Жевательные составы с экстрактом коры магнолии быстрого высвобождения

Жевательные составы с экстрактом коры магнолии быстрого высвобождения

Реферат

Родственные заявки США

Утверждается приоритет временной заявки США с серийным номером № 60/742361, поданной 2 декабря 2005 года.

Техническая область

Настоящее изобретение в основном касается кондитерских составов, более конкретно оно касается кондитерских составов для ухода за полостью рта, содержащих экстракт коры магнолии, а также способов получения и использования указанных кондитерских составов.

Предпосылки настоящего изобретения

Существует значительный потребительский спрос на продукты, которые освежают дыхание и уничтожают бактерии в полости рта. Продукт для ухода за полостью рта, обладающий эффектом освежения дыхания и бактерицидным эффектом, представляет собой удобный способ доставки в целях дезинфекции полости рта и освежения дыхания. Бактерии полости рта, в частности бактерии, находящиеся на языке, продуцируют летучие серные соединения, которые являются причиной неприятного дыхания. Освежение дыхания, безусловно, представляет собой очень важную часть будничной жизни.

Для того чтобы поддерживать необходимую гигиену полости рта, на протяжении всего дня следует неоднократно проводить дезинфекцию полости рта, а также освежение дыхания. Однако проведение дезинфекции полости рта или освежения дыхания может быть трудным или неудобным, это зависит от характера требуемого освежения, а также от той ситуации, в которой этот процесс должен происходить. Общеизвестными способами ухода за полостью рта, пригодными для домашних условий, являются: чистка зубной щеткой, использование зубных нитей (флоссов), очистка языка или полоскание горла с применением разнообразных приспособлений и составов. Однако такие приспособления и составы менее удобны вне дома, где «удобства» ванной и туалета могут быть недостаточны, недоступны или негигиеничны.

Зубной налет представляет собой микробные отложения, образующиеся на зубах при коротком времени их чистки щеткой. Исследователи описывают этот налет как мягкую, плотную массу, которая в основном содержит разнообразные бактерии, а также определенное количество остатков клеток, образующихся за то непродолжительное время, в течение которого воздерживаются от чистки зубов щеткой. При полоскании водой зубной налет не удаляется. Позже исследователи признали, что этот налет представляет собой биологическую пленку. Зубной налет описывают как разнотипное сообщество микроорганизмов, находящихся на поверхности зубов в виде биологической пленки. Эта биологическая пленка встроена во внеклеточную матрицу полимеров, создаваемую как поверхностью зуба, так и микроорганизмами. Общепризнано, что уменьшению зубного налета способствуют чистка зубов, свежесть дыхания, а также здоровые десны. Однако биологическая пленка зубного налета очень стойка к воздействию противомикробных средств.

Противомикробные средства, продемонстрировавшие способность уменьшать зубной налет, включают в себя хлоргексидин, цетилпиримидинхлорид (СРС), триклозан и дельмопинол. Все они представляют собой лекарственные и синтетические средства. Было также обнаружено, что наряду с другими эфирными маслами в носителе на основе спирта, налет уменьшают эфирные масла, типа тимола, эвкалиптового масла, метилсалицилата и ментола. Несмотря на то, что тимол наиболее эффективен в уменьшении налета, однако у него неприятный вкус. Обычно полезное действие этих масел определяется присутствием спирта, увеличивающего растворимость указанных масел, а также проницаемость их сквозь пленку налета. Несмотря на то, что высокие концентрации спирта пригодны для гигиены полости рта (например, в виде средств для очистки полости рта), при их применении в оральных составах (типа жевательных резинок, съедобных пленок и кондитерских изделий и т.п.) может оставаться горькое послевкусие.

Активнодействующий ингредиент или его комбинация, полезное действие которой может заключаться или в удалении налета, предотвращении или замедлении его образования, или в противовоспалительном действии, которое должно помогать поддерживать здоровое состояние десен и способствовать их оздоровлению, а также освежению дыхания. Известно о включении активнодействующих агентов в состав жевательных резинок, это делается для того, чтобы обеспечить полезные для полости рта эффекты, включая освежение дыхания и бактерицидные свойства. Такие системы имеют преимущества, обеспечивая быстрый, эффективный и удобный способ доставки.

Краткое содержание настоящего изобретения

Настоящее изобретение ориентировано на освежающие дыхание составы, которые можно использовать в различных съедобных кондитерских продуктах. Один аспект настоящего изобретения ориентирован на использование съедобных продуктов (типа жевательной резинки, жевательной карамели и мягких таблеток) человеком, а продуктов, типа собачьих бисквитов - животными, причем указанные кондитерские продукты содержат состав, освежающий дыхание по настоящему изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением неожиданно было обнаружено, что экстракт коры магнолии в сочетании с определенными поверхностно-активными агентами обладает синергическим действием, подавляя рост бактерий, вызывающих образование зубного налета. Сочетание экстракта коры магнолии с отобранными поверхностно-активными агентами демонстрирует усиление активности против роста налета, указанное усиление происходит как при избытке экстракта коры магнолии, так и при избытке поверхностно-активного вещества.

Настоящее изобретение касается также кондитерских составов, содержащих экстракт коры магнолии в сочетании с поверхностно-активным агентом и предназначенных для бактерицидного действия, и обладающих свойствами освежать дыхание. Более конкретно, настоящее изобретение касается таких средств доставки в полость рта, имеющих быстрое высвобождение, как жевательная резинка, жевательная карамель, мягкие таблетки или других съедобных продуктов, которые содержат эффективное количество экстракта коры магнолии и поверхностно-активного агента, и при потреблении которых заявляемый состав эффективно инактивирует или уничтожает микробы в полости рта, а также освежает дыхание. В состав жевательного съедобного продукта дополнительно, в целях синергического увеличения эффективности экстракта коры магнолии, добавляют поверхностно-активное вещество.

В одном аспекте настоящего изобретения кондитерский состав, предназначенный для освежения дыхания потребителя жевательной резинки, включает быстро высвобождаемое средство доставки в полость рта, а также эффективное количество противомикробного средства, включающего синергическое соотношение экстракта коры магнолии и поверхностно-активного агента, причем указанное синергическое соотношение составляет по меньшей мере приблизительно 1 часть экстракта коры магнолии на 1 часть поверхностно-активного агента.

Пригодные поверхностно-активные агенты включают (но ими не ограничены): соли калия, аммония или натрия. Соли натрия включают анионактивные ПАВ, типа алкилсульфатов, включая натрий лаурилсульфат, натрий лауретсульфат и т.п. Другие соли натрия включают натрий лауроилсаркосинат, натрий брасслат и им подобные. Подходящие соли аммония включают аммоний лаурилсульфат, аммоний лауретсульфат, аммоний лауроилсаркосинат, аммоний брасслат, аммоний кокамидопропилбетаин и им подобные. Другие пригодные поверхностно-активные агенты включают эмульгаторы, которыми могут быть жирные кислоты (например, стеариновая кислота, пальмитиновая кислота, олеиновая кислота и линолевая кислота), их соли, глицеролмоностеарат, глицеролтриацетат, лецитин, моно- и триглицериды, а также ацетилированные моноглицериды. Как будет описано ниже, некоторые подходящие поверхностно-активные агенты демонстрируют также индивидуальные бактерицидные (уничтожающие микроорганизмы) свойства.

В другом аспекте настоящего изобретения обеспечивается процесс получения состава для ухода за полостью рта. Этот процесс предусматривает: включение в рецептуру противомикробного средства экстракта коры магнолии и поверхностно-активного агента в виде синергического соотношения, при их количестве от приблизительно 0,05 весовых % до приблизительно 10 весовых % от общего веса состава; смешивание всех ингредиентов вплоть до получения однородной смеси; и последующее формование из полученной смеси требуемой оболочки для состава для ухода за полостью рта.

В еще одном аспекте настоящего изобретения процесс получения состава для ухода за полостью рта предусматривает: включение в рецептуру противомикробного средства экстракта коры магнолии и поверхностно-активного агента в виде синергического соотношения при их количестве от приблизительно 0,05 весовых % до приблизительно 10 весовых % от общего веса состава; и инкапсулирование указанного противомикробного средства в состав для ухода за полостью рта.

Подробное описание настоящего изобретения

Известно, что жевательные кондитерские продукты (типа жевательных резинок) можно использовать в качестве носителей для доставки в полость рта компонентов, обеспечивающих такие полезные свойства, как освежение дыхания и бактерицидные действия в полости рта. Преимущество таких систем состоит в том, что потребитель обеспечивается удобным и недорогим способом поддержания гигиены полости рта и свежего дыхания на протяжении всего дня. Настоящее изобретение ориентировано на обладающие противомикробными свойствами жевательные кондитерские составы, содержащие быстро высвобождающийся экстракт коры магнолии и поверхностно-активный агент.

Настоящее изобретение ориентировано также на способ снижения или уничтожения находящихся в полости рта микроорганизмов, который происходит путем пережевывания жевательного кондитерского продукта, содержащего кондитерский состав, включающий экстракт коры магнолии и поверхностно-активный агент. Подходящие кондитерские продукты включают жевательные резинки, жевательную карамель, мягкие таблетки и бисквиты, которые согласно настоящему изобретению содержат быстро высвобождающийся экстракт коры магнолии и поверхностно-активный агент.

Термин «пережевывание» включает действия, при которых съедобный продукт целиком или частично расходуется при его помещении в рот, путем жевания, сосания или растворения. Ожидается, что более продолжительное удерживание указанного продукта во рту должно быть связано с более сильным уменьшением количества микроорганизмов, находящихся в полости рта. Эффективная продолжительность пережевывания составляет от 3-5 мин до 20-30 мин.

Используемый в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения термин «быстрое высвобождение» касается действия съедобных ингредиентов, скорость высвобождения которых выше, чем скорость высвобождения жевательных съедобных продуктов, например жевательных резинок, полученных стандартным процессом нанесения покрытий. Обычно быстрое высвобождение создается ингредиентами, которые первыми высвобождаются из съедобного ингредиента (например, противомикробного ингредиента), включенного согласно настоящему изобретению в жевательную резинку.

Настоящее изобретение включает быстро высвобождаемый экстракт коры магнолии в качестве активного компонента, имеющего бактерицидное действие в полости рта. Известно, что экстракт коры магнолии обладает бактерицидными свойствами и противогрибковым действием. Например, магнолол и гонокиол являются двумя компонентами экстракта коры магнолии, обладающими противомикробной активностью.

Используемый в настоящем изобретении экстракт коры магнолии может быть получен от O'Laughlin Industries Co., LTD, Guang Zhou Masson Pharmaceutical Co., Honsea Sunshine Bioscience and Technology Co. Экстракт коры магнолии получают в виде порошка. Указанный экстракт растворяют вместе с ароматизатором, и, перед тем, как приготовить продукт для ухода за полостью рта, в целях растворения его можно нагреть. Из экстракта коры магнолии, используя стандартную технологию составления рецептур, можно приготовить разнообразные продукты для ухода за полостью рта.

В то время как уничтожить бактерии в растворе сравнительно легко, биологическая пленка в виде зубного налета представляет собой сложную среду, обеспечивающую защиту от окружающей угрозы как отдельным бактериям, а также синергию между видами бактерий (Sharma A. et al., 2005, Oral Microbiology and Immunology, 20: 39-42). Поэтому по сравнению с простым тестом на уничтожение микроорганизмов намного труднее показать реальную эффективность противомикробного средства в отношении зубного налета, закончившего начальный рост. Диффузия в биологическую пленку ограничена, а бактерии внутри объема этой пленки защищены от воздействия противомикробного средства внеклеточным веществом, типа глюкана и полисахаридов декстрана. Поэтому, вероятно, легче предотвратить образование налета, чем удалить его по окончании начального роста.

В соответствии с настоящим изобретением противомикробное действие экстракта коры магнолии усиливается за счет объединения с поверхностно-активным агентом. Несмотря на то, что не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено какой-либо определенной теорией, предполагается, что сочетание поверхностно-активного вещества с эффективным количеством экстракта коры магнолии способно обеспечить такой жевательный продукт, который способствует уменьшению биологической пленки налета на зубах, а также в других зонах полости рта, типа языка. Предполагается, что комбинация экстракта коры магнолии с подходящим поверхностно-активным агентом может предотвратить прикрепление бактерий к пелликуле. Такая жевательная резинка способна замедлить или предотвратить увеличение налета. Далее жевательный продукт по настоящему изобретению, объединенный с ферментами, дополнительными поверхностно-активными агентами, абразивами и их комбинациями, может быть эффективен в удалении уже существующего зубного налета.

Предпочтительным поверхностно-активным агентом является такое средство, которое увеличивает растворимость экстракта коры магнолии и которое можно использовать в качестве пищевой добавки. Пригодные поверхностно-активные агенты включают (но ими не ограничены): стандартные ПАВ, мыла, смачивающие средства, а также эмульгаторы. Некоторые примеры ПАВ включают (но ими не ограничены): соли калия, аммония или натрия. Соли натрия включают анионактивные ПАВ, типа алкилсульфатов, включая натрий лаурилсульфат, натрий лауретсульфат и т.п. Другие соли натрия включают натрий лауроилсаркосинат, натрий брасслат и им подобные. Подходящие соли аммония включают аммоний лаурилсульфат, аммоний лауретсульфат, аммоний лауроилсаркосинат, аммоний брасслат, аммоний кокамидопропилбетаин и им подобные. Другие пригодные поверхностно-активные агенты включают эмульгаторы, которые могут представлять собой жирные кислоты (например, стеариновую кислоту, пальмитиновую кислоту, олеиновую кислоту и линолевую кислоту), их соли, глицеролмоностеарат, глицеролтриацетат, лецитин, моно- и триглицериды, а также ацетилированные моноглицериды. Как это будет описано ниже, некоторые подходящие поверхностно-активные агенты демонстрируют также индивидуальные бактерицидные (уничтожающие микробов) свойства.

Жевательный продукт может также включать в себя дополнительные ингредиенты, которыми могут быть противомикробные средства. Помимо этого указанные дополнительные ингредиенты, освежающие дыхание и осуществляющие гигиену полости рта, могут содержать приемлемые с пищевой точки зрения соли цинка или меди, охлаждающие агенты, пирофосфаты или полифосфаты, а также им подобные.

Настоящее изобретение включает также способ лечения, осуществляемый в целях снижения количества бактерий или их активности в полости рта. Метод предусматривает следующие стадии: приготовление жевательного продукта, содержащего экстракт коры магнолии в таком количестве, которое, в сочетании с поверхностно-активным агентом, достаточно для уничтожения или дезактивирования бактерий полости рта, а также потребление указанной жевательной резинки субъектом, нуждающимся в таком лечении. Благодаря этому лечению количество бактерий в ротовой полости указанного субъекта снижается или эти бактерии инактивируются.

В одной форме жевательный продукт готовят с быстро высвобождаемым средством доставки в полость рта таким образом, чтобы в полость рта доставлялось по меньшей мере от приблизительно 0,001% до приблизительно 2,0% экстракта коры магнолии. В другой форме жевательный продукт составлен таким образом, чтобы в полость рта доставлялось по меньшей мере 0,01% экстракта коры магнолии. Для того чтобы увеличить эффективность жевательного продукта в качестве средства доставки в указанный состав добавляют одно или более поверхностно-активных агентов.

В соответствии с одним вариантом настоящего изобретения в жевательном продукте присутствует одно или более поверхностно-активных агентов, их концентрация составляет от приблизительно 0,001% до приблизительно 2,0%. В составе такого жевательного продукта экстракт коры магнолии объединен с поверхностно-активным агентом в таком синергическом соотношении, которое обеспечивает увеличение эффективности уничтожения микроорганизмов. Указанное синергическое соотношение составляет от приблизительно 1 части экстракта коры магнолии на 1 часть поверхностно-активного агента до приблизительно 4 частей экстракта коры магнолии на 1 часть поверхностно-активного агента. Одним особенно эффективным поверхностно-активным агентом является натрий лаурилсульфат, а особенно эффективным с синергической точки зрения является состав, содержащий 2 части экстракта коры магнолии на 1 часть натрий лаурилсульфата.

Принимая во внимание, что экстракт коры магнолии представляет собой гидрофобное соединение, имеется несколько средств доставки в полость рта, которые можно использовать в целях увеличения высвобождения экстракта коры магнолии из жевательного продукта. Например, в жевательной резинке ее кондитерская основа является гидрофобной, а это также препятствует высвобождению экстракта коры магнолии. В различных вариантах изобретательских кондитерских составов экстракт коры магнолии, объединенный с поверхностно-активным веществом, можно инкапсулировать, высушить распылением или включить в состав покрытия; это делается для того, чтобы облегчить и ускорить высвобождение указанного экстракта в полость рта.

В целях оценки эффективности экстракта коры магнолии проводился in vitro анализ трех поддесневых бляшкообразных вирусных бактерий, связанных с наличием дурного запаха изо рта. Порядок определения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) был следующим. В качестве положительного эталона использовали хлоргексидин, а в качестве отрицательного - стерильную воду. В качестве растворителя экстракта коры магнолии использовался ментол и Твин 80. Твин 80 известен под стандартным названием Polysorbate 80. Для описанного анализа использовали микротитровальные пластины с 96 ячейками. В каждой из ячеек находились бактерии в количестве 5×10⁵ колониеобразующих единиц/мл (КОЕ/мл), периодически разбавляемые адаптогенами, а также среда для роста бактерий. Все бактериальные культуры стационарно инкубировали при 37°С. Рост бактерий оценивали спустя 48 ч, используя для этого спектрофотометрический анализ при 660 нм. Минимальная ингибирующая концентрация для каждой из анализируемых бактерий определялась как такая минимальная концентрация испытуемого соединения, при которой мутность ограничивается поглощением, составляющим менее 0,05 при 660 нм.

Минимальные бактерицидные концентрации (МВС) определяли с использованием микротитровальных пластины с 96 ячейками, при этом периодически проводилось разбавление, описанное выше для определения MIC. Периодическое разбавление культур в ячейках продемонстрировало, что никакого видимого роста не произошло, и 10 мкл культуры поместили на три одинаковые пластины с кровяным агаром. После проведения на этих пластинах инкубирования в течение 48 ч при 37°С был проведен подсчет жизнеспособных колоний. В первичном инокуляте для каждой из испытуемых бактерий была определена величина КОЕ/мл. Значение МВС определялось как такая самая низкая концентрация испытуемого соединения, при которой уничтожается по крайней мере 99,9% клеток, находящихся в первичном инокуляте.

Результаты проведенных исследований по определению минимальной ингибирующей концентрации (MIC) и минимальной бактерицидной концентрации (МВС) для экстракта коры магнолии были следующими. Значение MIC для 90% экстракта коры магнолии в случае Streptococcus mutans составило 15,62 мкг/мл. В случае Porphyromonas gingivalis величина MIC для 90% экстракта коры магнолии равна 3,91 мкг/мл, а для 65% экстракта коры магнолии - 7,82 мкг/мл. В случае Fusobacterium nucleatum значение MIC для 90% экстракта коры магнолии составило 3,91 мкг/мл, а величина МВС - 7,82 мкг/мл. В отношении того же самого микроорганизма значения MIC и МВС для 65% экстракта коры магнолии составили 7,82 мкг/мл. Хлоргексидин использовался как положительный эталон, величина MIC и МВС в хлоргексидине для всех трех указанных типов бактерий составила 1,25 мкг/мл. Растворитель, представляющий собой воду с 10% добавкой метанола и 3,8% добавкой Твин 80, не оказал существенного влияния ни на один из трех исследуемых микроорганизмов.

Известно также, что экстракт коры магнолии эффективен в отношении Actinobacillus actinomyecetemcomintans, Prevotella intermedia, Micrococcus luteus и Bacillus subtilis, Veilonella disper, Capnocytophaga gingivalis, а также в отношении микроорганизмов периодонта (Chang В. et al., 1998, Planta Medica, 64: 367-369). Многие патогенные микроорганизмы человека связаны с заболеваниями периодонта (Schreiner Н.С. et al., 2003, PNAS 100:7295-7300). Известно также, что многие указанные выше виды микроорганизмов группируются вместе, образуя биологическую пленку (Richard A.H. et al., 2003, Trends in Microbiology 11:94-100).

Помимо описанных выше результатов, действие экстракта коры магнолии на формирование биологической пленки и на ее удаление сравнивали с действием различных травяных и природных ингредиентов. Сравнительные исследования проводились с использованием экстракта зеленого чая, экстракта чая оолонг, лакричника и экстракта коры магнолии. Указанное сравнительное исследование включало в себя: определение растворимости в воде, этаноле, смеси вода:этанол и других растворителях (например, твина в воде); величин MIC для роста S.mutans и MIC для формирования биологической пленки S.mutans в пластинах с 96 ячейками; а также действие S.mutans на отслойку биологической пленки.

Зеленый чай растворим в воде; все другие вещества, как было обнаружено, растворяются в смеси вода:этанол = 2:1. Экстракт коры магнолии также был растворим в 0,01 мкл 50% раствора Твин 80 в воде.

Для оценки влияния Streptococcus mutans на формирование биологической пленки использовались микротитровальные пластины с 96 ячейками. Каждую из ячеек, содержащую S.mutans (5×10⁶ КОЕ/мл), периодически разбавляли исследуемыми соединениями и питательной средой (BHI с 5% сахарозой). Контрольные образцы включали питательную среду, но не содержали исследуемых соединений. Все пластины инкубирования в течение 48 ч при 37°С в аэробных условиях, рост оценивали спустя 48 ч спектрофотометрически (660 нм), используя для этого считывающее устройство для микротитровальных пластин. После этого супернатант, содержащий неприкрепленные клетки, удалили из каждой ячейки методом аспирации, а массу прикрепившейся биологической пленки растворили в 200 мкл 1N NaOH. Оптическую плотность измеряли при 660 нм, используя для этого считывающее устройство для микротитровальных пластин. В качестве положительного эталона применяли хлоргексидин (40 мкг/мл).

Для дальнейшей оценки влияния S.mutans на отслойку биологической пленки использовались стерильные микротитровальные пластины с 96 ячейками, в каждую из которых был инокулирован S.mutans (5×10⁶ КОЕ/мл). Добавили питательную среду (бульон экстракта мозг-сердце, ВHI с 5% сахарозой) и в целях формирования биологической пленки в течение 48 ч проводили инкубирование при 37°С в аэробных условиях. Спустя 48 ч неприкрепленный супернатант подвергли аспирации, а потом периодически разбавляли. К полученной сформировавшейся биологической пленке добавили исследуемые соединения и провели инкубирование в течение 48 ч при 37°С в аэробных условиях. Контрольные образцы содержали растворитель, но не содержали исследуемых соединений. Спустя 30 мин супернатант аспирировали из ячеек, а оставшуюся биологическую пленку растворили в 200 мкл 1N NaOH. Количественную оценку проводили спектрофотометрически при 660 нм, используя для этого считывающее устройство для микротитровальных пластин. В качестве положительного эталона применяли хлоргексидин. Если под действием исследуемых соединений произошла отслойка биологической пленки, то спектрофотометрическое поглощение или оптическая плотность (OD) должны уменьшиться по сравнению с необработанными контрольными образцами.

Ниже в таблице 1 приведены результаты сравнительного анализа в виде значений мкг/мл для каждого из соединений. В указанной таблице 1, а также и в следующих таблицах экстракт коры магнолии обозначен МВЕ, а хлоргексидин, используемый в качестве положительного эталона, обозначен СНХ.

Таблица 1
Сравнительное действие на MIC и биопленку, мкг/мл
Эталон	Зеленый чай	Оолонг чай	Лакричник	МВЕ	СНХ
Рост MIC	250	1000	250	7,8	2,5
MIC, формирование биопленки	250	250	250	7.8	2,5
MIC, отслойка биопленки	>1000	>1000	>10000	>1000	>10

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что ни одно из исследуемых соединений не было эффективнее хлоргексидина по удалению образовавшейся биологической пленки. Экстракт зеленого чая, экстракт лакричника и экстракт коры магнолии способны сдерживать образование биологической пленки S.mutans, ингибируя рост бактерий, поскольку величины MIC для роста и для формирования биологической пленки идентичны. Оолонг чай не подавляет плангтонный рост, но более эффективен в подавлении роста биологической пленки. Экстракт коры магнолии наиболее эффективен для сдерживания как роста, так и формирования биологической пленки, и его эффективность имеет значение в пределах аналогичного параметра для положительного эталона - хлоргексидина.

Несмотря на то, что полезно показать сравнительное действие экстракта коры магнолии на формирование биологической пленки и на рост MIC, приведенный далее тест не способен эффективно имитировать in vivo действие продукта для ухода за полостью рта на возникновение биологической пленки. В ситуации in vivo активнодействующее вещество может воздействовать на налет в течение определенного периода времени с заданной частотой (например, по 5 минут три раза в день). Потому была проведена серия сравнительных экспериментов для имитации использования потенциальных активных ингредиентов in vivo. Для того чтобы осуществить указанные исследования, были приготовлены слюносодержащие композиции, составы которых приведены ниже в таблицах 2 и 3.

Таблица 2
Слюносодержащие буферные композиции (стерилизованы на фильтре после приготовления)
Соединение	мг/л
Хлорид аммония	233
Хлорид кальция, дигидрат	210
Хлорид магния, гексагидрат	43
Хлорид калия	1162
KH2PO4	354
Тиоцианат калия	222
Цитрат натрия	13
Бикарбонат натрия	535
Na2HPO4	375
Мочевина	173

Таблица 3
Среда, содержащая слюну с добавками (стерилизована на фильтре после приготовления)
Ингредиент	Весовые %
Неразбавленная слюна	25
Буфер для слюны	45
Модифицированная среда (MEM)	20
Триптический соевый бульон	10

Была использована смешанная культуральная система с бактериями из свежесобранной стимулированной неразбавленной слюны. Для инокулирования покрытых слюной гидроксиапатитных (S-HA) дисков использовался осадок, полученный в результате центрифугирования клеток слюны. Указанные диски поместили в культуральные планшеты на 24 ячейки, и в течение времени, составляющем до 3 суток, проводили инкубирование. Биологические пленки подвергались воздействию активнодействующих соединений на 2 и 3 день (начиная с 18 ч), а на 4 день была проведена количественная оценка. Количество бактерий определяли по спектрофотометрическому поглощению или оптической плотности (OD) при 600 нм. Эксперимент включал в себя 5 следующих фаз: образование пелликулы, прикрепление бактерий, рост биологической пленки, обработку активнодействующими соединениями и установление численности бактерий.

В целях формирования пелликулы диски НА промывали в деионизированной воде под воздействием ультразвука, а затем высушили на воздухе и обработали в автоклаве. После этого указанные диски на 2 ч поместили в планшет на 24 ячейки, содержащие 1 мл 50% стерильной слюны (1 часть стерильной неразбавленной слюны: 1 часть буфера для слюны, стерилизован на фильтре после приготовления), процесс проводили при медленном перемешивании при комнатной температуре. Осуществили засасывание слюны, а потом диски перенесли в чистые ячейки для того, чтобы произошло прикрепление бактерий.

Для формирования биологической пленки суспензию бактерий удалили, а диски перенесли в чистые ячейки. Добавили 1 мл питательной среды, содержащей слюну с добавками, а планшет поместили в инкубатор для инкубирования в течение всего вечернего времени (до 72 ч).

Приготовили маточный раствор 1% экстракта коры магнолии в 60% этаноле. В растворе фосфатно-солевого буфера (PBS) приготовили образцы экстракта коры магнолии, имеющие концентрации 125, 250, 500 и 1000 мкг/мл (1×10^-6); отрицательным эталоном служил PBS, а в качестве положительного эталона использовали СНХ с концентрацией 0,12%. Эталонный раствор PBS имел состав, приведенный ниже в таблице 4.

Таблица 4
Состав фосфатно-солевого буфера
Ингредиент	г/л
NaCl	8,0
KCl	0,2
Na2PO4	1,44
KH2PO4	0,24

В чистые ячейки поместили 1 мл активных и эталонных ингредиентов, и в эти ячейки на 5 мин перенесли диски. Воздействие хлоргексидином (эталоном) проводили в течение 1 мин дважды в день, имитируя этим стандартную процедуру полоскания рта. Воздействие активного ингредиента проводили в 8 часов утра, 12 часов дня и в 16 часов вечера. По окончании указанного времени раствор удалили, диски дважды промыли PBS, а затем перенесли в чистую среду. В некоторых экспериментах используемой ежедневно средой был триптический соевый бульон (TBS) с добавкой в каждую ячейку 50 мкл 40% стерильного раствора сахарозы (в целях получения 2% раствора сахарозы). После воздействия в течение полдня указанную среду не заменяли.

После инкубирования в течение ночи (второй день) диски подвергли воздействию эталонных и активнодействующих соединений. На третий день на биологические пленки вновь оказывалось воздействие и проводился контроль. На четвертый день диски изъяли из среды и измерили ее рН в целях определения метаболической активности. Диски поместили в пробирки, содержащие 2,5 мл PBS, встряхивали 20 с, а на следующие 20 с перенесли в ультразвуковую ванну. Полученную суспензию поместили в кюветы, плотность бактериальных клеток оценивали по измерениям оптической плотности (OD) при 600 нм.

Ниже в таблице 5 приведены результаты измерений рН; процентное снижение OD по сравнению с эталонным PBS приведено в таблице 6.

Таблица 5
Измерение рН
Исследуемый образец	рH
Эталон PBS	5,4
Эталон СНХ	8,8
МВЕ 125	5,2
МВE 250	6,0
МВE 500	7,1
МВE 1000	7,6

Таблица 6
Процентное снижение оптической плотности при 600 нм
Исследуемый образец	Снижение OD, %
Эталон PBS	0
Эталон СНХ	84
МВE 125×10-6	-2
МВE 250×10-6	21
МВE 500×10-6	53
МВE 1000×10-6	59

Результаты, представленные выше в таблице 5 и таблице 6, иллюстрируют четкое влияние экстракта коры магнолии на ингибирование метаболической активности биологической пленки (по определению рН среды) и на формирование биологической пленки (OD), причем это влияние зависит от дозы. Хлоргексидин обладает сильным ингибирующим действием на метаболизм зубного налета и на подавление количества клеток. Экстракт коры магнолии был менее эффективен, чем хлоргексидин, однако концентрация хлоргексидина была немного выше концентрации экстракта коры магнолии.

Для того чтобы оценить действие экстракта коры магнолии в сочетании с поверхностно-активным агентом, представляющим собой натрий лаурилсульфат, приготовили 5 растворов активных ингредиентов; эти вещества использовали по описанной выше методике. Был приготовлен эталонный раствор хлоргексидина, концентрация которого, составляющая 0,1%, была немного снижена (1000×10^-6). Помимо этого, были приготовлены растворы МВЕ с концентрацией 500×10^-6. Натрий лаурилсульфат был добавлен к двум растворам экстракта коры магнолии, в результате получили растворы, концентрация натрий лаурилсульфата в которых составила 0,05%, а концентрация экстракта коры магнолии - 0,1%. Описанное выше тестирование с экстрактом коры магнолии было повторено для 5 растворов.

Ниже в таблице 7 приведены результаты измерения рН; в указанной таблице натрий лаурилсульфат обозначен SLS.

Таблица 7
Измерение рН
Исследуемый образец	рН
Эталон PBS	4,9
Эталон СНХ	8,8
SLS 1000×10-6	5,7
МВЕ 500×10-6	7,1
МВЕ 500×10-6/ SLS 500×10-6	5,9
МВЕ 500×10-6/SLS 1000×10-6	6,2

Процентное снижение оптической плотности (OD), наблюдаемое экспериментально, приведено ниже в таблице 8. Заметим, что данные из последней строки указанной таблицы взяты из другого эксперимента.

Таблица 8
Процентное снижение оптической плотности при 600 нм
Исследуемый образец	Снижение OD, %
Эталон PBS	0
Эталон СНХ	94
SLS 1000×10-6	61
МВЕ 500×10-6	65
МВЕ 500×10-6/SLS 500×10-6	79
МВЕ 500×10-6/SLS 1000×10-6	70
МВЕ 1000×10-6/SLS 500×10-6	88

Результаты, приведенные выше в таблицах 7 и 8, показывают, что хлоргексидиновый эталон имеет самое высокое значение рН, и этот же эталон имеет самую низкую оптическую плотность. На основании данных по рН (показатель метаболической активности) видно, что чистый экстракт коры магнолии в концентрации 500×10^-6 имеет более высокую ингибирующую активность, чем натрий лаурилсульфат или смеси экстракт коры магнолии/натрий лаурилсульфат. Однако данные по оптической плотности (численность бактерий) указывают на синергический эффект уменьшения биологической пленки в исследуемых растворах, содержащих экстракт коры магнолии и натрий лаурилсульфат. В частности, согласно полученным результатам натрий лаурилсульфат в концентрации 1000×10^-6 и экстракт коры магнолии в концентрации 500×10^-6 обладают аналогичным воздействием на величину зубного налета, хотя экстракт коры магнолии в большей степени подавляет метаболическую активность указанного налета. Экстракт коры магнолии в сочетании с натрий лаурилсульфатом при концентрации 500×10^-6 снижает рост налета, причем это снижение сравнимо с индивидуальным действием экстракта коры магнолии в концентрации 500×10^-6. Помимо этого натрий лаурилсульфат в концентрации 1000×10^-6 был менее эффективен, чем это же соединение в концентрации 500×10^-6 в сочетании с экстрактом коры магнолии в концентрации 500×10^-6. Наиболее эффективной была комбинация экстракта коры магнолии в концентрации 1000×10^-6 с натрий