Способ дифференциальной диагностики различных форм гонококковой инфекции при ее малосимптомном течении

Способ дифференциальной диагностики различных форм гонококковой инфекции при ее малосимптомном течении

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии и может использоваться для ранней диагностики в венерологии.

В частности, способ предназначен для дифференциальной диагностики локализованной и системной гонококковой инфекции.

Особенностью современной гонореи является увеличение вялотекущих, малосимптомных вариантов заболевания, длительное течение, многоочаговость поражения [1, 9]. В отличие от манифестных форм, клиническая диагностика которых не представляет трудности, перечисленные варианты гонореи обусловливают несвоевременную диагностику и вследствие этого нерациональную терапию, что приводит к широкому распространению инфекции и влечет за собой ряд личностных, экономических и демографических проблем [2].

Учитывая сказанное, становится очевидной необходимость эффективного способа дифференциальной диагностики различных форм гонококковой инфекции, чтобы предупредить развитие генерализованных форм гонореи своевременной адекватной терапией.

Известен способ диагностики гонореи, при котором выявляют гонококков по мазкам с колоний, окрашенных раствором кристаллического фиолетового, и до окраски кристаллическим фиолетовым проводят их последовательную обработку 0,6-1,0%-ным водным раствором триаммонийной соли ауринтрикарбоновой кислоты в течение 4-5 мин и в составе, содержащем сафранин Т, хлорид алюминия и воду при определенном соотношении компонентов в течение 2-3 мин, после чего мазок покрывают иммерсионным маслом, обрабатывают ацетоном, а окрашивание проводят в 1%-ном водном растворе кристаллического фиолетового в течение 30-35 с [2].

Однако этот способ не позволяет дифференцировать различные формы гонококковой инфекции ни по какому признаку, указывая лишь на наличие возбудителя.

Известен способ диагностики гонореи путем исследования крови больного, заключающийся в том, что к исследуемой крови добавляют живую культуру гонококков в концентрации 3·10⁹ клеток/мл и нитросиний тетразолий в соотношении 2:1:1, инкубируют, делают мазок и окрашивают 0,01%-ным раствором нейтрального красного, далее подсчитывают количество нейтрофилов с отложениями диформазана и при количестве их выше 16% диагностируют гонорею.

Данный способ основан на оценке параметров общего иммунитета, является отборочным тестом при массовом обследовании на гонорею и не позволяет не только дифференцировать формы гонореи, но и достоверно поставить сам диагноз гонококковой инфекции.

Известен способ дифференциальной диагностики реинфекции и рецидива при гонорее и негонококковых уретритах, основанный на определении показателей местного иммунитета. Способ заключается в том, что при микроскопическом исследования окрашенных мазков из уретры и шейки матки определяют процентное количество макрофагов относительно общего числа белых клеток и при значении показателя 6% и более диагностируют реинфекцию, а при значении 4% и менее - рецидив [5].

Указанный способ по совокупности признаков является наиболее близким заявляемому. Данный способ взят в качестве прототипа.

В указанном способе оцениваются факторы местного иммунитета, что позволяет оценить давность инфекции. Однако этот метод имеет ряд существенных недостатков. Он не позволяет дифференцировать формы гонококкового процесса по распространенности по системам организма, характеризуя лишь длительность инфекционного заболевания, которая не всегда коррелирует с распространенностью воспалительного процесса. Между тем, абсолютно необходимым является уточнение именно объема поражения урогенитального тракта, так как от этого напрямую зависит тактика лечения. По приказу МЗ РФ от 20 августа 2003 г. №415 «Об утверждении протокола ведения больных «Гонококковая инфекция» выделяют две модели течения гонококковой инфекции: гонококковая инфекция локализованная (ГИЛ) включает следующие формы согласно Международной Классификации Болезней десятого пересмотра - А54.0, А54.3, А54.5, А54.6; гонококковая инфекция с системными проявлениями (ГИСП) - А54.1, А54.2, А54.4, А54.8. Схемы лечения ГИЛ и ГИСП отличаются по длительности лечения, дозировке вводимых препаратов и по срокам контроля излеченности [6]. Кроме того, известен факт несостоятельности клеточного иммунитета при гонококковой инфекции вследствие способности гонококка индуцировать незавершенный фагоцитоз, по причине которого макрофаги не являются серьезным препятствием для развития системного гонококкового процесса [7].

В то же время в антимикробной защите слизистой урогенитального тракта, препятствующей развитию генерализованных вариантов инфекции, участвуют не только макрофаги, но и другие, не менее эффективные бактерицидные факторы (лизоцим, лактоферрин, секреторные антитела и др.), уровень которых не учитывается в способе-прототипе.

Задачей настоящего технического решения является расширение ассортимента способов диагностики форм гонококковой инфекции при ее малосимптомном течении и повышение точности диагностики.

Поставленная задача решается путем отбора отделяемого урогенитального тракта у страдающего малосимптомной гонококковой инфекцией и определения иммунологических показателей этого отделяемого, причем в качестве отделяемого у мужчин берут эякулят, у женщин - отделяемое цервикального канала, а в качестве иммунологических показателей определяют содержание секреторного иммуноглобулина А и содержание лактоферрина, и при уровне секреторного иммуноглобулина А 2,51 мкг/мл и менее и одновременном уровне лактоферрина 6965 нг/мл и более диагностируют гонококковую инфекцию с системными проявлениями, а при невыполнении указанного условия диагностируют локализованную гонорею.

Предлагаемый способ неизвестен из уровня техники, следовательно является новым. Новизной предлагаемого способа является то, что при постановке диагноза гонококковой инфекции одновременно оценивают содержание секреторного иммуноглобулина А и лактоферрина в отделяемом урогенитального тракта, которые являются информативными критериями для дифференцировки ГИЛ и ГИСП.

Существенным отличием предлагаемого способа является то, что оценивается не один, а два параметра местного иммунитета, причем оценивается не клеточный, а гуморальный иммунитет, а именно уровни секреторного иммуноглобулина А и лактоферрина и при уровне секреторного иммуноглобулина А 2,51 мкг/мл и менее и одновременном уровне лактоферрина 6965 нг/мл и более диагностируют гонококковую инфекцию с системными проявлениями, а при невыполнении указанного условия диагностируют локализованную гонорею.

Достигаемый при осуществлении способа технический результат состоит в том, что новый способ дифференцирования локализованной и системной гонококковой инфекции при отсутствии клинических симптомов позволяет, исключив определение состояния клеточного иммунитета, что недостаточно для постановки точного клинического диагноза, проводить дифференцирование локализованной и системной форм гонококковой инфекции, определяя уровни секреторного иммуноглобулина А и лактоферрина, что информативно, просто, доступно для любой иммунологической лаборатории.

Таким образом, точность дифференцировки предложенным способом повышается за счет выявления тех пациентов с малосимптомной гонореей, для которых по способу-прототипу было невозможно установить точный клинический диагноз из-за отсутствия критериев для учета распространенности гонококковой инфекции по тканям организма.

Новыми признаками заявляемого способа являются:

- определяют одновременно содержание секреторного иммуноглобулина А и содержание лактоферрина в отделяемом урогенитального тракта;

- диагностируют гонококковую инфекцию с системными проявлениями при одновременном значении уровня секреторного иммуноглобулина А - не более 2,51 мкг/мл и значении уровня лактоферрина - не менее 6965 нг/мл.

Наличие первого признака в заявляемом способе позволяет выявить новые более информативные признаки для диагностики гонококковой инфекции, что в итоге позволяет повысить точность дифференциальной диагностики. Практика лечения показала, что гонококк существенно влияет на содержание факторов местной защиты слизистых оболочек, что может повлиять на характер развития инфекции.

Второй новый признак позволяет уточнить первый новый признак за счет установления одновременного наличия двух граничных значений: уровня секреторного иммуноглобулина А и уровня лактоферрина. Каждый из этих факторов косвенно отражает степень снижения иммунных свойств организма пациента, а вместе эти факторы в итоге позволяют при простой реализации повысить точность прогноза.

Новая совокупность признаков позволяет при осуществлении заявляемого изобретения получить новый технический результат, который состоит в том, что новый способ позволяет с высокой точностью дифференцировать ГИЛ и ГИСП, что, в свою очередь, позволяет осуществить индивидуальный подход к лечению больных, выбрав адекватную антибиотикотерапию, а также провести коррекцию факторов иммунитета барьерного эпителия мочеполового тракта.

В основу предлагаемого способа положено новое знание, полученное в результате экспериментального исследования изменения содержания факторов местного иммунитета, а именно секреторного иммуноглобулина А и лактоферрина в секрете урогенитального тракта при различном течении гонококковой инфекции.

Лактоферрин оказывает бактериостатическое действие на рост бактерий на поверхности барьерных эпителиев и в фаголизосомах нейтрофильных гранулоцитов, связанное с его способностью создавать и поддерживать дефицитную по катионам железа и других металлов переменной валентности среду, то есть между бактериями и лактоферрином идет конкуренция за железо, повышающее вирулентность последних. Вместе с тем известно, что уровень лактоферрина, как острофазового белка из семейства трансферринов, в значительной степени регулируется провоспалительными цитокинами, и содержание его существенно изменяется при воспалении. Поэтому в лабораторной и клинической практике значения содержания лактоферрина используются для оценки степени активности воспалительной реакции, как критерий эффективности противовоспалительной терапии [8]. Использование количественной оценки содержания лактоферрина в отделяемом урогенитального тракта больных гонореей для диагностики в источниках патентной и научно-технической литературы не обнаружено.

Секреторные иммуноглобулины А являются наиболее важными антителами местной защиты, обеспечивающими предотвращение колонизации слизистых оболочек посторонними микроорганизмами. Изменение количества секреторного иммуноглобулина А определяется с целью оценки иммунного статуса [7]. Однако использование количественной оценки содержания секреторного иммуноглобулина А в отделяемом урогенитального тракта больных гонореей для диагностики в источниках патентной и научно-технической литературы не обнаружено. Тем более отсутствуют сведения об одновременном контроле уровней этих двух показателей с целью дифференцировки различных форм гонореи.

Авторы впервые обнаружили, что при гонококковой инфекции с системными проявлениями снижается уровень секреторного иммуноглобулина А и одновременно повышается уровень лактоферрина по сравнению со здоровыми, тогда как при локализованной форме таких изменений не было. Определялись также показатели клеточного иммунитета - доля макрофагов относительно общего числа белых клеток по способу-прототипу (см. таблицу 1).

Таблица 1
Показатели местного иммунитета здоровых и больных разными формами гонореи
Обследуемые	Показатели местного иммунитета
Лактоферрин, нг/мл	sIgA, мкг/мл	доля макрофагов относительно общего числа белых клеток, %
Предлагаемый способ*	Прототип
Больные с локализованной формой гонореи n=30	6349±58**	6,54±2,06**	16
Больные гонореей с системными проявлениями n-31	6876±89#	3,0±0,50#	18
Примечания: * - При доверительной вероятности Р=0,95, ** - значения иммунологических показателей у больных с локализованной формой гонореи (пример),# - граничные значения иммунологических показателей у больных с гонореей с системными проявлениями

Была установлена взаимосвязь между формой гонококковой инфекции и содержанием секреторного иммуноглобулина А и лактоферрина и определены граничные значения данных показателей (таблица 2).

Таблица 2.
Соответствие уровней исследуемых показателей характеру течения заболевания.
Показатели местного гуморального иммунитета
Уровень лактоферрина, нг/мл	Уровень sIgA, мкг/мл
<6965	<2,51
<6965	>2,51
>6965	>2,51
≥6965	≤2,51
>6965	<2,51
Примечание - * Принятые сокращения: ГИЛ - гонококковая инфекция локализованная;
ГИСП - гонококковая инфекция с системными проявлениями.

Эти данные легли в основу заявляемого способа.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Для проведения дифференциальной диагностики различных форм урогенитальной гонореи проводится забор исследуемого материала (эякулята у мужчин, отделяемого цервикального канала у женщин). Пробы центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин, отбирают супернатант (надосадочную жидкость) и проводят необходимые разведения образцов с использованием растворов для разведения проб из комплектов наборов для проведения иммуноферментного анализа (ИФА-набор) с получением рабочего разведения анализируемого образца. Для определения уровня секреторного иммуноглобулина А выполняют разведение 1/1000, а для определения уровня лактоферрина - 1/50. В соответствующие лунки планшетов с иммобилизированными на внутренней стороне поверхности моноклональными антителами к секреторному иммуноглобулину А или лактоферрину вносят в дубликатах по 100 мкл каждой калибровочной пробы (стандартные, прилагаются к ИФА-набору, используются для построения калибровочного графика), по 100 мкл контрольного образца и по 100 мкл анализируемых образцов в рабочем разведении. Планшеты инкубируют в течение 30 мин при температуре (37±1)°С. По окончании инкубации содержимое лунок удаляют и промывают рабочим промывочным раствором из ИФА-набора, после чего в каждую лунку вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата из того же набора и инкубируют в течение 30 мин при температуре (37±1)°С. Затем содержимое лунок удаляют и промывают рабочим промывочным раствором из ИФА-набора. Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора тетраметилбензидина и инкубируют в темноте в течение 10-15 мин при температуре 18-25°С. Во все лунки вносят по 100 мкл стоп-реагента при этом содержимое лунок окрашивается в желтый цвет. Затем проводят измерение величины оптической плотности растворов на фотометре вертикального сканирования на длине волны 450 нм. В соответствии с калибровочной зависимостью определяют массовую концентрацию секреторного иммуноглобулина А в мкг/мл и массовую концентрацию лактоферрина в нг/мл.

При уровне секреторного иммуноглобулина А 2,51 мкг/мл и менее и одновременном уровне лактоферрина 6965 нг/мл и более диагностируют гонококковую инфекцию с системными проявлениями, а при невыполнении указанного условия диагностируют локализованную гонорею.

Пример 1. Больной Д., 29 лет (амбулаторная карта №1127 за 2008 год) обратился в кожно-венерологический диспансер с жалобами на чувство дискомфорта при утреннем мочеиспускании. Болен в течение недели. Самостоятельно не лечился. Свое заболевание связывает с половым контактом с малознакомой женщиной. В анамнезе многочисленные незащищенные половые связи с разными партнершами. Был поставлен диагноз гонококковая инфекция локализованная (тотальный уретрит). При первичном обращении был осуществлен забор эякулята в объеме 0,5 мл. Пробу центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин, отделили супернатант и провели необходимые разведения образцов с использованием растворов для разведения проб из комплектов наборов для проведения иммуноферментного анализа (ИФА-набор), с получением рабочего разведения анализируемого образца. Для определения уровня секреторного иммуноглобулина А было выполнено разведение 1/1000, а для определения уровня лактоферрина - 1/50. В соответствующие лунки планшетов с иммобилизированными на внутренней стороне поверхности моноклональными антителами к секреторному иммуноглобулину А или лактоферрину вносили в дубликатах по 100 мкл каждой калибровочной пробы (стандартные, прилагаются к ИФА-набору, используются для построения калибровочного графика), по 100 мкл контрольного образца и по 100 мкл анализируемых образцов в рабочем разведении. Планшеты инкубировали в течение 30 мин при температуре (37±1)°С. Затем содержимое лунок удаляли и лунки промывали рабочим промывочным раствором из ИФА-набора, после чего в каждую лунку вносили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата из того же набора и инкубировали в течение 30 мин при температуре (37±1)°С. Затем содержимое лунок удаляли и промывали рабочим промывочным раствором из ИФА-набора. Во все лунки вносили по 100 мкл рабочего раствора тетраметилбензидина и инкубировали в темноте в течение 10-15 мин при температуре 18-25°С. Во все лунки вносили по 100 мкл стоп-реагента, при этом содержимое лунок окрашивалось в желтый цвет. Затем провели измерение величины оптической плотности растворов на фотометре вертикального сканирования на длине волны 450 нм. В соответствии с калибровочной зависимостью определили массовую концентрацию секреторного иммуноглобулина А, которая составила 2,48 мкг/мл и массовую концентрацию лактоферрина, равную 6990 нг/мл. Это позволило предположить у больного гонококковую инфекцию с системными проявлениями. Пациенту было проведено дополнительное обследование, в результате которого были выявлены ультразвуковые признаки простатита и дефицит лецитиновых зерен в соке простатической железы, что свидетельствует о системной гонококковой инфекции. Больной уже получал лечение по схеме локализованной гонококковой инфекции (цефтриаксон 250 мг внутримышечно однократно). При проведении контроля излеченности в посеве обнаружены гонококки. По результатам дополнительного обследования был подтвержден диагноз гонококковой инфекции с системными проявлениями, поставленный на основании иммунологического исследования по предложенному нами способу. После этого больному провели адекватное лечение системной гонореи (цефтриаксон 1 г внутримышечно один раз в сутки в течение 7 дней) и, после контроля излеченности он был снят с учета.

Пример 2. Больная Л., 30 лет (амбулаторная карта №2034 за 2008 год) обратилась в кожно-венерологический диспансер с жалобами на умеренные выделения из влагалища, зуд наружных половых органов, учащенные позывы на мочеиспускания. Больна в течение 7 дней, заболевание связывает с половым контактом. В мазках из уретры из шейки матки определяются Гр - диплококки, в посеве выделен гонококк. Было осуществлено иммунологическое исследование отделяемого цервикального канала, для чего были выполнены действия, аналогичные тем, что описаны в методике примера 1. Содержание лактоферрина составило 6880 нг/мл и содержание sIgA определялось на уровне 4,08 мкг/мл. На основании этих иммунологических данных был поставлен диагноз локализованная гонококковая инфекция. Проведение двуручного гинекологического исследования и гинекологического осмотра в зеркалах подтвердило диагноз локализованной гонококковой инфекции (уретрит, цистит, цервицит). Больной была назначена антибактериальная терапия (цефтриаксон 250 мг внутримышечно однократно), и после контроля излеченности она была снята с учета.

Пример 3. Больной Ю., 32 лет (амбулаторная карта №2807 за 2009 год) обратился в кожно-венерологический диспансер с жалобами на скудные слизистые выделения из уретры. Болен в течение 10 дней. Самостоятельно лечение не проводил, антибиотики в течение 6 месяцев до обращения к врачу не принимал. Две недели назад была незащищенная половая связь с новой партнершей. Микроскопически и бактериологически была подтверждена гонорея. Больному было проведено исследование содержания в эякуляте лактоферрина и секреторного IgA согласно описанной в примере 1 методике. В данной пробе концентрация лактоферрина была 6122 нг/мл, а секреторного IgA - 2,49 мкг/мл. В соответствии с предложенными в заявляемом способе критериями был выставлен диагноз локализованная гонококковая инфекция, что в дальнейшем было подтверждено данными физикального исследования, УЗИ и двустаканной пробой Томпсона. После этого пациент получил соответствующее лечение (цефтриаксон 250 мг внутримышечно однократно), и был снят с учета по результатам контроля излеченности.

Таким образом, на основании результатов обследования 61 пациента подтверждено, что новая совокупность признаков позволяет дифференцировать различные формы гонококковой инфекции.

Источники информации

1. Кубанова А.А., Мартынов А.А., Лесная И.Н., Кубанов А.А., Мелехина Л.Е. Организация дерматовенерологической помощи: достижения и перспекитвы. Жерн. Вестн. Дерматол. и Венерол., 2008,1: с.4-22.

2. Борисов С.Д., Дерябин Д.Г., Минаков А.А., Михайленко С.В., Окшин A.M., Лапина И.А. Смешанная урогенитальная инфекция в контексте проблемы сохранения репродуктивного здоровья. В: В.М. Боев (ред.) Среда обитания и здоровье населения. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. Оренбург, 2001, с.73-76.

3. ₍₁₉₎ SU ₍₁₁₎ 1439449 ₍₁₃₎ A1 ₍₅₁₎ 4 G01N 1/28 Способ выявления гонококков.

4. ₍₁₉₎ RU ₍₁₁₎ 2029954 ₍₁₃₎ C1 ₍₅₁₎ 6 G01N 33/53 Способ диагностики гонореи.

5. ₍₁₉₎ SU ₍₁₁₎ 1812495 ₍₁₃₎ A1 ₍₅₁₎ 5 G01N 33/49 Способ дифференциальной диагностики реинфекции и рецидива при гонорее и негонококковых уретритах.

6. Приказ МЗ РФ №415 «Гонококковая инфекция» от 20.09.03, Москва.

7. Зиганшин О.Р., Долгушин И.И. Механизмы антимикробной резистентности репродуктивных органов мужчин. Челябинск: изд-во Челябинская ГМА. - 2001. - 188 С.

8. Немцова Е.Р. и др. Иммуноферментный метод определения лактоферрина человека и его использование для диагностики гнойно-септических осложнений// Вопросы медицинской химии. - 1995. - Т. 41, №3. - с.58-61.

9. Fetners K. Is bacterial vaginosis a sexually transmitted infection. J. Sex. Transm. Infect. 2001, 77(5): 390.

Способ дифференциальной диагностики различных форм гонококковой инфекции при ее малосимптомном течении, включающий отбор отделяемого урогенитального тракта и определение его иммунологических показателей, отличающийся тем, что в качестве отделяемого берут у мужчин эякулят, у женщин - отделяемое цервикального канала, а в качестве иммунологических показателей определяют содержание секреторного иммуноглобулина А и содержание лактоферрина, и при уровне секреторного иммуноглобулина А (3,01±0,50) мкг/мл и менее и одновременном уровне лактоферрина (6876±89) нг/мл и более диагностируют гонококковую инфекцию с системными проявлениями, а при отсутствии указанного условия диагностируют локализованную гонорею.