Тимус-специфический белок

Тимус-специфический белок

Иллюстрации

Показать все

Реферат

2420-144113RU/031

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому тимус-специфическому белку.

Предшествующий уровень техники

Ниже приводятся предшествующие публикации, которые иллюстрируют предшествующий уровень техники в той области, к которой относится настоящее изобретение:

[1] Maurer, H.R., Eckert, K., Stange, R.: Einfluss der Therapie mit Thymoject auf die antitumorale Immunotoxizität der Leukozyten von Mamma-Tumorpatientinnen. Pers. Mitt. (1999).

[2] Mustacchi, G., Paves, L., Milani, S. et al.: High-dose folinic acid and fluouracil plus or minus thymostimulin for the treatment of metastatic colorectal cancer: results of a randomised multicentered trial. Anticancer Res. (1994) 14: 617-619.

[3] Schulof, R.S., Loyd, M.J., Cleary, P.A., et al.: A randomized trial to evaluate the immunorestorative properties of synthetic thymosin-alpha1 in patients with lung cancer. J. Biol. Resp. Modif. (1985) 4: 147-158.

[4] Azizi, A., Brenner, H.J., Shoham, J.: Postoperative adjuvante Behandlung von Patienten mit malignem Melanom durch den Thymusfaktor Thymostimulin. Arzneim-Forsch/Drg. Res. (1984) 34(11): 1043-1046.

[5] Massimo, F., Gobbi, P., Moretti, G., Avanzini, P., Italian Lymphoma Study Group: Effects of Thymostimulin with combination Chemotherapy in patients with aggressive non-Hogkins lymphoma. Am. J. Clin. Oncol. (CCT) (1995) 18(1): 8-14.

[6] Peretti, P., Tonelli, F., Mazzei, T., Ficari, F., Italian study group on antimicrobal prophylaxis in abdominal surgery. J. Chemotherapy (1993) 5(1): 37-42.

[7] Gonelli, S., Petrioli, R., Cepollaro, C., Palmieri, R., Aquino, A., Gennari, C.: Thymostimulin in association with chemotherapy in breast cancer patients with bone metastases. Clin. Drug Invest (1995) 9(2): 79-87.

[8] Iaffaioli, R.V., Frasci, G., Tortora, G., Ciardiello, F., Nuzzo, F., Scala, S., Pacelli, R., Bianco, A.R.: Effect of thymic extract Thymostimulin on the incidence of infections and myelotoxicity during adjuvant chemotherapy for breast cancer. Thymus (1988) 12: 69-75. Kluwer Academic Publishers.

В тексте описания изобретения эти публикации обозначены указанными выше номерами в скобках.

Предпосылки создания изобретения

В настоящее время идентифицированы многие модификаторы биологических ответов (MБО). Примерами таких модификаторов являются интерлейкины и цитокины. В целом в иммуномодуляции важную роль играет тимус. Можно сказать, что тимус является центральным органом иммунной системы. Считается, что тимус играет ключевую роль в развитии и функционировании иммунной системы и в механизмах биологической защиты от раковых и хронически инфицированных клеток.

Ткань тимуса ответственна за селективную трансформацмю клеток-предшественников в различные Т-клетки, то есть хелперные (CD4+) T-лимфоциты, которые облегчают дифференцировку других лимфоцитов; клетки-киллеры (NK-клетки); цитотоксические клетки и супрессорные (цитотоксические) (CD8+) T-лимфоциты [1-3]. Лимфоциты после их высвобождения в кровоток, а также в кишечные и периферические ткани характеризуются четко определяемыми антигенами или маркерами активации, присутствующими на их поверхности. Их активности проявляются вне тимуса.

Существуют очень тонкие взаимодействия между тимусом и активным костным мозгом. При этом существует прямая и положительная корреляция между гипофункцией тимуса и снижением уровня продуцирования колониестимулирующих факторов (CSF). Поэтому в случае недостаточного продуцирования CSF может оказаться полезным терапевтическое применение тимусных пептидов.

Хронический гепатит В (СНВ), ВИЧ-инфекция, хронический гепатит С (СНС) и малярия являются хроническими заболеваниями, которыми в настоящее время страдают примерно десять миллионов человек, не получая при этом никакого лечения. Клеточная составляющая иммунитета ответственна за иммунный “надзор”, направленный на предотвращение этих хронических вирусных, грибковых, дрожжевых и паразитарных инфекций, а также новообразований и симптомов старения. Тимусные экстракты находят клиническое применение в лечении различных заболеваний, включая некоторые из указанных состояний. Такие экстракты вводят перорально или путем инъекции как в чистом виде, так и в комбинации с другими терапевтическими средствами. Тимусные экстракты применяются для лечения тяжелых и хронических аллергий, включая аллергии дыхательный путей и кожи, а также для лечения тяжелых, острых и хронических инфекционных заболеваний. Было показано, что указанные экстракты уменьшают риск возникновения постхирургических инфекций и снижают степень повреждения, вызываемого химиотерапией и облучением, а также могут быть использованы в качестве вспомогательных средств в основном курсе терапии, проводимом для лечения опухолевых заболеваний. Все указанные состояния успешно подвергались лечению с использованием экстрактов, выделенных из тимуса коров.

В рандомизированных исследованиях пациентов со злокачественной меланомой введение тимусных пептидов приводило к увеличению периода прекращения развития опухоли, к увеличению продолжительности жизни и к повышению качества жизни [4]. В другом рандомизированном исследовании пациентов с промежуточной и высокозлокачественной неходжкинской лимфомой эти пациенты помимо стандартной химиотерапии были подвергнуты лечению тимусными пептидами. Прошедшие указанный курс лечения пациенты достаточно хорошо переносили такое лечение, и у этих пациентов наблюдался значимо более высокий показатель ответа, чем у пациентов, которым не вводили тимусные пептиды [5]. В другом рандомизированном исследовании, в котором участвовали пациенты, подвергнутые операции на ободочной кишке, было обнаружено, что у пациентов, которым помимо цефотетана вводили тимусные пептиды, наблюдалось значимое снижение уровня развития абсцессов в брюшине и инфекций в верхних дыхательных путях [6]. Рандомизированные исследования, проводимые с участием женщин с запущенным раком молочной железы, документально подтвердили, что у женщин, которым помимо курса химиотерапии вводили тимусные пептиды, наблюдалась значительно лучшая переносимость химиотерапии и снижение уровня развития вторичных инфекций [7, 8].

В соответствии с вышеуказанными данными очевидно, что тимусные пептиды могут быть использованы для усиления функции костного мозга и для защиты пациента от миелосупрессии, вызываемой химиотерапией; для стимуляции восстановления костного мозга после облучения и химиотерапии; для предупреждения развития вторичных инфекций, обусловленных иммуносупрессией, вызываемой стандартной химиотерапией и хирургическим вмешательством; для повышения показателя полного и частичного ответа на противораковую терапию; и для улучшения функции лимфоцитов и механизмов биологической защиты.

Иммунная система состоит из множества различных клеток, включая T-клетки, B-клетки, NK-клетки и т.п. Эти различные клетки варьируются по своей природе. Незрелые T-клетки образуются в костном мозге, а затем они мигрируют в тимус. В тимусе происходят различные процессы, которые приводят к продуцированию зрелых T-клеток и к секреции различных пептидов, регулирующих иммунный ответ. T-клетки могут быть подразделены на несколько подгрупп, например T-хелперные клетки, T-цитотоксические клетки, T-клетки памяти и регуляторные T-клетки. Клетки каждой такой подгруппы играют свою определенную роль в иммунном ответе. Клетки этих подгрупп характеризуются различными антигенами, присутствующими на их мембранах. Так, например, T-хелперные клетки представляют антиген CD4 на своей мембране, а T-цитотоксические клетки представляют антиген CD8 на своей мембране.

CD4⁺-T-клетки играют регуляторную роль и, очевидно, ассоциируются с периферической аутотолерантностью. Предположение о существовании тимусных регуляторных T-клеток было сначала высказано ранее, исходя из того факта, что аутоиммунное заболевание у мышей начинает развиваться на 3-й день после тимэктомии. При этом было обнаружено, что такие расстройства обусловлены потерей периферических CD4⁺-Т-клеток, конститутивно экспрессирующих IL-2R альфа (CD25), которые появляются на периферии значительно позже после рождения. Физиологически генерируемые CD4⁺-CD25⁺-клетки подавляют аутоиммунные и воспалительные расстройства широкого ряда, например колит.

Несмотря на многочисленные исследования, механизм регуляторного действия CD4⁺-CD25⁺-Т-клеток остается неясным. Некоторые исследования показали, что регуляция in vivo зависит от продуцирования цитокинов-супрессоров, таких как IL-10 и ТGF-β и молекул клеточной поверхности, таких как CTLA-4. In vivo исследования показали, что супрессорный эффект опосредован не цитокинами, а клеточным взаимодействием.

В общих чертах сообщалось, что in vivo CD8⁺-Т-клетки играют главную роль в предупреждении экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и способствуют пероральной толерантности. Регуляторные CD8⁺-CD28^--T-клетки могут быть генерированы и размножены in vitro путем проведения множества раундов стимуляции аллогенными АПК, но при этом не известно, существует ли такая популяция in vivo. Новое исследование выявило новую популяцию регуляторных CD8⁺-клеток, которые также конститутивно экспрессируют CD25 и которые обладают свойствами, очень похожими на свойства CD4⁺-CD25⁺-клеток.

Эти клетки продуцируют IL-10, Foxp3 и CTLA-4 и ингибируют CD25^--T-клеточный ответ на стимуляцию анти-CD3-антителом, опосредуемую межклеточными взаимодействиями, с эффективностью, аналогичной эффективности действия CD4⁺-CD25⁺-клеток.

Очевидно, что эти 2 субпопуляции CD4⁺-CD25⁺-клеток и CD8⁺-CD25⁺-клеток участвуют в регуляции иммунного ответа.

Описание сущности изобретения

Целью настоящего изобретения является выделение тимус-специфического белка из человеческого тимуса.

С помощью ПЦР библиотеки человеческих кДНК, выделенные из 16 различных тканей 20-летних женщин, были подвергнуты скринингу, и была идентифицирована уникальная кДНК человеческого тимуса. Пептид, кодируемый указанной кДНК, был обозначен Т101. Были подвергнуты скринингу банки человеческих, мышиных и крысиных EST, но какого-либо сходства кДНК Т101 с любым из известных генов обнаружено не было. Аналогичные результаты были получены с использованием банков белков и полноразмерных геномных ДНК. Указанная последовательность кДНК и соответствующая аминокислотная последовательность являются новыми последовательностями, которые не были описаны ранее.

Пептид, кодируемый указанной кДНК, имеет длину в 84 аминокислоты и включает в себя сигнальный пептид, состоящий из 33 аминокислот и присутствующий на N-конце (см. фиг.1). Ниже приводятся последовательность кДНК (SEQ ID NO:1) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) Т101:

atgatggcactcagaagccaggggctcatgttaccccaga

gctgcccacaactggctttcctcaccctaagtgccttggc

agcagtgtctttttcagctctgcatctctggcttagtggg

gagccagtccagagctctggaacaaaggacatgagatcca

aatccgattccaagcgagtgagtgacaagcagctaatttc

caaagctgtgtggtggacattttttcttccttcaaccctc

tgggagagaaaatga (SEQ ID NO:1)

MMАLRSQGLMLPQSCPQLAFLTLSALAAVSFSALHLWLSG

EPVQSSGTKDMRSKSDSKRVSDKQLISKAVWWTFFLPSTL

WERK (SEQ ID NO:2)

Настоящее изобретение относится также к молекуле нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1 и к пептиду SEQ ID NO:2. Полипептид SEQ ID NO:2 будет далее называться “полноразмерным пептидом T101”.

Полноразмерный пептид Т101 также включает в себя сигнальную последовательность в 33 аминокислоты. Таким образом, настоящее изобретение относится также к пептиду, составляющему последовательность полноразмерного пептида Т101, не содержащего указанный сигнальный пептид и имеющего следующую последовательность (SEQ ID NO:4):

LHLWLSGEPVQSSGTKDMRSKSDSKRVSDKQLISKAVWWT

FFLPSTLWERK (SEQ ID NO:4)

Пептид Т101, который не содержит сигнальной последовательности (SEQ ID NO:4), будет далее называться “пептидом Т101”.

Настоящее изобретение относится также к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую пептид Т101. Эта последовательность включает в себя нижеследующую последовательность (SEQ ID NO:3):

catctctggcttagtggggagccagtccagagctctggaacaaag

gacatgagatccaaatccgattccaagcgagtgagtgacaagcag

ctaatttccaaagctgtgtggtggacattttttcttccttcaacc

ctctgggagagaaaatga (SEQ ID NO:3)

Настоящее изобретение относится также к модифицированным молекулам нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3 и к модифицированным пептидам SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, в которых добавлены, делетированы или заменены один или несколько нуклеотидов или аминокислотных остатков соответственно, где указанные модификации не оказывают значительного влияния на биологические свойства указанной модифицированной молекулы по сравнению с немодифицированной молекулой.

Используемый здесь термин “пептид” означает пептид, полипептид или белок. Этот пептид может быть получен путем синтеза, методами генной инженерии, путем экспрессии в клетке-хозяине или любыми другими подходящими методами.

Термин “биологические свойства”, относящийся к пептидной молекуле, означает, что эта молекула имеет по меньшей мере одну in vitro или in vivo активность, которой может обладать полноразмерный пептид Т101 или пептид Т101, включая, но не ограничиваясь ими, биологические активности, описанные ниже в разделе “Примеры”. Термин “биологические свойства”, относящийся к молекуле нуклеиновой кислоты, означает способность этой молекулы кодировать пептид, имеющий биологические свойства, аналогичные биологическим свойствам полноразмерного пептида Т101 или пептида Т101, включая, в частности, (i) молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность, которая отличается от последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, но которая вследствие избыточности генетического кода кодирует полноразмерный пептид Т101 или пептид Т101 соответственно; и (ii) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности полноразмерного пептида Т101 или пептида Т101, но которая имеет биологические свойства, аналогичные биологическим свойствам полноразмерного пептида Т101 или пептида Т101 соответственно.

Термин “не оказывает значительного влияния на биологические свойства модифицированной молекулы по сравнению с немодифицированной молекулой” означает, что указанная модифицированная молекула сохраняет биологическую активность, которая по своим качествам аналогична активности немодифицированной молекулы. В отношении модифицированного пептида этот термин означает, что указанный пептид сохраняет одно или несколько биологических свойств пептида SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, включая среди прочих его диагностическую и терапевтическую эффективности, описанные ниже, а также in vitro и in vivo активности, описанные ниже в разделе “Примеры”. Для того, чтобы определить, сохраняет ли данный пептид биологическую активность, которая качественно аналогична активности немодифицированной молекулы, можно провести один или несколько анализов, таких, например, как in vitro, in vivo или клинический эксперимент, в котором модифицированный пептид сравнивают с соответствующим немодифицированным пептидом (а именно с полноразмерным пептидом Т101 или пептидом Т101), которые подвергают параллельному анализу; или эксперимент, в котором указанный модифицированный пептид анализируют для того, чтобы определить, обладает ли он биологической активностью, аналогичной активности немодифицированного пептида, которая была установлена в отдельно проводимом эксперименте. Такие эксперименты могут быть проведены, например, как описано ниже в разделе “Примеры”. В отношении модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты термин “не оказывает значительного влияния на биологические свойства модифицированной молекулы по сравнению с немодифицированной молекулой” означает, что указанная молекула способна кодировать модифицированный пептид, имеющий любые из вышеупомянутых свойств.

Модифицированным пептидом может быть пептид, включающий в себя последовательность смежных аминокислот, состоящую по меньшей мере из 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или по меньшей мере из 45 аминокислотных остатков, которые по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, а в частности по меньшей мере на 95% идентичны соответствующей последовательности, состоящей по меньшей мере из 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или по меньшей мере из 45 аминокислотных остатков, присутствующих в пептиде Т101.

Настоящее изобретение относится также к пептиду, содержащему неполную последовательность из смежных аминокислот, происходящую из полноразмерного пептида Т101 и включающую в себя по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, где указанная непрерывная последовательность представляет собой последовательность из смежных аминокислот, присутствующую в указанном полноразмерном пептиде Т101. Такой пептид будет далее называться “неполным пептидом Т101”. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к неполному пептиду Т101, содержащему нижеследующую непрерывную последовательность из 13 смежных аминокислотных остатков, начинающихся с N-конца пептида Т101 (аминокислоты 39-51):

WTFFLPSTLWERK (SEQ ID NO:5)

Настоящее изобретение относится также к белку или полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность полноразмерного пептида Т101, пептида Т101, модифицированного пептида или неполного пептида Т101 (такой пептид или полипептид будет далее называться “Т101-содержащим белком”). Т101-содержащий белок может, например, представлять собой гибридный белок, включающий в себя полноразмерный пептид Т101, пептид Т101, модифицированный пептид или неполный пептид Т101; и он может представлять собой конъюгат белка или другого пептида или полипептида с полноразмерным пептидом Т101, пептидом Т101, модифицированным пептидом или неполным пептидом Т101 и т.п.

Настоящее изобретение относится также к олигонуклеотиду, состоящему по меньшей мере из 24 нуклеотидов и представляющему собой (i) олигонуклеотид, который кодирует неполную непрерывную последовательность из смежных аминокислот пептида Т101, включающую в себя по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, и который может включать в себя непрерывную последовательность из 24 смежных нуклеиновых кислот, присутствующих в SEQ ID NO:1; (ii) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 в условиях гибридизации высокой жесткости; (iii) олигонуклеотид, имеющий последовательность, которая состоит по меньшей мере из 24 смежных нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, а в частности по меньшей мере на 95% идентична соответствующей непрерывной последовательности из смежных нуклеотидов, присутствующих в SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение относится также к молекуле нуклеиновой кислоты, например к вектору для переноса или к экспрессионному вектору, содержащему любую из вышеупомянутых молекул нуклеиновой кислоты.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к нижеследующим дополнительным неполным пептидам Т101:

SGEPVQSSGTKDMRSKSDSKRVS (SEQ ID NO:6)

DKQLISKAVWWTFFLPSTLWERK (SEQ ID NO:7)

PSTLWERK (SEQ ID NO:8)

AVWWTFFLPSTLW (SEQ ID NO:9)

KREWLTSPLFFTWWVA (SEQ ID NO:10)

WTFFL (SEQ ID NO:11)

Последовательность SEQ ID NO:6 состоит из аминокислот 6-28 пептида Т101; последовательность SEQ ID NO:7 состоит из аминокислот 29-51 пептида Т101; последовательность SEQ ID NO:8 состоит из аминокислот 44-51 пептида Т101; последовательность SEQ ID NO:9 состоит из аминокислот 36-48 пептида Т101; последовательность SEQ ID NO:10 состоит из аминокислот 36-51 пептида Т101, расположенных в обратном порядке; последовательность SEQ ID NO:11 состоит из аминокислот 39-43 пептида Т101.

Настоящее изобретение относится также к модифицированным пептидам, происходящим из любого из пептидов, определяемых выше, например к модифицированным пептидам, в которых одна или несколько аминокислот заменены другими аминокислотами путем консервативной замены. Используемый здесь термин “консервативная замена” означает замену аминокислоты одного класса аминокислотой того же класса, где класс аминокислот определяется общими физико-химическими свойствами боковых цепей аминокислот и высокой частотой замен в гомологичных белках, наблюдающихся в природе. Существует шесть общих классов боковых цепей аминокислот, и такими классами являются: класс I (Cys); класс II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); класс III (Asn, Asp, Gln, Glu); класс IV (His, Arg, Lys); класс V (Ile, Leu, Val, Met) и класс VI (Phe, Tyr, Trp). Так, например, замена Asp другим остатком класса III, таким как Asn, Gln или Glu, является консервативной заменой.

В одном из вариантов изобретения в аминокислотной последовательности имеется только одна замена. В другом варианте изобретения в аминокислотной последовательности имеются две замены. В еще одном варианте изобретения в аминокислотной последовательности имеются три замены. Максимальное число замен не должно превышать число аминокислот, которое составляет по меньшей мере 70%, желательно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, а наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% от всех аминокислот в немодифицированной последовательности. В одном из предпочтительных вариантов изобретения замены, которые включают до 3, порой до 6 аминокислотных остатков, замененных другими остатками, являются консервативными заменами.

В другом варианте осуществления одна или несколько аминокислот могут быть заменены D-аминокислотами, а предпочтительно соответствующими D-аминокислотами.

В еще одном варианте настоящее изобретение также включает в себя последовательности, расположенные в обратном порядке по отношению к вышеуказанным последовательностям.

Так, например, настоящее изобретение относится также к полноразмерным пептидам Т101 SEQ ID NO:2, или предпочтительно к пептидам Т101 SEQ ID NO:4, или к неполным последовательностям Т101, модифицированным путем одной или нескольких консервативных замен.

Настоящее изобретение относится также к пептиду, включающему в себя по меньшей мере 10 или 15, или 20, или 25, или 30, или 35, или 40 аминокислотных остатков, или к полноразмернму пептиду Т101, имеющему последовательность: AA ₁ ,-AA ₂ -...-AA ₅₁, где

AA₁ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₂ выбран из лизина, аргинина и гистидина;

AA₃ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₄ выбран из триптофана, фенилаланина и тирозина;

AA₅ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₆ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₇ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₈ выбран из глутамина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и аспарагина;

AA₉ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₁₀ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₁₁ выбран из глутамина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и аспарагина;

AA₁₂ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₁₃ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₁₄ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₁₅ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₁₆ выбран из лизина, аргинина и гистидина;

AA₁₇ выбран из глутамина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и аспарагина;

AA₁₈ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₁₉ выбран из лизина, аргинина и гистидина;

AA₂₀ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA_2I выбран из лизина, аргинина и гистидина;

AA₂₂ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₂₃ выбран из глутамина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и аспарагина;

AA₂₄ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₂₅ выбран из лизина, аргинина и гистидина;

AA₂₆ выбран из лизина, аргинина и гистидина;

AA₂₇ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₂₈ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₂₉ выбран из глутамина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и аспарагина;

AA₃₀ выбран из лизина, аргинина и гистидина;

AA₃₁ выбран из глутамина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и аспарагина;

AA₃₂ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₃₃ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₃₄ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₃₅ выбран из лизина, аргинина и гистидина;

AA₃₆ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₃₇ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₃₈ выбран из триптофана, фенилаланина и тирозина;

AA₃₉ выбран из триптофана, фенилаланина и тирозина;

AA₄₀ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₄₁ выбран из триптофана, фенилаланина и тирозина;

AA₄₂ выбран из триптофана, фенилаланина и тирозина;

AA₄₃ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₄₄ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₄₅ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₄₆ выбран из серина, треонина, аланина, глицина и пролина;

AA₄₇ выбран из лейцина, изолейцина, валина и метионина;

AA₄₈ выбран из триптофана, фенилаланина и тирозина;

AA₄₉ выбран из глутамина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты и аспарагина;

AA₅₀ выбран из лизина, аргинина и гистидина; и

AA₅₁ выбран из лизина, аргинина и гистидина.

Настоящее изобретение относится также к модифицированным пептидам, полученным на основе полноразмерного пептида Т101, пептида Т101 или неполного пептида Т101, включающим в себя нижеследующие подпоследовательности (аминокислоты пронумерованы в соответствии с нумерацией пептида Т101):

AA ₃₈ -AA ₃₉ -AA ₄₀ -AA ₄₁ -AA ₄₂, где AA₃₈ и AA₃₉ представляют собой аминокислоты класса VI, предпочтительно триптофан; AA₄₀ представляет собой аминокислоту класса II, предпочтительно треонин; а AA₄₁ и AA₄₂ представляют собой аминокислоты класса VI, предпочтительно фенилаланин;

AA ₃₈ -AA ₃₉ -AA ₄₀ -AA ₄₁ -AA ₄₂ -AA ₄₃, где AA₃₈ и AA₃₉ представляют собой аминокислоты класса VI, предпочтительно триптофан; AA₄₀ представляет собой аминокислоту класса II, предпочтительно треонин; AA₄₁ и AA₄₂ представляют собой аминокислотаы класса VI, предпочтительно фенилаланин; и AA₄₃ представляет собой аминокислоту класса V, предпочтительно лейцин;

Ala-Val-AA ₃₈ -AA ₃₉ -AA ₄₀ -AA ₄₁ -AA ₄₂, где AA₃₈ и AA₃₉ представляют собой аминокислоты класса VI, предпочтительно триптофан; AA₄₀ представляет собой аминокислоту класса II, предпочтительно треонин; и AA₄₁ и AA₄₂ представляют собой аминокислоты класса VI, предпочтительно фенилаланин;

Ala-Val-AA ₃₈ -AA ₃₉ -AA ₄₀ -AA ₄₁ -AA ₄₂ -AA ₄₃, где AA₃₈ и AA₃₉ представляют собой аминокислоты класса VI, предпочтительно триптофан; AA₄₀ представляет собой аминокислоту класса II, предпочтительно треонин; AA₄₁ и AA₄₂ представляют собой аминокислоты класса VI, предпочтительно фенилаланин; и AA₄₃ представляет собой аминокислоту класса V, предпочтительно лейцин.

Подпоследовательность из 24 аминокислот SEQ ID NO:4 (аминокислоты 24-47):

SKRVSDKQLISKAVWWTFFLPSTL (SEQ ID NO:12),

имеет близкое сходство с нижеследующими последовательностями, происходящими от млекопитающих других видов, а именно:

от собак: SKQVSDKQLISKAVQRIFFFLQPS (SEQ ID NO:13); и

от крыс: SKFMSDKQLISKAVQRIFFLSSTL (SEQ ID NO:14).

При сравнении последовательностей SEQ ID NO:12-14 была выявлена нижеследующая консенсусная последовательность для млекопитающих трех видов (показана заглавными буквами):

SKrvSDKQLISKAVwwtFFLpSTL (SEQ ID NO:12)

SKqvSDKQLISKAVQRIFFflqps (SEQ ID NO:13)

SKfmSDKQLISKAVQRIFFLsSTL (SEQ ID NO:14)

Настоящее изобретение относится также к пептиду, содержащему указанную консенсусную последовательность. Такой пептид (называемый здесь “консенсусным пептидом”) имеет одну из нижеследующих формул:

SKx ₁ x ₂ SDKQLISKAVx ₃ x ₄ x ₅ FFLx ₆ STL (SEQ ID NO:15);

SKx ₁ x ₂ SDKQLISKAVx ₃ х ₄ x ₅ FFLx ₆ (SEQ ID NO:16);

SKx ₁ x ₂ SDKQLISKAVQRIFF (SEQ ID NO:17); или

SKx ₁ x ₂ SDKQLISKAVQRIFFLx ₆ STL (SEQ ID NO:18);

где

х₁ представляет собой R, Q или F, или, альтернативно, как результат консервативной замены, H, K, N, D, E, Y или W;

x₂ представляет собой V или M, или, альтернативно, как результат консервативной замены, I или L;

х₃ представляет собой W или Q, или, альтернативно, как результат консервативной замены, F, Y, N, D или E;

х₄ представляет собой W или R, или, альтернативно, как результат консервативной замены, F, Y, H или K;

х₅ представляет собой T или I, или, альтернативно, как результат консервативной замены, S, P, A, G, L, V или M; и

х₆ представляет собой P, L или S, или, альтернативно, как результат консервативной замены, T, A, G, I, V или M.

Настоящее изобретение относится также к белку или к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность указанного консенсусного пептида. Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной последовательности, кодирующей указанные консенсусные пептиды, или белок, или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность указанного консенсусного пептида.

Т101 является растворимым в водном растворе. Это его свойство и биологические свойства, описанные ниже, а также его тканеспецифичность и физические свойства, характерные для пептидного гормона, способствуют тому, что указанный пептид Т101, полноразмерный пептид Т101, неполный пептид Т101 или любые их модификации могут быть использованы в качестве терапевтических средств для индуцирования клеточного иммунного ответа и для лечения различных других клинических состояний, таких как ВИЧ-инфекция, гепатит В, гепатит С, рак и малярия.

Как будет также показано в нижеследующих примерах, было обнаружено, что пептид Т101 и происходящие от него различные модифицированные пептиды обладают способностью модулировать иммунную систему. Такая модуляция выражается в активации иммунной системы (на что указывает, например, увеличение уровня пролиферации лимфоцитов периферической крови (ЛПК)), а также в подавлении иммунной системы (на что указывает, например, увеличение уровня продуцирования IL-10 и снижение числа ЛПК). Таким образом, Т101 обладает как иммуноактивирующей, так и иммуноингибирующей способностью. Не претендуя на какую-либо конкретную теорию и не ограничивая объема настоящего изобретения, можно сказать, что механизм действия Т101 на иммунную систему может зависеть от его концентрации.

Настоящее изобретение относится также к способам лечения, к способам диагностики и к фармацевтическим композициям, в которых используется указанный пептид Т101, полноразмерный пептид Т101, неполный пептид Т101, модифицированный пептид Т101, или Т101-содержащий белок, или любые молекулы нуклеиновой кислоты, упомянутые выше. Пептид Т101 может иметь нижеследующие диагностические и терапевтические применения:

1. Т101 может служить в качестве средства для диагностики отсутствия иммунокомпетентности после подкожной инъекции токсинов, выделенных из различных организмов.

2. Определение уровня Т101 в крови может служить показателем повышенной или пониженной функции тимуса и показателем уровня активности иммунной системы.

3. Уровень Т101 может служить в качестве индикатора аутоиммунных заболеваний.

4. Т101 может служить стимулятором иммунной системы. Так, например, Т101 может быть использован для лечения состояния, ассоциированного с отсутствием иммунокомпетентности в отношении бактерий, паразитов и вирусных токсинов.

5. Т101 может быть использован в качестве диагностического средства для предотвращения рецидивов инфекций. Так, например, Т101 должен снижать число рецидивов инфекций в дыхательных путях.

6. Т101 может быть использован в качестве терапевтического средства для ослабления аллергических и воспалительных реакций. Так, например, Т101 может быть использован для снижения заболеваемости астмой или ослабления ее симптомов.

7. Т101 может быть использован для лечения вирусных заболеваний, таких как туберкулез, герпес, острый и хронический гепатит В, острый и хронический гепатит С, хронический холестатический гепатит, цирроз и стоматит.

8. Т101 может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения заболеваний, ассоциированных с иммунодефицитом, таких как СПИД и комбинированный иммунодефицит.

9. Т101 может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения кожных болезней, таких как атопическая экзема и псориаз.

10. Т101 может быть использован для лечения некоторых других заболеваний. Так, например, Т101 может быть использован в качестве ингибитора иммунной системы для лечения аутоиммунных патологий, таких как ВЗК, тяжелая миастения, рассеянный склероз, диабет типа I, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, склеродермия, хроническая аутоиммунная гемолитическая анемия, колит, болезнь Крона и т.п.

11. Т101 может быть использован в качестве стимулятора иммунной системы для лечения таких злокачественных заболеваний, как рак легких, карцинома гортани, карцинома головы и шеи, карцинома молочной железы, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома, рак молочной железы, гепатоцеллюлярный рак и меланома.

12. Т101 может быть использован для предотвращения возникновения инфекций после хирургических операций и имплантаций. Т101 может быть использован после трансплантации для ингибирования отторжения трансплантата.

13. Т101 может быть использован для усиления иммунного ответа у пожилых или более молодых людей или у людей с нарушенной иммунной системой.

14. Т101 может быть использован для лечения кожных инфекций после ожогов.

15. Т101 может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения бесплодия у мужчин.

16. Т101 может повышать сердечную активность.

17. Т101 может быть использован в методе идентификации клеток тимуса. Т101 может служить также тимусным маркером и показателем метаболического состояния тимуса. Так, например, Т101 может быть использован в ELISA-анализах или в других анализах для измерения метаболического состояния тимуса.

18. Т101 может быть использован в качестве средства для проявления флуоресцентного красителя в целях выявления специфических субпопуляций лейкоцитов для выделения различных субпопуляций лейкоцитов из различных тканей.

19. Т101 может служить в качестве общего стимулятора или ингибитора различных иммунных реакций и может также непосредственно или опосредованно влиять на другие органы, такие как сердце, легкие и т.п.

20. Т101 может быть использован для модуляции функций нервной системы, таких как память и регенерация нервной системы, а также для ослабления боли и лечения патологических состояний нервной системы, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера.

21. Т101 может служить в качестве зонда для идентификации специфических клеток иммунной системы и их использования для клеточной терапии.

Для вышеуказанных диагностических и терапевтических целей могут быть также использованы полноразмерный пептид Т101, неполный пептид Т101, Т101-содержащий белок или модифицированный пептид Т101.

Краткое описание графического материала

Для лучшего понимания настоящего изобретения и для облегчения его осуществления ниже будут описаны результаты экспериментов, проводимых в соответствии с настоящим изобретением, со ссылками на прилагаемый графический материал, где:

На фиг.1 представлена полноразмерная последовательность кДНК Т101 и кодируемый ею полноразмерный пептид Т101. “Полноразмерный” пептид Т101 состоит из сигнального пептида (показанного обычным шрифтом) и пептида Т101 (показанного жирным шрифтом). Аналогичным образом показана кДНК, кодирующая сигнальный пептид.

На фиг.2 представлена фотография ПЦР-геля, иллюстрирующего пептид Т101. Этот гель содержал 12 столбцов и был подвергнут электрофорезу с двумя массивами образцов: один массив находился в верхней части геля, а другой массив находился в середине геля (показано линиями с обеих сторон геля).

На фиг.3 графически показано включение BrdU в человеческие ЛПК, которые были инкубированы с пептидом Т101, по сравнению с контролем. По оси Y отложена оптическая плотность при 450 нм, где более высокое значение OD означает более высокий уровень включения BrdU.

На фиг.4 графически показано включение BrdU в тимоциты мышей Balb/с, которые были инкубированы с пептидом Т101, по сравнению с контролем. На оси Y отложена оптическая плотность при 450 нм, где более высокое значение OD означает более высокий уровень включения BrdU.

На фиг.5 представлена флуоресцентная микрофотография лимфоцитов после инкубирования с биотинилированным пептидом Т101.

На фиг.6 представлена гисто