Пептид, стимулирующий образование специфических антител против олигомерной формы нуклеофозмина в опухолевых клетках

Пептид, стимулирующий образование специфических антител против олигомерной формы нуклеофозмина в опухолевых клетках

Реферат

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям, а именно к пептиду - фрагменту нуклеофозмина. Иммунизация данным пептидом стимулирует образование антител, позволяющих методом иммуноблоттинга селективно выявлять олигомерную форму нуклеофозмина в гомогенатах опухолевых клеток, содержащих как олигомерные, так и мономерные формы белка. Полученные с помощью заявляемого пептида антитела могут быть использованы для диагностики опухолевых заболеваний.

Ядрышковый белок нуклеофозмин участвует в регуляции таких важных клеточных процессов как биогенез рибосом, пролиферация клеток, стабилизация генома и канцерогенез [Lim M.J., Wang X.W. // Nucleophosmin and human cancer. Cancer Detect. Prev. 2006. V.30. P.481-490]. В опухолевых клетках наблюдается сверхэкспрессия нуклеофозмина и образование специфических структурных форм белка, часть из которых представляет собой мономеры, а часть - олигомеры, причем олигомер-мономерное состояние, а также распределение мономерных и олигомерных форм между ядрышками и нуклеоплазмой меняется в процессе канцерогенеза [Grummit C.G. et al. // Structural consequences of nucleophosmin mutations in acute myeloid leukemia. J. Biol. Chem. 2008. V.283. N.34. P.23326-23332]. Таким образом, анализ мономер-олигомерного состояния нуклеофозмина является важной составляющей диагностики опухолей и мониторинга эффективности противоопухолевой терапии. Данное изобретение позволяет селективно выявлять олигомерные формы нуклеофозмина в опухолевых клетках, где присутствуют одновременно мономеры и олигомеры, и является необходимым инструментом для определения локализации олигомерных форм в раковых клетках.

В настоящее время широко известны и применяются в научной практике антитела, полученные к выделенному из культуры клеток нуклеофозмину [Pui K. Chan, Fung Y. Chan. Nucleophosmin/B23 (NPM) oligomer is a major and stable entity in HeLa cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1995. V. 1262. P.37-42; R. Ochs, M. Lischwe, P. O'Leary, H. Busch. Localization of Nucleolar Phosphoproteins B23 and C23 during Mitosis Experimental. Cell Research. 1983. V.146. P.139-149]. Антитела выявляют мономерные и олигомерные формы нуклеофозмина.

На сегодняшний день в мире не существует антител, селективно выявляющих олигомерную форму нуклеофозмина в препаратах, где присутствуют одновременно мономерная и олигомерная формы.

Известен наиболее близкий к заявленному препарат, представляющий собой лизат клеток лимфобластомы человека, к которому были получены моноклональные антитела 3С9, выявляющие мономерную и олигомерную формы нуклеофозмина в иммуноблоте [Патент РФ №2296159, МКИ C12N 5/18, опубл.1997]. Антитела, полученные с помощью этого препарата, однако, не способны селективно выявлять только олигомерную форму белка в препаратах, в которых одновременно присутствуют обе формы - мономерная и олигомерная. Это создает препятствия для детальной диагностики и мониторинга раковых заболеваний.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента препаратов для селективной детекции олигомерных форм нуклеофозмина в опухолевых клетках.

Поставленная задача решается за счет пептида, индуцирующего при иммунизации высокоспецифические антитела к олигомерной форме нуклеофозмина формулы:

Ala-Ile-Gln-Asp-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg-Lys-Ser-Leu.

Сущностью изобретения является новый пептидный фрагмент нуклеофозмина формулы Ala-Ile-Gln-Asp-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg-Lys-Ser-Leu (SEQ ID NO 1), получаемый с помощью стандартных методик пептидного синтеза. При иммунизации заявляемым синтетическим пептидом вырабатываются антитела, способные связываться преимущественно с олигомерной формой нуклеофозмина. Техническим результатом изобретения является селективное выявление с помощью полученных противопептидных антител методом иммуноблоттинга олигомеров нуклеофозмина в гомогенатах культур опухолевых клеток HeLa и RAMOS, содержащих мономерные и олигомерные формы белка.

Заявляемый в изобретении пептид (SEQ ID NO 1) представляет собой C-концевой фрагмент нуклеофозмина, не участвующий в процессе олигомеризации [Mi Jung Lim, Xin Wei Wang. Nucleophosmin and human cancer. Cancer Detection and Prevention. 2006. V.30. P.481-490]. Этот участок содержит сигнальную последовательность ядрышковой локализации белка

(-Trp-Gln-Trp-). Таким образом, антитела к данному участку являются перспективными для выявления олигомера нуклеофозмина и места его локализации в опухолевых клетках различного типа. Пептид (SEQ ID NO 1) по сравнению со своим прототипом является химически индивидуальным веществом и способен стимулировать образование антител, направленных к определенному узкому фрагменту нуклеофозмина. Синтез этого пептида не требует большой трудоемкости и материальных затрат. Антитела, полученные против пептида (I), селективно выявляют на иммуноблотах только олигомерные формы белка в препаратах опухолевых клеток различного типа, содержащих как мономерные, так и олигомерные формы нуклеофозмина.

Синтез целевого продукта осуществляют твердофазным методом, ступенчато, на 4-(гидроксиметил)феноксиметил полистирольном полимере (смоле Ванга) с использованием 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc) производных аминокислот. Конденсации осуществляют при помощи тетрафторбората бензтриазол-1-ил-N-окси-бис(диметиламино)урония (TBTU). Для отделения пептида от полимерного носителя и конечного деблокирования используют трифторуксусную кислоту с добавкой этандитиола, триизопропилсилана и воды.

Структуру и гомогенность целевого продукта подтверждают данными аминокислотного анализа, масс-спектра и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Изобретение иллюстрируют графические материалы.

Чертеж. Иммуноблот. Иммунохимический анализ нуклеофозмина в лизатах клеток HeLa и Ramos с помощью антител к заявляемому пептиду (SEQ ID NO 1) (дор.1 и 2) и контрольных моноклональных антител 3 С9 (дор.3 и 4). Из чертежа видно, что антитела к заявляемому пептиду с высокой селективностью выявляют олигомерную форму белка (210-230 кДа), тогда как контрольные антитела выявляют мономерную (38-40 кДа) и олигомерную формы.

Пример 1. Синтез пептида Ala-Ile-Gln-Asp-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg-Lys-Ser-Leu (SEQ ID NO 1)

Операция 1. 0,3 г смолы Ванга с содержанием ОН-групп 0,5 ммоль/г полимера помещают в проточный реактор, промывают диметилформамидом (2×10 мл), снова добавляют 10 мл диметилформамида и оставляют набухать в течение 10 мин, затем диметилформамид удаляют. Синтез пептида ведут в проточном реакторе при комнатной температуре.

Операция 2. Получение Fmoc-Leu-полимера (I).

В 4 мл диметилформамида растворяют 0,530 г (1,5 ммоль) Fmoc-Leu-OH, добавляют 116 мкл (0,75 ммоль) N,N'-диизопропилкарбодиимида и 1,8 мг (0,015 ммоль) 4-диметиламинопиридина. Раствор перемешивают при температуре 0°C. Через 10 мин раствор добавляют к полимеру, находящемуся в проточном реакторе. Полученную смесь выдерживают при периодическом перемешивании при комнатной температуре 12 часов. Полученный Fmoc-Leu-полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл) и снова диметилформамидом (2×10 мл). Непрореагировавшие аминогруппы ацилируют смесью 2 мл уксусного ангидрида, 2 мл пиридина и 6 мл диметилформамида в течение 2 ч. Промывки повторяют. Содержание Fmoc-Asp(OBu^t) в продукте составляет 1,05 ммоль на 0,3 г полимера.

Операция 3. Получение Fmoc-Ser(OBu^t)-Leu-полимера (II).

а) Fmoc-Asp(OBu^t)-полимер (I) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,173 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ser(OBu^t)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 4. Получение Fmoc-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимера (III).

а) Fmoc-Ser(Bu^t)-Leu-полимер (II) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,211 г (0,45 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 5. Получение Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимера (IV).

а) Fmoc-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимер (III) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,292 г (0,45 ммоль) Fmoc-Arg(Pbf)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 6. Получение Fmoc-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимера (V).

а) Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимер (IV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Trp-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 7. Получение Fmoc-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимера (VI).

а) Fmoc-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимер (V) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,166 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gln-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 8. Получение Fmoc-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимера (VII).

а) Fmoc-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимер (VI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Trp-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 9. Получение Fmoc-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимера (VIII).

а) Fmoc-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимер (VII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,160 г (0,45 ммоль) Fmoc-Leu-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 10. Получение Fmoc-Asp(OBu^t)-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимера (IX).

а) Fmoc-Asp(OBu^t)-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Вос)-Ser(Bu^t)-Leu-полимер (VIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,185 г (0,45 ммоль) Fmoc-Asp(OBu^t)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2 х 10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 11. Получение Fmoc-Gln-Asp(OBu^t)-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимера (X).

а) Fmoc-Asp(OBu^t)-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимер (IX) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,166 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gln-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 12. Получение Fmoc-Ile-Gln-Asp(OBu^t)-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-(XI).

а) Fmoc-Gln-Asp(OBu^t)-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимер (X) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,160 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ile-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 13. Получение Fmoc-Ala-Ile-Gln-Asp(OBu^t)-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Вос)-Ser(Bu^t)-Leu-полимера (XII).

а) Fmoc-Ile-Gln-Asp(OBu^t)-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(Bu^t)-Leu-полимер (XI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

б) 0,141 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ala-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°C в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).

в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).

Операция 14. Получение целевого пептида Ala-Ile-Gln-Asp-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg-Lys-Ser-Leu (SEQ ID NO 1). 0,3 г пептадил-полимера (XII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл) и высушивают в токе воздуха. Сухой полимер обрабатывают 4 мл смеси трифторуксусная кислота-тиоанизол-фенол-вода-этандитиол-триизопропилсилан в объемном соотношении 81,5:5:5:5:2,5:1 в течение 2 ч. Полимер отфильтровывают, раствор упаривают, сухой остаток промывают сухим диэтиловым эфиром (2×50 мл). Растворяют в 10%-ной уксусной кислоте и очищают на препаративной ВЭЖХ при следующих условиях: колонка Phenomenex (США) Jupiter 10µ C18 300А (250×10 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 10-70% за 1 ч, скорость потока элюента - 3 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм. Собранную после ВЭЖХ фракцию, содержащую целевой продукт, лиофилизуют.

Данные аминокислотного анализа:

Asp 1,2 (1), Ser 1,3 (1), Glu 2,4 (2), Ala 0,8 (1), Ile 0,8 (1), Leu 2,0 (2), Lys 0,6 (1), Arg 0,7 (1)

По данным масс-спектрометрии МН+1544. По данным аналитической ВЭЖХ время удерживания составляет 25,9 мин, условия: колонка Phenomenex (США) Jupiter 5µ C18 300А (250×4,6 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - от 10 до 70% за 1 ч, скорость потока элюента - 1 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм.

Проведение биологических испытаний.

Пример 2. Получение противопептидных сывороток

а) Получение конъюгатов пептидов с гемоцианином улитки.

2,4 мг пептида (SEQ ID NO 1) и 12 мг гемоцианина улитки (Sigma, США) растворяют в 2 мл буфера состава: 2,7 мМ KCl, 140 мМ NaCl, 8,1 мМ Na₂HPO₄, 1,5 мМ KH₂PO₄, рН 7,4 (PBS) и при перемешивании в течение часа добавляют 480 мкл 0,5%-ного водного глутарового диальдегида. Полученный раствор перемешивают 15 часов, после чего диализуют против буфера PBS в течение ночи.

б) Раствор конъюгата, содержащего 2,4 мг пептида (SEQ ID NO 1), смешивают с равным объемом полного (для первой иммунизации), или неполного (для второй иммунизации) адъюванта Фрейнда и эмульгируют. Содержание пептида в каждой иммунизирующей дозе составляет 1 мг.

в) Кроликов породы шиншилла весом 3 кг иммунизируют дважды с интервалом в 42 дня. Перед первой иммунизацией из ушной вены отбирают кровь, полученные преиммунные сыворотки объединяют и используют как контрольные. Через 14 дней после второй иммунизации проводят забор крови из ушной вены. Полученные сыворотки объединяют.

Пример 3. Определение содержания противопептидных антител в сыворотках методом твердофазного иммуноферментного анализа

а) В лунки плашки вносят по 0,1 мл раствора пептида (SEQ ID NO 1) в 0,05 М Na-карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 20 мкг/мл и инкубируют 16 часов при 4°C. Затем раствор пептида удаляют и плашку четырежды промывают буфером PBS, содержащим 0,05% Tween-20.

б) В лунки вносят по 0,1 мл образцов объединенной преиммунной и объединенной иммунной сывороток в двойных разведениях, начиная с разведения 1:100, и инкубируют в течение 1 часа при 37°C. Затем плашку четырежды промывают PBS, содержащим 0,05% Tween-20.

в) Проводят инкубацию (1 час, 37°C) с конъюгированными с пероксидазой хрена козьими антителами против IgG кроликов (0,1 мл на лунку, 1 мг/мл в PBS). Затем плашку четырежды отмывают PBS, содержащим 0,05% Tween-20.

г) Проводят инкубацию с раствором субстрата (по 0,1 мл на лунку) - 0,05% перекисью водорода и 0,05% о-фенилендиамином в 0,15 М Na-цитратном буфере, рН 5,0. После появления окрашивания в лунках, содержащих контрольную преиммунную сыворотку, реакцию останавливают добавлением 100 мкл 10% серной кислоты.

д) Оптическую плотность раствора в лунках измеряют при длине волны 492 нм на приборе Multiscan Plus MKII (Flow Laboratories, Великобритания). За титр противопептидных антител принимают значение разведения сыворотки, дающее окрашивание более 0,1 ОЕ и превышающее окрашивание в лунках с контрольной преиммунной сывороткой в два раза. Полученное значение титра противопептидных антител составляет 5,9, выраженного в -lg разведения сыворотки.

Пример 4. Получение аффинного носителя

1 г CNBr-активированной сефарозы 4В (GE Healthcare bio-science AB, Швеция) суспендируют в 6 мл 1 мМ HCl в течение 15 мин до образования прозрачного геля и промывают 1 мМ HCl (5×10 мл). 2,8 мг пептида (SEQ ID NO 1) растворяют в 4 мл конденсирующего буфера (0,1 М NaHCO₃, 0,1 М NaCl, pH 8,0), добавляют к сефарозе и при периодическом перемешивании оставляют на 1 ч при 20°C. После промывки конденсирующим буфером (5×3 мл) к сефарозе добавляют блокирующий буфер (0,2 М Gly, 0,1 М NaCl, pH 8,0) и выдерживают в течение 2 ч. Затем сефарозу промывают поочередно ацетатным (0,1 М NaOCOCH₃, 0,1 М NaCl, pH 4,0) и боратным буфером (0,1 M Na₂B₄O₇·10H₂O, 0,1 M NaCl, pH 8,1) (5×10 мл).

Пример 5. Аффинная очистка антител

2 мл сыворотки наносят на колонку с 3,5 мл аффинного носителя, промытую буфером состава: 0,15 М NaCl, 0,01 М Na₂HPO₄, pH 7,4 (PBS₂) и инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин. Затем колонку промывают 35 мл буфера PBS2 и 35 мл элюирующего буфера (0,2 М раствора глицина в 0,1 М NaCl, pH 2,5). В отобранных фракциях элюата значения pH доводят до 8,0 с помощью 1М TRIS, pH 10. Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически, измеряя оптическое поглощение при длине волны 208 нм. Титр аффинноочищенных противопептидных антител (5,4) определяют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа по описанной в операции 2 методике.

Пример 6. Приготовление лизатов клеток

В работе используют культуры клеток человека: HeLa (клетки карциномы шейки матки) и Ramos (лимфома Буркитта). Культуры клеток выращивают в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки и антибиотики (10 мкг/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина) при 37°C в присутствии 5% CO₂. Клетки для экспериментов выращивают в культуральных флаконах.

Клетки HeLa, растущие в монослойной культуре, отмывают от среды буфером PBS. Клетки снимают с поверхности культурального флакона раствором Версена (Панэко, Россия) в течение 5 мин при 37°C и осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 500g и 4°C на центрифуге 5804R («Eppendorf», Германия).

Суспензионную культуру клеток Ramos сливают вместе с культуральной средой и осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 500g и 4°C на центрифуге 5804R («Eppendor», Германия).

Полученные осадки после декантации ресуспендируют в PBS и повторно центрифугируют при 500g и 4°C в течение 10 мин. После суспендирования осадков в PBS добавляют глицерин так, чтобы концентрация последнего составляла 30%, и затем измеряют концентрацию белка и проводят электрофоретический и иммунохимический анализ. На всех стадиях в растворы добавляют непосредственно перед использованием ингибиторы протеаз (1 мМ PMSF, 1 мкг/мл лейпептина и 1 мкг/мл апротинина).

Пример 7. Измерение концентрации белка

Измерение концентрации белка осуществляют по модифицированному методу Лоури с использованием в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [Lowry, О.Н., Rothenbrough, N.Y., Fair, A.H., and Randall, R.G. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. 1951, V.193, P.265-275].

Пример 8. Обработка образцов для электрофореза

Перед добавлением лизирующих растворов к суспензии клеток добавляют буфер PBS и глицерин так, чтобы концентрация белка в пробе составляла ~1-1,5 мг/мл, а концентрация глицерина- 30%. К суспензии белка добавляют ингибиторы протеаз (фенилметилсульфенилфторид до концентрации 1 мМ, 1 мкг/мл лейпептина и 1 мкг/мл апротинина).

К суспензии клеток добавляют буфер, содержащий додецилсульфат натрия, 2-меркаптоэтанол и ЭДТА до концентрации 5%, 2,5% и 1 мМ соответственно. Смесь термостатируют при 100°C в течение 1 мин (для предотвращения распада олигомерных форм белка В23).

Пример 9. Электрофорез и электроблоттинг

а) Электрофорез проводят на пластинках толщиной 1,5 мм с концентрацией полиакриламида 7,5%. Электрофорез выполняют в денатурирующих условиях по методу Лэммли [Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. // Nature. 1970, V.227, P.680-685]. Концентрирование белков осуществляют при силе тока 10 мА на пластину, а их разделение - при силе тока 20 мА на пластину при 12°C. Для проявления белковых полос на геле используют окрашивание раствором Кумасси G-250 в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 25% изопропилового спирта.

б) Электроблоттинг осуществляют на мембраны иммобилона NC (Millipore, США) диаметром пор 0,45 мкм. Для электропереноса используют условия: 0,025М натрий-бикарбонатный буфер (рН 9,0), 20% СН₃ОН и 0,1% додецилсульфата натрия. Электроперенос проводят при 12°C и постоянной силе тока ~400 мА. После проведения электроблоттинга в течение 3 ч часть геля, содержащую белки с молекулярными массами <60 кДа, и соответствующую часть мембраны отрезают, а верхнюю часть геля, содержащую более высокомолекулярные белки, подвергают дополнительному электропереносу еще в течение 12 ч. Контроль полноты электропереноса на мембраны осуществляют с помощью окрашивания гелей (после электроблоттирования) раствором Кумасси G-250 и по окрашиванию маркерных смесей белков на мембранах раствором амидочерного 10Б.

Пример 10. Иммуноокрашивание

После электропереноса мембраны иммобилона шестикратно отмывают буфером А (50 мМ Tris-HCl, 200 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100, рН 7,5) по 5 мин на качалке. После этого мембраны помещают в буфер А, содержащий 5% молока, инкубирование проводят в течение 1,5 ч. Затем мембраны инкубируют с антителами к пептиду (SEQ ID NO 1) или с контрольными моноклональными антителами 3С9 [Булычева Т.И., Дергунова Н.Н., Артеменко Е.Г., Дудник О.А., Шпакова А.П., Малашенко О.С., Зацепина О.В. Анализ пролиферативной активности клеток с использованием новых моноклональных антител к ядрышковому белку В23/нуклеофозмпну. Цитология. 2000, Т.42, С.944-954] в буфере А, содержащем 5% молока, при 4°C в течение ночи. Далее мембраны шестикратно отмывают буфером А по 5 мин. Проводят повторную забивку мембран 5% молоком, приготовленным на буфере А, в течение 50 мин. Затем проводят инкубацию с конъюгированными с пероксидазой хрена козьими антителами против IgG+IgM мыши (для проявления связывания контрольных антител 3С9) или против IgG кролика (для проявления связывания антител к пептиду (SEQ ID NO 1) в буфере А, содержащем 5% молока в течение 1,5 ч. Мембраны промывают буфером А 6 раз по 5 мин и дистиллированной водой 3 раза по 3 мин. Для окрашивания полос к мембранам добавляют 25 мл раствора 50 мМ Tris (рН 7,6), содержащего 12,5 мг диаминобензидина. Раствор пероксида водорода (10 мкл 50% раствора) вносят непосредственно перед окрашиванием. Проявление осуществляют в течение 5-20 мин в темноте.

Таким образом, получен новый пептид формулы Ala-Ile-Gln-Asp-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg-Lys-Ser-Leu, способный индуцировать образование антител, выявляющих в иммуноблоттинге олигомерную форму нуклеофозмина.

Пептид, индуцирующий при иммунизации высокоспецифические антитела к олигомерной форме нуклеофозмина, формулыAla-Ile-Gln-Asp-Leu-Trp-Gln-Trp-Arg-Lys-Ser-Leu.