Реваскуляризация ишемической ткани сетчатки и способ ее скрининга

Реваскуляризация ишемической ткани сетчатки и способ ее скрининга

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

По данной заявке испрашивается приоритет согласно предварительной заявке на патент США No. 60/655732, поданной 24 февраля 2005г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ ИНТЕРЕСА ПРАВИТЕЛЬСТВА

Часть работы, описанной в данном документе, была поддержана грантом № EY11254 и грантом № EY14174 от National Institutes of Health. Правительство США обладает определенными правами на данное изобретение.

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к лечению неоваскулярных заболеваний сетчатки. Конкретнее настоящее изобретение относится к способам стимулирования реваскуляризации сетчатки путем введения пациенту фрагмента ангиостатического белка и к способам скрининга, позволяющим выявить терапевтические средства для лечения сосудистых заболеваний сетчатки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сосудистые заболевания сетчатки, включая диабетическую ретинопатию, экссудативную возрастную дегенерацию желтого пятна (ARMD), ретинопатию недоношенных (ROP) и окклюзию сосудов, являются основными причинами ухудшения зрения и слепоты. Эта группа заболеваний находится в центре интенсивного изучения, направленного на то, чтобы определить новые методики лечения, которые помогут предотвратить или модифицировать патологическую неоваскуляризацию глаза. Например, ARMD поражено 12-15 миллионов американцев старше 65 лет, у 10-15% больных наступает потеря зрения в результате прямого влияния неоваскуляризации сосудистой оболочки глаза (субретинальной неоваскуляризации). Ведущей причиной потери зрения для американцев моложе 65 лет является диабет; 16 миллионов людей в США больны диабетом, и 40 000 ежегодно страдают от глазных осложнений данного заболевания, которые часто служат результатом неоваскуляризации сетчатки. Хотя лазерная фотокоагуляция эффективно предотвращает тяжелую потерю зрения в подгруппах высокого риска среди больных диабетом, общая 10-летняя заболеваемость ретинопатией по существу не меняется. У пациентов с неоваскуляризацией сосудистой оболочки глаза, вызванной ARMD или воспалительными заболеваниями, такими как гистоплазмоз глаз, фотокоагуляция, за немногими исключениями, неэффективна в предотвращении потери зрения. Хотя недавно разработанная неразрушающая фотодинамическая терапия обещает временно снизить индивидуальную потерю зрения у больных с ранее не поддававшейся лечению неоваскуляризацией сосудистой оболочки глаза, зрение улучшается или стабилизируется только у 61,4% пациентов, получающих лечение каждые 3-4 месяца, по сравнению с 45,9% в группе плацебо.

Возрастная дегенерация желтого пятна и диабетическая ретинопатия - ведущие причины потери зрения в промышленно развитых странах, и потеря зрения при них происходит в результате патологической неоваскуляризации сетчатки. Поскольку сетчатка состоит из ясно очерченных слоев нейронных, глиальных и сосудистых элементов, относительно мелкие нарушения, такие как наблюдающиеся при пролиферации сосудов или отеке, могут привести к существенному снижению зрения. Наследственные дегенерации сетчатки, такие как пигментный ретинит (RP), тоже связаны с сосудистыми расстройствами, такими как сужение артериол и атрофия сосудистой. Хотя достигнуты существенные успехи в идентификации факторов, которые стимулируют и ингибируют ангиогенез, способов специфического лечения сосудистых заболеваний глаза в настоящее время не существует.

Наследственные дегенерации сетчатки поражают 1 из 3500 людей и характеризуются прогрессирующим ухудшением сумеречного зрения, выпадением части поля зрения, атрофией зрительного нерва, сужением артериол, нарушением проницаемости сосудов и снижением центрального зрения, часто прогрессирующим до полной слепоты (Heckenlively, J. R., editor, 1988; Retinitis Pigmentosa, Philadelphia: JB Lippincott Co.). Молекулярный генетический анализ этих заболеваний выявил мутации более чем в 110 различных генах, ответственных за заболевание относительно небольшого процента больных (Humphries et al. 1992, Science 256:804-808; Farrar et al. 2002, EMBOJ. 21:857-864). Многие из этих мутаций связаны с ферментными и структурными компонентами механизма превращения света, включая родопсин, фосфодиэстеразу цГМФ, rds периферин и RPE65. Несмотря на эти наблюдения, все еще нет эффективного лечения, замедляющего или обращающего вспять прогрессирование этих дегенеративных заболеваний сетчатки. Недавние успехи генотерапии привели к успешному обратному развитию фенотипов rds (Ali et al. 2000, Nat. Genet. 25:306-310) и rds (Takahashi et al. 1999, J. Virol 73:7812-7816) у мышей и фенотипа RPE65 у собак (Acland et al. 2001, Nat. Genet. 28:92-95), когда трансген дикого типа доставлялся в зрительные рецепторы или пигментный эпителий сетчатки (RPE) животных со специфичной мутацией.

Ангиогенез - это процесс, посредством которого формируются новые кровеносные сосуды. В ответ на специфичные химические сигналы от существующего сосуда отрастают капилляры, размер которых в конечном счете увеличивается в зависимости от потребности организма. Первоначально эндотелиальные клетки, которые выстилают кровеносные сосуды, размножаются в направлении, ортогональном к существующему сосуду, образуя вырост, не имеющий полости. Затем в соседних эндотелиальных клетках образуются большие вакуоли, и клетки перестраивают так, что вакуоли выстраиваются «конец в конец» и в конечном счете сливаются с образованием полости нового капилляра (формированием трубки).

Ангиогенез стимулируется рядом условий, таких как ответ на рану, и сопровождает рост фактически всех тканей в организмах позвоночных, таких как млекопитающие. Ангиогенез также участвует в определенных патологических состояниях, таких как диабетическая ретинопатия и определенные злокачественные опухоли. Для роста опухолей, например, требуется рост кровеносных сосудов, обеспечивающих доставку кислорода и питательных веществ к ткани растущей опухоли.

Если вмешаться в химические сигналы, которые стимулируют процесс ангиогенеза, ангиогенез можно остановить или ингибировать. Например, ангиогенные эндотелиальные клетки вырабатывают протеазы, переваривающие базальную мембрану, которая окружает кровеносные сосуды, таким образом очищая путь для нового капилляра. Ингибирование действия или образования этих протеаз может препятствовать формированию нового сосуда. Аналогично эндотелиальные клетки пролиферируют в ответ на химические сигналы. Особенно важные сигналы пролиферации включают семейства белков фактора роста эндотелия (VEGF) и фактора роста фибробластов (FGF). Доказано, что VEGF участвует в васкуляризации определенных опухолей. Вмешательство в эти процессы передачи сигналов пролиферации также может ингибировать ангиогенез.

В ангиогенезе участвуют несколько факторов. Молекулы и кислого, и щелочного фактора роста фибробластов служат митогенами для эндотелиальных клеток и других типов клеток. Высокоселективным митогеном для эндотелиальных клеток сосудов служит фактор роста эндотелия (VEGF).

У здорового взрослого ангиогенез жестко регулируется и ограничен заживлением ран, беременностью и циклическими изменениями матки. Ангиогенез запускает специфичные ангиогенные молекулы, такие как щелочной и кислый фактор роста фибробластов (FGF), VEGF, ангиогенин, трансформирующий фактор роста (TGF), фактор некроза опухолей α (ФНО-α) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF). Ангиогенез может подавляться ингибирующими молекулами, такими как интерферон-α, тромбоспондин-1, ангиостатин и эндостатин. Именно баланс этих природных стимуляторов и ингибиторов управляет капиллярной сосудистой сетью, обычно находящейся в состоянии покоя. Если этот баланс расстроен, как при определенных патологических состояниях, стимулируется пролиферация, миграция и в конечном счете дифференцировка эндотелиальных клеток капилляров.

Ангиогенез играет центральную роль в ряде заболеваний, включая рак и неоваскуляризацию глаза. Также показано, что постоянный рост и метастазирование ряда опухолей зависят от врастания новых кровеносных сосудов хозяина в опухоль в ответ на ангиогенные факторы, выделяемые опухолью. Пролиферация новых кровеносных сосудов в ответ на ряд стимулов служит основным проявлением большинства глазных болезней и вызывает слепоту, в том числе при пролиферативной диабетической ретинопатии, ARMD, неоваскулярной глаукоме, интерстициальном кератите и ретинопатии недоношенных. При этих заболеваниях повреждение ткани может стимулировать высвобождение ангиогенных факторов, приводящих к пролиферации капилляров. VEGF играет доминирующую роль в неоваскуляризации радужной оболочки и неоваскулярных ретинопатиях. Хотя в сообщениях ясно показана корреляция между внутриглазными уровнями VEGF и ишемической ретинопатической неоваскуляризацией глаза, FGF, вероятно, тоже играет роль. Известно, что щелочной и кислый FGF присутствуют в нормальной сетчатке взрослого, хотя их определимые уровни не всегда коррелируют с неоваскуляризацией. В значительной степени это может объясняться тем, что FGF очень прочно связан с заряженными компонентами внеклеточного матрикса и малодоступен в свободно диффундирующей форме, которую можно обнаружить при стандартных исследованиях внутриглазных жидкостей.

В общем конечном пути ангиогенной реакции участвует опосредованный интегринами информационный обмен между пролиферирующей эндотелиальной клеткой сосуда и внеклеточным матриксом. Этот класс рецепторов адгезии, названных интегринами, экспрессируется в виде гетеродимеров, имеющих α- и β-субъединицу, на всех клетках. Один такой интегрин, α_νβ₃, является самым разносторонним членом этого семейства и позволяет эндотелиальным клеткам взаимодействовать с самыми разнообразными компонентами внеклеточного матрикса. Пептидные антагонисты и антитела-антагонисты этого интегрина ингибируют ангиогенез путем селективной стимуляции апоптоза пролиферирующих сосудистых эндотелиальных клеток. Существуют два зависимых от цитокинов пути ангиогенеза, которые можно охарактеризовать по их зависимости от различных интегринов клеток сосудов, α_νβ₃ и α_νβ₅. Конкретнее, ангиогенез, индуцируемый щелочным FGF, и ангиогенез, индуцируемый VEGF, зависят от интегринов α_νβ₃ и α_νβ₅ соответственно, поскольку антитела-антагонисты каждого интегрина селективно блокируют один из этих путей ангиогенеза в модели роговицы кролика и модели хориоаллантоисной мембраны (CAM). Пептидные антагонисты, которые блокируют все α_ν-интегрины, ингибируют ангиогенез, стимулируемый FGF и VEGF. Хотя в норме кровеносные сосуды глаза человека не экспрессируют ни один интегрин, α_νβ₃ и α_νβ₅ интегрины селективно экспрессируются на кровеносных сосудах в тканях пациентов с активным неоваскулярным глазным заболеванием. Хотя только α_νβ₃ последовательно определяется в ткани пациентов с ARMD, оба интегрина, α_νβ₃ и α_νβ₅, присутствуют в тканях пациентов с пролиферативной диабетической ретинопатией. Системно введенные пептидные антагонисты интегринов блокируют образование новых кровеносных сосудов на мышиной модели образования и развития сосудов сетчатки.

Тестирование потенциальных средств для лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки намного упростилось благодаря созданию моделей ретинопатии, вызванной кислородом (OIR), использующих нескольких видов животных, включая котят, щенков породы бигль, крыс и мышей. У каждой из этих моделей воздействие на новорожденных животных гипероксии (или чередования гипероксии и гипоксии) вызывает регресс или задержку развития сосудов сетчатки, за чем следует патологический ангиогенез после возвращения к нормальному уровню кислорода. Эти модели отражают события, которые происходят при ретинопатии недоношенных (ROP) - состоянии, в развитии которого участвует патологическая неоваскуляризация и которое может поражать недоношенных детей.

За последнее десятилетие мышиная модель OIR стала самой распространенной моделью для изучения патологического ангиогенеза, связанного с ретинопатиями, вызванными кислородом. Характер сосудистых расстройств в этой модели слегка отличается от наблюдаемого при ROP; у мыши вслед за воздействием гипероксии аваскулярным становится центральный, задний участок сетчатки, в то время как у детей аваскулярной становится периферия. Тем не менее это общепринятая модель для изучения механизмов заболевания и потенциального лечения ретинопатии, вызванной гипоксией, и изменения сосудов на этой модели очень последовательны, воспроизводимы и измеримы. В последние годы применение этой модели распространилось на общее исследование ишемических васкулопатий и связанных с ними антиангиогенных вмешательств, и теперь она широко используется как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях.

Исторически распространенный метод количественного определения пролиферативного неоваскулярного ответа на мышиной модели OIR основан на подсчете количества клеток, связанных с новообразованными сосудами, отходящими от сетчатки в стекловидное тело («ядер, залегающих перед внутренней пограничной мембраной (ILM)»). Количество клеток подсчитывают на сагиттальных поперечных срезах, обычно в областях вблизи диска зрительного нерва (но не включая сам диск). Метод очень трудоемок, отнимает много времени и сопряжен с некоторыми трудностями, включая потребность дифференцировать клетки патологических сосудов от клеток гиалоидных сосудов в стекловидном теле. Поскольку, в целом, исследуется только каждый 30-й последовательный срез, значительная часть ткани не оценивается количественно, что потенциально вводит ошибки, связанные с выбором срезов. Кроме того, поскольку глаз целиком подвергается разделению на срезы, это препятствует оценке того же самого глаза на другой важный параметр данной модели, а именно протяженность облитерации сосудов и скорость реваскуляризации сетчатки, которая происходит одновременно с патологическим формированием новообразованных сосудов. Этот параметр лучше всего оценивается на препаратах цельной сетчатки.

Соответственно, сохраняется потребность в усовершенствованных способах лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки и в том, чтобы оценить терапевтическую эффективность такого лечения на цельной сетчатке. Способы по настоящему изобретению удовлетворяют этим потребностям.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу лечения, способствующему физиологической реваскуляризации ишемической ткани сетчатки. Способ предусматривает введение млекопитающему, страдающему от ишемии сетчатки, терапевтически эффективного количества ангиостатического фрагмента триптофанил-тРНК синтетазы (TrpRS), посредством чего одновременно ингибируется патологическая неоваскуляризация сетчатки и стимулируется благоприятная физиологическая реваскуляризация поврежденных областей сетчатки. В предпочтительном варианте осуществления ангиостатический фрагмент TrpRS представляет собой фрагмент T2. Предпочтительно млекопитающее является пациентом - человеком, страдающим от ишемии сетчатки.

Способ лечения по настоящему изобретению применим для лечения ишемических и неоваскулярных заболеваний глаза, ишемических ретинопатий, включая такие как диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных и тому подобные.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу скрининга для выявления и оценки терапевтической эффективности потенциальных терапевтических средств для лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки. Способ предусматривает воздействие на новорожденную мышь, предпочтительно в возрасте около 7 дней, гипероксии на время, достаточное, чтобы вызвать измеримый регресс сосудистой сети сетчатки, предпочтительно приблизительно 5 дней, и последующее возвращение мышей к нормоксии. После возвращения к нормоксии в глаз мыши вводится потенциальное терапевтическое средство. Из подвергшегося лечению глаза изымают сетчатку целиком, предпочтительно спустя приблизительно 5 дней после возвращения к нормоксии. По существу цельную сетчатку также изымают из контрольного глаза той же самой мыши или мыши того же самого возраста, подвергнутой воздействию того же уровня гипероксии в течение того же времени. В контрольный глаз вместо потенциального терапевтического средства предпочтительно вводят буферный или физиологический раствор. Кровеносные сосуды подвергшейся лечению и контрольной сетчаток окрашивают для облегчения идентификации и визуализации. Получают микрографические изображения по существу всей окрашенной сетчатки, чтобы визуализировать площадь облитерации сосудов, вызванной гипероксией, и площадь преретинальных новообразованных сосудов, которые формируются после возвращения к нормоксии. Микрографические изображения затем анализируют, чтобы оценить площадь облитерации сосудов, вызванной гипероксическими условиями, и оценить распространенность патологической неоваскуляризации, которая возникает после возвращения к нормоксии. Эффективность потенциального терапевтического средства оценивают путем сравнении области облитерации сосудов в глазах, подвергшихся лечению, и контрольных глазах и путем сравнения площади преретинальных новообразованных сосудов в глазах, подвергшихся лечению, и контрольных глазах. Показателем распространенности патологической неоваскуляризации служит площадь сетчатки с преретинальными новообразованными сосудами в леченых глазах по сравнению с контрольными глазами. Уменьшение площади преретинальных новообразованных сосудов указывает на ангиостатическую активность, то есть на то, что средство ингибирует патологическую неоваскуляризацию. Реваскуляризацию оценивают, сравнивая площадь облитерации сосудов в леченых и контрольных глазах. Сокращение площади облитерации сосудов в леченых глазах по сравнению с контрольными указывает на то, что терапевтическое средство вызывает благоприятную физиологическую реваскуляризацию поврежденных сетчаток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 изображены микрофотографические монтажи окрашенных цельных сетчаток новорожденных мышей, иллюстрирующие нормальное развитие сосудистой сети в глазу мыши после рождения, с 9-дневного (P9) до 22-дневного (P22) возраста. Панели A, Β и C иллюстрируют сосудистую сеть в P9, Ρ18 и P22 соответственно, визуализированную путем окрашивании перфузией FITC-декстрана. Панели D, Ε и F иллюстрируют сосудистую сеть в дни P9, Р18 и P22 соответственно, визуализированную путем окрашивания лектином GS.

На фиг. 2 изображены микрофотографические монтажи и графики, иллюстрирующие развитие сосудистой сети сетчатки у новорожденных мышей, подвергнутых воздействию гипероксии в период с P7 по Ρ12. Панели A, B и C являются микрофотографиями, показывающими области облитерации сосудов. Панель D (верхний график) является графиком площади сетчатки в зависимости от возраста. Панель D (нижний график) является графиком площади облитерации сосудов в зависимости от возраста. Панель Ε является графиком рассеяния, показывающим корреляцию площади сетчатки левого глаза с площадью сетчатки правого глаза. Панель F является графиком рассеяния, показывающим корреляцию площади облитерированных сосудов левого глаза с площадью облитерированных сосудов правого глаза. Панель G - это гистограмма, показывающая малую изменчивость от наблюдателя к наблюдателю измеренной площади облитерации сосудов для 6 различных сетчаток, выделенных в различных возрастах, измеренных 4 различными наблюдателями согласно способу скрининга по изобретению.

На фиг. 3 изображены микрофотографии и графики, иллюстрирующие развитие преретинальных новообразованных сосудов у новорожденных мышей, подвергнутых воздействию гипероксии в период с P7 по Ρ12. Панели A-F представляют собой микрофотографии, из которых панель A показывает преретинальные новообразованные сосуды (яркие участки). На панели Β показано изображение с панели А с новообразованными сосудами, окрашенными красным. На панели С показано, что области новообразованных сосудов перфузируются только частично - пучки сосудов, связанные с основной сосудистой сетью, окрашены зеленым. На панели D показано, что окрашенные изолектином GS преимущественно CD31-положительные (зеленый цвет), что указывает на их сосудистое происхождение. Панель Ε показывает, что среди CD31-положительных новообразованных сосудов присутствуют некоторые клетки макрофагального (зеленого) происхождения. Панель G - это график, показывающий новообразование сосудов как функцию возраста. Панель Η показывает корреляцию площади новообразованного сосуда правого глаза и левого глаза. Панель I - гистограмма, иллюстрирующая низкую вариабельность от наблюдателя к наблюдателю определения площади новообразованных сосудов согласно способу скрининга по изобретению. Панель J показывает корреляцию между площадью пучка, который измерен способом скрининга по изобретению, по сравнению с известным из уровня техники трудоемким способом поперечных срезов для измерения пре-ILM ядер.

На фиг. 4 изображены микрофотографии и графики, иллюстрирующие количественное определение площади облитерации сосудов и площади преретинальных новообразованных сосудов у новорожденных мышей, подвергнутых воздействию гипероксии в период с P7 по Ρ12, согласно способу скрининга по изобретению. Панель A (верхнее правое изображение): показывает площадь облитерации сосудов в контрольном глазу мыши, подвергнутой воздействию к гипероксии согласно способу скрининга по изобретению; (верхнее среднее изображение) показывает площадь новообразованных сосудов (красные) в контрольном глазу мыши; (верхнее левое изображение) поперечный разрез контрольной сетчатки, показывающий пре-ILM ядра (стрелки). Панель B (правое нижнее изображение): показывает площадь облитерации сосудов в глазу мыши, подвергнутой воздействию гипероксии и подвергшейся лечению ингибитором iNOS согласно способу скрининга по изобретению; (нижнее среднее изображение) показывает площадь новообразованных сосудов (красные) в глазу мыши, подвергнутом лечению; (нижнее левое изображение) представляет собой поперечный разрез леченой сетчатки, показывающий пре-ILM ядра (стрелки). Панель B (левый график): сравнивает площадь облитерации сосудов в контрольном глазу против глаза, подвергнутого лечению iNOS; (средний график) сравнивает площадь новообразованных сосудов для контрольного глаза против глаза, подвергнутого лечению iNOS; (правый график) сравнивает количество пре-ILM ядер для контрольного глаза против глаза, подвергнутого лечению iNOS.

На фиг. 5 изображены микрофотографии и графики, иллюстрирующие количественное определение благоприятного влияния ангиостатического фрагмента TrpRS на облитерацию сосудов и формирование пучков сосудов у новорожденных мышей, подвергнутых воздействию гипероксии в период с P7 по Ρ12 согласно способу скрининга по изобретению. Панель A является графиком, сравнивающим площадь новообразованных сосудов для глаз, подвергнутых лечению различными дозами T2-TrpRS, по сравнению с глазами, подвергнутыми лечению схожими дозами полноразмерного TrpRS в способе скрининга по изобретению. Панель Β является графиком, сравнивающим площадь облитерации сосудов для глаз, подвергнутых лечению различными дозами T2-TrpRS, по сравнению с глазами, подвергнутыми лечению сходными дозами полноразмерного TrpRS, в способе скрининга по изобретению. Панели C и D иллюстрируют снижение площади облитерации сосудов в глазах, леченных T2-TrpRS (C), против контрольных глаз, в которых вводили буфер PBS (D). Панель Ε иллюстрирует ускоренную реваскуляризацию, вызванную T2-TrpRS (верхнее изображение), по сравнению с контрольным глазом (нижнее изображение). Панель F иллюстрирует, что аптамер VEGF вызывает задержку реваскуляризации областей с облитерированными сосудами. Панель G и Η - это графики, сравнивающие активность T2-TrpRS и аптамера VEGF в способе скрининга по настоящему изобретению.

Фиг. 6 иллюстрирует последовательность аминокислотных остатков T2-TrpRS (SEQ ID NO: 1) и мутантного T2-TrpRS-GD (SEQ ID NO: 2).

Фиг. 7 иллюстрирует последовательность аминокислотных остатков мини-TrpRS (SEQ ID NO: 3).

Фиг. 8 иллюстрирует последовательность аминокислотных остатков T1-TrpRS (SEQ ID NO: 4).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Способ стимулирования благоприятной физиологической реваскуляризации ишемической ткани сетчатки предусматривает введение млекопитающему, страдающему от ишемии сетчатки, терапевтически эффективного количества ангиостатического фрагмента триптофанил-тРНК синтетазы (TrpRS), посредством чего одновременно ингибируется патологическая неоваскуляризация и стимулируется физиологическая реваскуляризация поврежденных областей сетчатки. Предпочтительно фрагмент TrpRS вводится в глаз с помощью инъекции в стекловидное тело.

Предпочтительные ангиостатические фрагменты TrpRS включают фрагмент T2 (T2-TrpRS; SEQ ID NO: 1, фиг. 6), мутантный T2-TrpRS (T2-TrpRS-GD; SEQ ID NO: 2, фиг. 6), укороченный TrpRS, известный как мини-TrpRS (SEQ ID NO: 3, фиг. 7) и T1-TrpRS (SEQ ID NO: 4, фиг. 8). Последовательность аминокислотных остатков T2-TrpRS-GD (SEQ ID NO: 2) отличается от SEQ ID NO: 1 заменами двух аминокислотных остатков (то есть S121G и Y122D). Более предпочтительно ангиостатический фрагмент TrpRS является фрагментом T2.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу скрининга для оценки терапевтической эффективности предполагаемых терапевтических средств для лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки. В способе используется мышиная модель ретинопатии, вызванной кислородом, чтобы моделировать состояние ретинопатического заболевания в глазу мыши. Способ предусматривает воздействие на новорожденных мышей (предпочтительно в возрасте приблизительно 7 дней) гипероксии (например, атмосферы 75%-ной кислородной) на время, достаточное, чтобы вызвать измеримый регресс сосудистой сети сетчатки, предпочтительно приблизительно 5 дней, и последующее возвращение мышей к нормоксии (то есть к нормальному воздуху). После возвращения к нормоксии в глаз каждой мыши затем вводится потенциальное терапевтическое средство. Предпочтительно, чтобы в один глаз отдельной мыши вводилось терапевтическое средство, в то время как в другой глаз вводилось плацебо, такое как физиологический раствор или буферный раствор, в качестве контроля. Альтернативно некоторые мыши могут быть использованы в качестве контрольных, в то время как других лечат потенциальным терапевтическим средством. Сетчатки от леченых и контрольных мышей изымают целиком, предпочтительно спустя приблизительно 5 дней после возвращения к нормоксии, и кровеносные сосуды сетчаток окрашивают для облегчения идентификации.

Получают микрографические изображения по существу целых окрашенных сетчаток и анализируют, чтобы оценить площадь облитерации сосудов, вызванной гипероксическими условиями, и оценить распространенность патологической неоваскуляризации, которая развивается по возвращении к нормоксии. Эффективность потенциального терапевтического средства оценивают путем сравнения области облитерации сосудов в леченых глазах против контрольных глаз и/или путем сравнения площади преретинальных новообразованных сосудов в леченых глазах против контрольных глаз.

Предпочтительный способ скрининга для выявления и оценки терапевтической эффективности потенциальных терапевтических средств для лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки предусматривает воздействие на новорожденную мышь гипероксии на время, достаточное, чтобы вызвать измеримый регресс сосудистой сети сетчатки и возвращение мышей к нормоксии. Затем в глаз мыши вводится раствор предлагаемого терапевтического средства. После периода длительностью до приблизительно 5 дней мышь подвергают эвтаназии, и из глаза, в который было введено предлагаемое терапевтическое средство, изымают сетчатку по существу целиком. Сосудистую сеть сетчатки окрашивают и получают микрографическое изображение по существу всей окрашенной сетчатки, чтобы визуализировать сосудистую сеть сетчатки. По изображению определено по меньшей мере одно из (a) площади облитерации сосудов, видимой в окрашенной сетчатке, и (b) площади преретинальных новообразованных сосудов в окрашенной сетчатке. Впоследствии делают сравнение по меньшей мере одного из (i) области облитерации сосудов, заметной в окрашенной сетчатке, по сравнению с областью облитерации сосудов, заметной в окрашенной сетчатке, от контрольного глаза мыши, подвергнутого воздействию тех же условий гипероксии, но в который предполагаемое терапевтическое средство не вводилось, и (b) площади преретинальных новообразованных сосудов в окрашенной сетчатке по сравнению с площадью преретинальных сосудов в окрашенной сетчатке из контрольного глаза мыши, подвергнутого воздействию тех же условий гипероксии, но в который предполагаемое терапевтическое средство не вводилось.

Предпочтительный способ скрининга для выявления и оценки терапевтической эффективности потенциальных терапевтических средств для лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки предусматривает:

воздействие на 7-дневную мышь атмосферы, содержащей приблизительно 75% кислорода, в течение приблизительно 5 дней (гипероксические условия);

возвращение мышей в атмосферу обычного воздуха (нормоксия);

введение потенциального терапевтического средства в глаз мыши после возвращения к обычному воздуху;

эвтаназию мыши и удаление из глаза, в который было введено предлагаемое терапевтическое средство, сетчатки по существу целиком;

окрашивание сосудистой сети сетчатки глаза, в который было введено предлагаемое терапевтическое средство;

получение по меньшей мере одного микрографического изображения окрашенной сетчатки по существу целиком, чтобы визуализировать ее сосудистую сеть;

определение площади облитерации сосудов, заметной в окрашенной сетчатке, и площади преретинальных новообразованных сосудов в окрашенной сетчатке по меньшей мере на одном изображении;

сравнение площади облитерации сосудов, заметной в окрашенной сетчатке, с площадью облитерации сосудов, заметной в окрашенной сетчатке контрольного глаза мыши, подвергнутого воздействию тех же самых гипероксических условий, причем в контрольный глаз предлагаемое терапевтическое средство не вводилось, и

сравнение площади преретинальных новообразованных сосудов в окрашенной сетчатке с площадью преретинальных сосудистых пучков, заметной в окрашенной сетчатке контрольного глаза мыши, подвергнутого воздействию тех же самых гипероксических условий, причем в контрольный глаз предлагаемое терапевтическое средство не вводилось.

Показателем протяженности патологической неоваскуляризации служит площадь сетчатки с преретинальными новообразованными сосудами в леченых глазах относительно контрольных глаз, видимых на микрографическом изображении. Уменьшение площади преретинальных новообразованных сосудов указывает на ангиостатическую активность, то есть на то, что средство ингибирует патологическую неоваскуляризацию. Оценку реваскуляризации выполняют путем сравнения площади облитерации сосудов в сетчатках леченых глаз против контрольных глаз. Снижение площади облитерации сосудов в сетчатках леченых глаз по сравнению с контрольными указывает на то, что терапевтическое средство вызывает благоприятную физиологическую реваскуляризацию поврежденных сетчаток.

Терапевтические композиции, содержащие ангиостатический фрагмент TrpRS, могут содержать фармакологически подходящие, фармацевтически приемлемые носители, экспициенты и растворители. В целом, эти носители включают водные или спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и буферизованные среды, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Парентеральные растворители могут включить раствор хлорида натрия, раствор глюкозы Рингера, раствор глюкозы и хлорида натрия, раствор Рингера с лактатом или нелетучие масла. Кроме того, внутривенные растворители могут включать растворы для восполнения жидкости и питательных веществ и растворы для восполнения электролитов, такие как основанные на растворе глюкозы Рингера. Также могут присутствовать экспициенты, такие как консерванты и другие добавки, например антимикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие средства и инертные газы. Подходящие средства, облегчающие приготовление лекарственной формы, носители, другие наполнители и способы приготовления фармацевтических композиций раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, 14th Ed., Mack Publishing Co., 1970, в частности в части VIII, «Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture», страницы 1461-1762, соответствующие раскрытия которого включены в данный документ посредством ссылки.

Терапевтические композиции могут быть упакованы в соответственно стерилизованные пузырьки или флаконы, содержащие много доз или одну дозу. После заполнения композицией по изобретению контейнеры предпочтительно герметизируются. Предпочтительно композиции упаковывают в контейнер с приложенной к нему этикеткой, причем на этикетке указаны лекарственные средства, присутствующие в композиции, и этикетка несет уведомление в форме, предписанной правительственным учреждением, таким как Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США, отражая одобрение композиции согласно соответствующим законам, информацию о дозе и тому подобное. Этикетка предпочтительно содержит информацию о композиции, которая полезна для работника здравоохранения, вводящего композицию пациенту. Упаковка также предпочтительно содержит печатные информационные материалы, касающиеся введения композиции, инструкций, показаний и любых необходимых предупреждений.

Модель ретинопатии, вызванной кислородом (OIR)

Вся работа с животными соответствовала строгим рекомендациям протокола по гуманному обращению и использованию животных в исследовании. OIR вызывали согласно протоколу, описанному Smith et al. Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 1994; 35:101-111. Семидневных мышат вместе с матерями перемещали из комнатного воздуха в гипероксическую среду, содержащую приблизительно 75% кислорода, на 5 дней, после чего возвращали в комнатный воздух (нормоксия). Воздействие гипероксических условий выполняли, помещая клетки с животными в модифицированный кувез. Кислород циркулировал в кувезе (чтобы управлять потоком, использовали наркозный аппарат для животных), и его концентрацию контролировали и поддерживали на уровне 74-75%, используя одобренный FDA газоанализатор для кислорода (AX-300, Teledyne Analytical Instruments, Калифорния, США). Во время 5 дней гипероксии животных осматривали по меньшей мере три раза в день. В течение эксперимента пища и вода были доступны для матерей без ограничений. Через 5 дней, то есть на 12-й день после родов (P12), клетки возвращали в комнатный воздух.

Получение препарата цельной сетчатки и иммуногистохимия

После того как мыши были подвергнуты эвтаназии, энуклеированные глаза фиксировали в 4% растворе параформальдегида в PBS в течение приблизительно 10 минут и сетчатки рассекали с помощью кругового разреза позади лимба, примерно у корня радужной оболочки, затем переднюю часть глаза удаляли. Хрусталик и стекловидное тело иссекали и сетчатку отделяли от склеры и сосудистой оболочки, оставляя сетчатку в конфигции глазного бокала. На сетчатке делали радиальные ослабляющие разрезы, что позволяло сделать ее плоской, и любые остатки стекловидного тела или гиалоидной мембраны тщательно удаляли с уплощенной сетчатки.

Для ангиографии с FITC-декстраном животных анестезировали интраперитонеальными инъекциями кетамина HCl (Ketalar, Parke Davis, Великобритания, 100 мг/кг) в комбинации с релаксирующим средством ксилазином (2 мг/кг). Приблизительно 300 мкл высокомолекулярного (2×10⁶ Да) FITC-декстрана (концентрация 50 мг/мл, Sigma, С-Louis, MO) вводили в левый желудочек и позволяли циркулировать в течение приблизительно двух минут прежде, чем умертвить животное и энуклеировать глаза. Для окрашивания изолектином G4 сетчатки постфиксировали в 4% параформальдегиде в течение приблизительно 45 минут и инкубировали при комнатной температуре в течение ночи с изолектин