фотографию соответствующих полос гелевой электроферограммы, полученной как часть анализа сравнения активности олеандрина, горячего водного экстракта и СЖЭ экстракта по отношению к ингибированию pAKT.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Процесс экстракции может осуществляться на высушенном порошке листьев Nerium oleander способом, описанным в заявке US № 60/653210 от 15 февраля 2005 г. на имя Addington, или в заявке US № 11/340016 от 26 января 2006 г. на имя Addington, содержание которых включено в данный текст в качестве ссылок.

Важным компонентом способа обработки листьев олеандра является использование запатентованной измельчающей и обезвоживающей системы и способа, который применяет вихри воздуха для экстракции влаги и разделения частиц растений по размеру. Подходящие измельчающие и высушивающие системы описаны в патентах US № 5236132, № 5598979, № 6517015 и № 6715705, все на имя Frank Rowley, Jr., содержание каждого из которых включено в данный текст в качестве ссылки. В общих чертах, способ обработки листьев олеандра включает в себя сбор подходящих листьев и стеблей, промывание собранного растительного материала, высушивание листьев и стеблей и пропускание листьев через аппарат, который использует вихри воздуха для экстракции влаги и разделения частиц растений по размеру. Большие частицы либо еще раз обрабатываются, либо используются как необработанный материал. Самые маленькие частицы остаются в виде мелкой пыльцы, которая затем может подвергаться дальнейшей экстракции для получения олеандрина и других фармакологически активных компонентов.

Суперкритические жидкости образуются путем нагрева газа выше его критической температуры или путем сжатия газа выше его критического давления. Суперкритическая жидкостная экстракция включает в себя как минимум две стадии: экстракцию и разделение. Типичный экстрактор на основе суперкритических жидкостей состоит из емкости подвижной фазы (обычно СО₂), насоса для сжатия газа, печи, содержащей резервуар для экстракции, ограничителя для поддержания высокого давления в трубопроводе и улавливающего резервуара. Исследуемое вещество (аналит) захватывается в результате расширения суперкритических жидкостей, содержащих растворенное вещество, в пустой резервуар через растворитель или на твердый сорбирующий материал. Экстракция производится динамическим или статическим способом или их комбинацией. При динамической экстракции суперкритические растворы непрерывно протекают через образец в резервуаре для экстракции и через ограничитель в улавливающий резервуар. При статическом способе экстракции суперкритическая жидкость циркулирует по кругу, содержащему резервуар для экстракции, в течение некоторого периода времени, перед тем как выйти через ограничитель в улавливающий резервуар. При комбинированном способе в течение определенного времени происходит статическая экстракция, после которой производится динамическая экстракция.

В общих чертах, исходный материал помещают в устройство для экстракции вместе с суперкритической жидкостью в условиях определенного давления и температуры для экстрагирования необходимых компонентов растительного материала. После экстракции жидкость и соединения пропускают через сепаратор, который изменяет давление и температуру, тем самым понижая силу растворения суперкритического раствора и вызывая разделение или фракционирование растворенного соединения.

СЖЭ экстракт приготавливается смешиванием исходного материала олеандрового растения с диоксидом углерода при суперкритических давлении и температуре, в присутствии или в отсутствие химического модифицирующего агента, затем понижением давления и температуры смеси и отделением экстракта. Экстракт отделяется во время понижения давления и температуры смеси. Предпочтительным является использование в качестве исходного материала измельченных листьев олеандра. Благодаря измельчению листьев обеспечивается максимальная площадь соприкосновения наружной и внутренней поверхности листьев с экстрагирующим веществом. Это определяет экспоненциальный рост количества активных компонентов, образующихся в экстракте, по сравнению со способами экстракции, доступными в настоящее время. В нижеприведенной таблице показаны различные сольвенты, которые могут использоваться для растворения СЖЭ экстрактов, и их критические температуры и давления.

Жидкость	Критическая температура (К)	Критическое давление (бар)
Диоксид углерода	304,1	73,8
Этан	305,4	48,8
Этилен	282,4	50,4
Пропан	369,8	42,5
Пропилен	364,9	46,0
Трифторметан (фтороформ)	299,3	48,6
Хлортрифторметан	302,0	38,7
Трихлорфторметан	471,2	44,1
Аммиак	405,5	113,5
Вода	647,3	221,2
Циклогексан	553,5	40,7
н-Пентан	469,7	33,7
Толуол	591,8	41,0

Предпочтительной суперкритической жидкостью для экстракции активных компонентов из олеандрового растения является диоксид углерода. Его критическая температура равна 31,06°С, критическое давление - 73,83 бар, а критическая плотность - 0,460 г/см³. Считается, однако, что и другие соединения или их смеси могут использоваться в процессе СЖЭ экстракции олеандрина.

В некоторых примерах осуществления в суперкритическую жидкость могут добавляться дополнительный сольвент или модифицирующий агент. Обычно модифицирующие агенты обладают средней летучестью между суперкритической жидкостью и экстрагируемым соединением и, кроме того, они также должны смешиваться с суперкритической жидкостью. В некоторых примерах осуществления изобретения модифицирующий агент является жидкостью при нормальных условиях. В качестве примера, и не ограничиваясь этим, модифицирующий агент может выбираться из группы, состоящей из этанола, метанола, пропанола, воды, ацетона, этилацетата, метиленхлорида и т.д. (см. вышеприведенную таблицу). Этанол является наиболее подходящим модифицирующим агентом для экстракции фармакологических компонентов из олеандрового растения. Он может использоваться в соотношении от 35 до 75 кг этанольного растворителя на один кг биомассы, при этом 55 кг растворителя на один кг биомассы является предпочтительным соотношением. Типичный процесс экстракции для СЖЭ экстракции олеандрина из Nerium oleander может осуществляться следующим образом или так, как описано в примере 1. Исходный измельченный растительный материал смешивается с диоксидом углерода в установке для экстракции. В качестве суперкритического сольвента применяется чистый CO₂ или его смесь с одним или несколькими модифицирующими агентами. Экстракция производится под давлением около 280 бар или от 270 до 320 бар и при температуре около 50°С или от 40 до 60°С. Предпочтительным отношением растворителя к необработанному исходному материалу является 50:1 или от 45:1 до 60:1 по весу растворителя и необработанного материала.

В другом типичном примере экстракции к исходному растительному материалу в установке для экстракции добавляется суперкритический диоксид углерода, дополнительно содержащий этанол в качестве модифицирующего агента (см. пример 1). Экстракция производится под давлением около 280 бар (или от 270 до 320 бар) и при температуре около 50°С или от 40 до 60°С. Предпочтительным отношением растворителя и модифицирующего агента к необработанному исходному материалу является величина от 40 до 45 к 1 по суммарному весу растворителя и модифицирующего агента к весу необработанного материала. Впоследствии этанольный модифицирующий агент упаривается с помощью вакуума.

После экстракции производится разделение. В некоторых типичных примерах суперкритический сольвент, содержащий или не содержащий модифицирующий агент, в смеси с растворенным исходным материалом пропускается через сепараторное устройство, которое понижает давление и температуру смеси до тех пор, пока экстракт, содержащий активные компоненты, не отделяется и не высвобождается.

Экстракт представляет из себя смесь фармакологически активных компонентов, таких как олеандрин или другие сердечные гликозиды, полисахариды и другой растительный материал. Обогащенный олеандрином экстракт, полученный в процессе СЖЭ, является в значительной степени водонерастворимым, вязким и полутвердым при комнатной температуре. СЖЭ экстракт содержит много различных компонентов, обладающих самыми разными значениями растворимости в воде. Экстракт олеандрина, полученный в процессе суперкритических жидкостей, теоретически содержит олеандрин в пределах от 0,9 до 2,5% по весу. Были получены СЖЭ экстракты с различным содержанием олеандрина. В одном примере осуществления изобретения СЖЭ экстракт содержит около 2% по весу олеандрина. Остальным вязким полутвердым материалом экстракта является нерастворимый в воде материал целлюлозы. Полисахаридные компоненты отличаются от олеандрина по растворимости. Горячий водный экстракт обладает другими свойствами и другим составом по сравнению с СЖЭ экстрактом. СЖЭ экстракт содержит в 3-10 раз выше концентрацию олеандрина, чем горячий водный экстракт. Это было подтверждено как ВЭЖХ, так и ЛС/МС/МС (тандемная масс-спектрометрия) анализами.

Было проведено сравнение горячего водного экстракта, используемого ранее, с СЖЭ экстрактом данного изобретения. На фиг.1А изображена ВЭЖХ хроматограмма для каждого из используемых ранее горячих водных экстрактов, в то время как на фиг.1В показана ВЭЖХ хроматограмма для каждого из СЖЭ экстрактов данного изобретения. Анализ проводился в соответствии с описанием примера 11. Было показано, что пик при 17,6 мин соответствует олеазиду А, в то время как пик при 29,9 мин - олеандрину. Хроматограммы были получены путем инъекций образцов экстракта в концентрации 10 мг экстракта на мл ВЭЖХ буфера. Данные для горячего водного экстракта были получены с использованием 30 мкл объема для инъекции, а данные для СЖЭ экстракта - с использованием 10 мкл объема. Результаты анализа выглядят следующим образом:

Экстракт	Олеазид (%)	Олеандрин (%)
Горячая вода	0,094	0,17
СЖЭ	0,73	2,68

Эти два экстракта существенным образом различаются по концентрации олеандрина, олеазида А и по составу и относительному количеству ряда других компонентов, которые в данном анализе не определялись. Благодаря процессу суперкритической экстракции CO₂ концентрация олеандрина увеличилась в 15 раз. С точки зрения преимуществ для клинического применения, в этом случае необходимо намного меньше суперкритического CO₂ экстракта для достижения такой же активности и эффективности, как при горячем водном экстракте. Следовательно, предполагается, что суперкритический CO₂ экстракт будет предоставлять максимальную терапевтическую эффективность и преодолеет недостаток передозировки горячим водным экстрактом для достижения сходного терапевтического эффекта.

Упомянутые экстракты также отличаются по их относительной активности действия, определяемой по эффективности против ряда раковых клеточных линий (пример 10). Олеандринсодержащие образцы были приготовлены так, что они содержали одинаковое количество олеандрина, в то время как концентрация олеандрина в образцах различалась из-за разницы концентрации олеандрина в экстрактах. Полученные данные представлены в таблице, приведенной ниже:

КОМПОЗИЦИЯ	Человеческая меланома BRO клетки (IC50, µM)	Человеческий рак поджелудочной железы PANC-1 клетки (IC50, µM)
Олеандрин	0,017*	0,01
Горячий водный экстракт	0,052	0,03
Суперкритический CO2 экстракт	0,007	0,004
* Величина IC50 для исследуемых соединений представлена в виде микромолярной (µM) концентрации олеандрина в соответствующих экстрактах. Таким образом, эти значения соответствуют концентрации олеандрина (как в чистом виде, так и в составе экстракта), необходимой для ингибирования на 50% роста или пролиферации роста раковых клеток по сравнению с необработанными клетками.

Как показано в вышеприведенной таблице, величина IC₅₀ для суперкритического CO₂ экстракта составляет 50% от такой же величины для чистого олеандрина, как для Panc-1, так и для BRO клеток. Из этого следует, что суперкритический CO₂ экстракт олеандра как минимум в 2 раза сильнее (обладает большим действием) чистого олеандрина в отношении ингибирования роста Panc-1 и BRO клеток. Для сравнения, горячий водный экстракт является наименее эффективным среди трех проанализированных веществ. Эти данные показывают, что цитотоксичность олеандрина и соответствующих экстрактов против человеческих раковых клеточных линий в зависимости от их эффективности выглядит следующим образом: суперкритический CO₂ экстракт > олеандрин > горячий водный экстракт. Из этих данных следует, что цитотоксичность суперкритического CO₂ экстракта, по-видимому, объясняется присутствием наряду с олеандрином еще как минимум одного фармакологически активного компонента в СЖЭ экстракте и что эффективность суперкритического CO₂ экстракта намного выше (в 7,4 раза), чем эффективность горячего водного экстракта. Эти данные убедительно показывают значительное увеличение эффективности СЖЭ экстракта по сравнению с горячим водным экстрактом и даже с чистым олеандрином. Увеличение эффективности превосходит ожидаемое улучшение, которое могло бы получаться только благодаря увеличению концентрации олеандрина в СЖЭ экстракте.

Фосфорилирование серин/треонин киназой, известной как киназа Akt, обеспечивает раковые клетки повышенной способностью к выживанию. Увеличенная активность Akt помогает выживанию раковых клеток, которые в нормальных условиях были бы подвержены апоптотической смерти. Помимо этого, pAkt киназа задействована в процессах клеточной пролиферации, ангиогенеза, геномной нестабильности и клеточных инвазии и миграции (Yoeli-Lerner M and Toker A. Akt/PKB Signaling in Cancer. Cell Cycle 5:603-605, 2006). Все упомянутые процессы вносят вклад в инициацию и прогрессию рака. Дополнительные свидетельства важности сигнального пути Akt в раке были получены из исследований, показавших сверхэкспрессию или гиперактивацию (посредством фосфорилирования) Akt в разных видах человеческого рака, что также коррелирует с плохим прогнозом болезни. Также производилось сравнение относительной активности горячего водного и СЖЭ экстрактов в отношении белков важных клеточных сигнальных путей в человеческом раке поджелудочной железы (Panc-1). Полученные данные (см. фиг.3) показывают уменьшение активации (концентрационно-зависимый спад в экспрессии фосфорилированной формы Akt) протеин киназы Akt и увеличение активации MAPK/ERK (митоген-активируемая протеинкиназа/межклеточная сигнально-регулируемая киназа) сигнального пути (концентрационно-зависимый рост фосфорилированной формы pERK). Как олеандрин, так и суперкритический CO₂ экстракт были способны ингибировать PI3 киназу, в результате чего происходило уменьшение фосфорилирования Akt в Panc-1 клетках, в то время как горячий водный экстракт не проявлял этой активности. Кроме того, наблюдалось резкое увеличение экспрессии pERK в клетках, обработанных либо олеандрином, либо суперкритическим CO₂ экстрактом, в отличие от клеток, обработанных горячим водным экстрактом. Относительная способность суперкритического CO₂ экстракта ингибировать экспрессию pAkt намного выше этой же способности олеандрин