Человеческие антитела к рецептору эпидермального фактора роста

Человеческие антитела к рецептору эпидермального фактора роста

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к моноклональным антителам, которые являются специфическими к рецептору эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR). Эти антитела могут использоваться, помимо прочего, при лечении неопластических заболеваний и гиперпролиферативных нарушений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В то время как обычные клетки размножаются путем тщательно контролируемой активации тирозин-киназного рецептора фактора роста (receptor tyrosine kinases, RTKs) соответствующими им лигандами, раковые клетки также размножаются путем активации рецепторов фактора роста, но с потерей надежного контроля нормального размножения. Потеря контроля может быть вызвана многими причинами, такими как сверхэкспрессия факторов роста и/или рецепторов, и автономная активация биохимических путей, регулируемых факторами роста. Некоторыми примерами RTKs, вовлеченных в онкогенез, являются рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR), тромбоцитарного фактора роста (platelet-derived growth factor, PDGFR), инсулиноподобного фактора роста (insulin-like growth factor, IGFR), фактора роста нервов (nerve growth factor, NGFR) и фибробластного фактора роста (fibroblast growth factor, FGF). Связывание этих факторов роста их рецепторами на поверхности клетки приводит к активации рецептора, что инициирует и модифицирует пути передачи сигнала и приводит к клеточному размножению и дифференциации.

Члены группы рецепторов эпидермального фактора роста (epidermal growth factor, EGF) являются особенно важными тирозин-киназными рецепторами фактора роста, связанными с онкогенезом эпидермальных клеток. Первым обнаруженным членом группы EGF рецепторов был EGFR, экспрессируемый на многих типах опухолевых клеток. Было обнаружено, что EGFR участвует в регуляции роста и деления опухолевых клеток, в их репарации и выживании, ангиогенезе, инвазии и метастазировании опухоли.

EGFR является мембранным гликопротеином с молекулярным весом 170 kD, имеющим внеклеточный связывающий лиганды домен, трансмембранную часть и цитоплазматический белковый тирозин-киназный домен. Примеры лигандов, стимулирующих EGFR, включают эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста-а(transforming growth factor-a, TGF-a), гепаринсвязанный фактор роста (heparin-binding growth factor, HBGF), бетацеллюлин и Cripto - 1 фактор. Связывание специфичных лигандов приводит к автофосфорилированию EGFR рецептора, активации его цитоплазматического тирозин-киназного домена и инициации множественных путей передачи сигнала, которые регулируют выживание и рост опухоли. EGFR влияет также на продукцию в опухоли некоторых других ангиогенных факторов, таких KaKVEGF фактор и базовый фибробластный фактор роста (basis fibroblastic growth factor, bFGF).

Считается, что факторы роста, активирующие EGFR, участвуют в ангиогенезе опухоли. Ангиогенез, означающий процесс формирования капилляров из уже имеющихся сосудов в эмбриональных и взрослых организмах, известен как ключевой элемент процесса роста опухоли, ее выживания и местастазирования. Сообщалось, что стимулирование опухолевых клеток посредством EGFR приводит к увеличению экспрессии ангиогенных факторов: васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), интерлейкина-8 (IL-8) и базового фибробластного фактора роста (bFGF), что может послужить причиной активации васкулярных эндотелиальных клеток, связанных с опухолью. Стимуляция васкулярных эндотелиальных клеток, связанных с опухолью, также возможна посредством активации их собственных EGF рецепторов факторами, продуцируемыми опухолью, такими как TGF-α и EGF.

Сообщалось, что многие человеческие опухоли экспрессируют или сверхэкспрессируют EGFR. Экспрессия EGFR соотносится с плохим прогнозом, пониженным выживанием и/или повышенным метастазированием. По причине своего участия в онкогенезе, EGFR является особым объектом противораковой терапии. Такие виды терапии преимущественно включают либо моноклональные антитела, которые блокируют связывание лиганда внеклеточным доменом рецептора, либо синтетический тирозин-киназный ингибитор, действующий непосредственно на внутриклеточную часть и предотвращающий передачу сигнала.

Например, Cetuximab Mab (ERBITUX®) является рекомбинантным человеческо-мышиным гибридным моноклональным антителом, которое специфически связывается внеклеточным доменом человеческого EGFR. Cetuximab является антагонистом EGFR, блокирующим связывание лиганда с EGFR, предотвращающим активацию рецептора и замедляющим рост опухолевых клеток, экспрессирующих EGFR. Cetuximab зарекомендовал себя в использовании совместно с иринотеканом, или в его отсутствие, при лечении пациентов с метастатическим колоректальным раком, сопровождающимся производством рецепторов эпидермального фактора роста, которые являлись невосприимчивыми к иринотекановой химиотерапии, или к которым она не могла быть применена. Cetuximab также эффективен при лечении псориаза.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение представляет моноклональные антитела или их фрагменты, специфичные к EGFR, предпочтительно к внеклеточной части EGFR, содержащие в себе от одного до шести участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs), выбранных из следующей группы: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14. Антитела предпочтительно являются человеческими. Еще более предпочтительно, антитела из данного изобретения или их фрагменты содержат SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6. Альтернативным образом, но также предпочтительно, антитела из данного изобретения или их фрагменты содержат SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14. Более предпочтительным образом антитела из данного изобретения или их фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:8 и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:16. Такие антитела или их фрагменты из данного изобретения обладают разнообразными свойствами, включая способность к нейтрализации EGFR и предотвращению связывания лиганда EGFR его рецептором.

Также данное изобретение представляет выделенные полинуклеотиды, кодирующие описанные антитела или их фрагменты, а также экспрессионные векторы, содержащие эти цепи полинуклеотидов, сшитые как функционирующие с экспрессируемой последовательностью. Также в данном изобретении представлены рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие вектор экспрессии или его продукты, где экспрессируются вышеописанные антитела или их продукты. Также представлены способы получения антител или их фрагментов в культуре этих клеток при условиях, обеспечивающих экспрессию антител или их фрагментов. Антитела или их фрагменты могут быть очищены из клеток или клеточной среды.

Также данное изобретение представляет методы воздействия на рост опухолей у млекопитающих, включая введение млекопитающим эффективных количеств описанных антител. Описанные антитела могут сочетаться с антителами, связываемыми другими RTKs. Эти методы также могут включать введение млекопитающим анти-неопластических средств или обработку, включая, например, химиотерапевтические средства и/или облучение. В некоторых случаях рост опухоли подавляется. Предпочтительным образом, лечение приводит к регрессии опухоли.

Данное изобретение также представляет методы лечения у млекопитающих гиперпролиферативных заболеваний неонкологического характера, например псориаза, включая введение млекопитающим эффективных количеств описанных антител.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1А и 1B изображены векторы экспрессии для клонирования генов иммуноглобулинов pDEC и pEE12.1L. На фиг.1С изображена конечная векторная плазмида pGS-11F8, содержащая одно полностью человеческое анти-EGFR антитело.

На фиг.2 изображен профиль расщепления рестриктазами pGS-11F8. Метки размера ДНК отмечены на ДНК маркере в килобазах.

Фиг.3 изображает in vitro связывание IMC-C11F8 и IMC-C225 с EGFR по данным измерения ELISA.

На фиг.4 изображены результаты in vitro конкурирования IMC-11F8 и IMC-C225 с меченным ¹²⁵I EGF при связывании EGFR.

На фиг.5 демонстрируется эффект действия IMC-11F8 и IMC-C225 на фосфорилирование EGFR в клетках ВхРС3. Использовалось контрольное антитело IMC-1C11.

Фиг.6 демонстрирует ингибирование фосфорилирования EGFR с помощью IMC-11F8 и IMC-C225 в клетках А431.

На фиг.7 показан Вестерн Блот анализ фосфорилирования EGFR в присутствии нестимулированных контрольных клеток (дорожка 1), EGF (дорожка 2), IMC-C225 (дорожка 3), IMC-11F8 (дорожка 4), и контрольного антитела (дорожка 5). На фиг.5А с помощью анти-фосфатиразиновых антител показан фосфорилированный EGFR и на фиг.5В показан общий EGFR в стимулированных клетках.

На фиг.8 показано ингибирование EGF-стимулированного фосфорилирования EGFR различными концентрациями IMC-11F8. Фиг.8А изображает Вестерн Блот анализ анти-фосфотиразиновых антител EGFR в нестимулированных контрольных клетках (дорожка 1), в стимулированных клетках, обработанных без антител IMC-11F8 (дорожка 2), 15 мкг/мл (дорожка 3), 3 мкг/мл (дорожка 4) и 0,6 мкг/мл (дорожка 3) IMC-11F8. На фиг.8В показан суммарный EGFR.

Фиг.9 демонстрирует ингибирование пролиферации DiFi клеток с помощью IMC-11F8, IMC-C225 и контрольным антителом и IMC-1С11 по оценке метода МТТ.

Фиг.10 демонстрирует специфический лизис ⁵¹Cr-меченных DiFi клеток, обработанных с помощью IMC-11F8 или IMC-C225 (ERBITUX™).

Фиг.11 показывает рост опухолевых клеток А431 у мыши, обработаных с помощью IMC-11F8 или IMC-C225 (Cetuximab). Для контроля роста опухоли использовались необработанные животные.

Фиг.12 показывает рост опухолевых клеток ВхРСЗ у мыши, обработаных с помощью IMC-11F8 или IMC-C225 (Cetuximab). Для контроля роста опухоли использовались необработанные животные.

На фиг.13 показано иммуногистохимическое окрашивание ксенотрансплантированных из голой мыши клеток человеческой опухоли, обработанной салином или IMC-11F8. Секции А и В изображают ксенотрансплантат А431 из голой мыши, обработанный с помощью салина (А) или IMC-11F8 (В). Секции С и D изображают ксенотрансплантат ВхРСЗ из голой мыши, обработанный с помощью салина (С) или IMC-11F8 (D). Секции Е и F изображают Ki-67 окрашивание ксенотрансплантата ВхРСЗ из голой мыши, обработанного с помощью салина (Е) или IMC-11F8 (F).

Фиг.14 демонстрирует ингибирование ксенотрансплантированной в голую мышь человеческой колоректальной карциномы с помощью IMC-11F8 в комбинации с СРТ-11. Голые мыши, несущие ксенотрансплантаты человеческой колоректальной опухоли GEO (график A), DLD-1 (график В) или НТ-29 (график С) обрабатывались путем интраперитонеальной инъекции салина или IMC-11F8 дважды в неделю по 0,3 мг или 1,0 мг на иньекцию, в чистом виде или в смеси с СРТ-11 в количестве 100 мг/кг раз в неделю. Размер опухоли замерялся два раза в неделю. Данные представляют среднее значение ±SE измерений опухоли у десяти животных из каждой группы. График D представляет регрессию опухоли вследствие обработки с помощью IMC-11F8 в чистом виде или в смеси с СРТ-11. Каждая группа состоит из 10 зараженных опухолью животных.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение представляет моноклональные антитела и их фрагменты, которые являются специфичными к EGFR, а также выделенные или очищенные полинуклеотидные последовательности, кодирующие антитела. Антитела по данному изобретению являются предпочтительно человеческими и могут использоваться для лечения неопластических заболеваний, включая солидные и не солидные опухоли, а также для лечения гиперпролиферативных нарушений.

Природные антитела состоят обычно из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, при этом каждая легкая цепь ковалентно присоединена к тяжелой цепи с помощью промежуточной дисульфидной связи, при этом множественные дисульфидные связи соединяют, в свою очередь, две тяжелые цепи одну с другой. Индивидуальные цепи могут складываться в домены, характеризуемые схожими размерами (110-125 аминокислот) и структурами, но обладающие различными функциями. Легкая цепь может содержать один вариабельный домен (V_L) и/или один константный домен (C_L). Тяжелая цепь также может содержать один вариабельный домен (V_H) и/или, в зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных домена (C_H1, C_H2, C_H3 и C_H4). У людей присутствуют изотипы IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, причем IgA и IgG далее подразделяются на подклассы или подтипы (lgA_1-2 и lgG_1-4).

В целом, вариабельные домены демонстрируют существенное разнообразие аминокислотной последовательности от одного антитела к другому, особенно в области нахождения сайта связывания антигенов. В каждом из V_L и V_H имеются три зоны, называемые гипервариабельными участками или участками, определяющими комплементарность (complementarity-determining regions, CDRs), при этом они сопровождаются менее вариабельными областями, которые называются каркасными вариабельными областями (framework variable regions).

Часть антитела, состоящая из доменов V_L и V_H, обозначается Fv (fragment variable) и составляет область связывания антигенов. Fv одиночной цепи (single chain Fv, scFv) представляет собой фрагмент антитела, содержащий V_L домен и V_H домен на одной полипептидной цепи, при этом N-конец одного домена и С-конец другого домена соединяются подвижным линкером (см., например, патент США N 4 946 778 (Ladner et al.); WO 88/09344 (Huston et al.). WO 92/01047 (McCafferty et al.) описывает дисплей scFv фрагментов на поверхности растворимых рекомбинантных генетических экспонирующих методов, таких как бактериофаги.

Пептидными линкерами, используемыми для получения одноцепочечных антител, могут быть гибкие пептиды, выбранные таким образом, чтобы обеспечить правильное трехмерное сворачивание V_L и V_H доменов. Линкер состоит, в общем виде, из 10-50 аминокислотных остатков. Предпочтительно, линкер состоит из 10-30 аминокислотных остатков. Еще более предпочтителен линкер, состоящий из 12-30 аминокислотных остатков. Самым предпочтительным является линкер, состоящий из 15-25 аминокислотных остатков. Пример такого пептидного линкера включает (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₃ (SEQ ID NO:19).

У одноцепочечных антител отсутствуют некоторые или все из константных доменов целых антител, из которых они происходят. Поэтому они способны обойти некоторые из проблем, связанные с использованием целых антител. Например, одноцепочечные антитела в целом свободны от некоторых нежелательных взаимодействий между константными участками тяжелых цепей с другими биологическими объектами. Помимо этого, одноцепочечные антитела обладают существенно меньшими размерами, чем целые антитела, и могут обладать большей способностью к проницаемости, чем целые антитела, что позволяет одноцепочечным антителам обнаруживать и присоединяться к целевым антиген-связывающим областям более эффективно. Более того, относительно небольшие размеры одноцепочечных антител делают менее вероятным возникновение нежелательной иммунной реакции у реципиента, по сравнению с целыми антителами.

Несколько одноцепочечных антител, каждая одиночная цепь которых обладает одним V_H и одним V_L доменом, ковалентно связанными первым пептидным линкером, могут ковалентно связываться с помощью одного или нескольких пептидных линкеров с образованием мультивалентных одноцепочечных антител, которые могут быть моноспецифичными или мультиспецифичными. Каждая цепь мультивалентного одноцепочечного антитела содержит фрагмент вариабельной области легкой цепи и фрагмент вариабельной области тяжелой цепи, и с помощью пептидного линкера связывается с еще как минимум одной другой цепью. Пептидный линкер состоит из по крайней мере пятнадцати аминокислотных остатков. Максимальное число аминокислотных остатков составляет около одной сотни.

Два одноцепочечных антитела могут объединяться с образованием димерного антитела, также известного как бивалентный димер. Димерные антитела состоят из двух цепей и двух связывающих областей и могут быть моноспецифичными или биспецифичными. Каждая цепь димерного антитела содержит V_H домен, соединенный с V_L доменом. Домены соединены с помощью линкеров, которые достаточно коротки для того, чтобы предотвратить спаривание между доменами одной и той же цепи, способствуя, таким образом, спариванию комплементарных доменов на разных цепях, создавая две антиген-связывающие области.

Три одноцепочечных антитела могут объединяться с образованием тримерных антител, также известных как тривалентные тримеры. Тримерные антитела построены таким образом, что аминокислотные окончания V_H и V_L доменов напрямую связаны с карбоксильными окончаниями V_H и V_L доменов, т.е. безо всяких линкерных последовательностей. Тримерное антитело обладает тремя Fv фрагментами с полипептидами, расположенными циклическим образом, «голова к хвосту». Возможной конформацией тримерного антитела является планарная конформация, при которой три области связывания находятся в одной плоскости под углами в 120° одна к другой. Тримерные антитела могут быть моноспецифичными, биспецифичными и триспецифичными.

Термин Fab (Fragment, antigen binding) относится к фрагментам антитела, состоящим из V_H V_L V_H и C_H1 доменов. Те, что образуются при расщеплении папаином, обозначаются просто Fab и не содержат шарнирный участок в тяжелой цепи. При расщеплении пепсином, образуется много различных Fab-фрагментов, содержащих шарнирный участок в тяжелой цепи. Те дивалентные фрагменты, в которых присутствуют межцепочные дисульфидные связи, обозначаются F(ab')₂, тогда как моновалентные Fab' образуются в том случае, если дисульфидные связи не сохранились. F(ab')₂ фрагменты обладают большей авидностью к антигенам, чем моновалентные Fab фрагменты.

Fc (Fragment crystallization) является обозначением той части или фрагмента антитела, который содержит спаренные константные домены тяжелой цепи. Например, у IgG антитела, Fc содержит С_Н2 и C_H3 домены. Fc антител IgA и IgM содержит дополнительно С_Н4 домен. Fc имеет отношение к Fc рецепторному связыванию, к активации комплемент-опосредованной цитотоксичности и антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cellular-cytoxicity, ADCC). Для таких антител, как IgA и IgM, которые представляют собой комплексы нескольких IgG-подобных протеинов, для комплексообразования необходимо наличие константных доменов Fc.

Наконец, шарнирная область разделяет Fab и Fc части антитела, предоставляя мобильность Fab-доменам относительно друг друга и относительно Fc, а также обладая несколькими дисульфидными связями для ковалентного связывания двух тяжелых цепей.

Таким образом, антитела по данному изобретению включают, но не ограничиваются, следующими: природные антитела, бивалентные фрагменты, такие как (Fab')2, моновалентные фрагменты, такие как Fab, одноцепочечные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), однодоменные антитела, мультивалентные одноцепочечные антитела, димерные антитела, тримерные антитела, и подобные, которые специфично связываются с антигенами.

Антитела и их фрагменты по данному изобретению являются специфичными к EGFR. Под специфичностью антитела понимается специфичное распознавание антитела определенным эпитопом антигена. Антитела и их фрагменты по данному изобретению могут быть, например, моноспецифичными или биспецифичными. Биспецифичные антитела (BsAbs) - это такие антитела, которые обладают двумя различными антиген - связывающими специфичностями или областями. В случае, когда антитело обладает более чем одной специфичностью, опознаваемые эпитопы могут относиться к одному антигену, или более чем к одному антигену. Таким образом, данное изобретение представляет биспецифичные антитела или их фрагменты, которые связываются с двумя различными антигенами, и с минимум одной специфичностью к EGFR.

Специфичность данных антител или их фрагментов к EGFR может быть определена, основываясь на аффинности и/или авидности. Аффинность, представляемая константой равновесия диссоциации антигена с антителом (K_rf), измеряет силу связывания между антигенной детерминантой и областью связывания антигена. Авидность - это мера силы связывания антитела с его антигеном. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и его областью связывания антигена на антителе, так и с валентностью антитела, под которой понимается количество областей связывания антигена для определенного эпитопа. Антитела обычно связываются с константой диссоциации (K_d) порядка от 10^-5 до 10^-11 л/моль. Любая меньшая чем 10^-4 л/моль, в целом считается обозначающей неспецифическое связывание. Чем меньше значение K_d, тем больше сила связывания между антигенной детерминантой и областью связывания антигена.

Как указывается, «антитела» и «фрагменты антител» включают модификации, которые сохраняют специфичность к EGF рецептору. Такие модификации включают, но не ограничаваются этим, соединение с эффекторной молекулой, такой как химиотерапевтическое средство (например, цисплатин, таксол, доксорубицин) или цитотоксин (например, белковое или небелковое органическое химиотерапевтическое средство). Антитела могут быть модифицированы путем конъюгирования с детектируемыми репортерными молекулами. Также включенными являются антитела с изменениями, затрагивающими не-связывательные характеристики, такие как период полувыведения (например, пегилирование).

Белковые и не-белковые средства могут быть соединены с антителами с помощью способов, известных в этой области. Способы соединения включают прямое присоединение, присоединение через ковалентно присоединенные линкеры и специфично соединенные парные члены (например, авидин-биотин). Такие методы включают, например, описанные в Greenfield et al., Cancer Research 50, 6600-6607 (1990) для присоединения доксорубицина, а также описанные в Arnon et al., Adv. Exp.Med. Biol. 303, 79-90 (1991) и в Kiseleve et al., Mol. Biol. (USSR)25, 508-514 (1991) для присоединения платиновых соединений.

Эквиваленты антител или их фрагментов по данному изобретению также включают полипептиды с аминокислотными последовательностями, в значительной степени эквивалентными аминокислотным последовательностям вариабельных или гипервариабельных участков полноразмерных анти-EGFR антител, включенных в данное изобретение. Под в значительной степени эквивалентной аминокислотной последовательностью здесь понимается последовательность с, по меньшей мере, 70%-ной, предпочительно, по меньшей мере, 80%-ной, и более предпочтительно, по меньшей мере, 90%-ной гомологией, по определению поисковым методом FASTA в соответствии с Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-8 (1988)), включая последовательности, которые на, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% идентичны.

Такие антитела будут обладать одинаковым или похожим связыванием, лигандной блокировкой и рецептор-нейтрализующей активностью по отношению к антителам данного изобретения, включая SEQ ID NO:8 и 16, особенно в случае консервативной замены аминокислот. Консервативная замена аминокислот определяется как изменение в аминокислотном составе путем замены одной или более аминокислот в пептиде, полипептиде или протеине, или их фрагментах. Замена производится аминокислотами с похожими в целом свойствами (например, кислотность, основность, ароматичность, размер, позитивный или негативный заряд, полярность, неполярность) таким образом, что эти замены не вызывают существенного изменения соответствующих пептидных, полипептидных или протеиновых характеристик (например, заряда, изоэлектрической точки, аффинности, авидности, конформации, растворимости) или активности. Типичные консервативные замены выбираются в группах аминокислот, которые включают, но не ограничиваются, следующими:

(1) гидрофобные: метионин (М), аланин (А), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I);

(2) гидрофильные: цистеин (С), серин (S), треонин (Т), аспаргин (N), глютамин (Q);

(3) кислотные: аспартамовая кислота (D), глютаминовая кислота (Е);

(4) щелочные: гистидин (Н), лизин (К), аргинин (R);

(5) ароматические: фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W);

(6) остатки, влияющие на ориентацию цепи: gly, pro.

Антитела по данному изобретению дополнительно включают такие, у которых характеристики связывания были улучшены путем прямых мутаций, способами развития аффинности, фагового дисплея или перемешивания цепи. Аффинность и специфичность могут быть изменены или улучшены путем мутации участков CDR и отбором областей связывания антигенов с требуемыми характеристиками (смотреть, например, Yang et al., J. Mol. Biol., 254: 392-403 (1995)). CDR мутируют разными способами. Один из способов заключается в том, чтобы рандомизировать индивидуальные остатки или комбинации остатков таким образом, что в популяции изначально идентичных областей связывания антигена все двадцать аминокислот находятся на определенных местах. Иным образом, мутации вносятся в набор CDR остатков методом error-prone PCR (смотреть, например, Hawkins et. al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)). Например, векторы фагового дисплея, содержащие гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, могут размножаться в мутационных штаммах Е.coli (смотреть, например, Low et al., J. Mol. Biol., 250: 359-368 (1996)). Эти методы мутагенеза иллюстрируют лишь некоторые из тех методов, которые известны специалистам в данной области.

Каждый домен антител по данному изобретению может быть полным доменом иммуноглобулина (например, вариабельным или константным доменом тяжелой или легкой цепи), или может быть функциональным эквивалентом или мутантом или производным природного домена, или синтетическим доменом, созданным, например, in vitro с помощью способа, такого, какие описаны в WO 93/11236 (Griffiths et al.). Например, является возможным соединить вместе домены, соответствующие вариабельным доменам антитела, у которых отсутствует хотя бы одна аминокислота. Важной характеристической особенностью антител является наличие области связывания антигена. Термины фрагмент вариабельной области тяжелой цепи и фрагмент вариабельной области легкой цепи не должны быть истолкованы таким образом, чтобы исключить варианты, не имеющие существенного влияния на специфичность.

Антитела по данному изобретению или их фрагменты являются человеческими антителами, обладающими одним, двумя, тремя, четырьмя и/или шестью участками, определяющими комплементарность (CDR), выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14.

Предпочтительно, антитела (или их фрагменты) по данному изобретению обладают участками CDR из группы SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6. Альтернативно, и также предпочтительно, данные антитела или их фрагменты, обладают участками CDR из группы SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14. Последовательности аминокислот участков CDR приведены в Таблице 1.

ТАБЛИЦА 1
Тяжелая цепь
CDR1	SGDYYWS	SEQ	ID	N0:2
CDR2	YIYYSGSTDYNPSLKS	SEQ	ID	N0:4
CDR3	VSIFGVGTFDY	SEQ	ID	N0:6
Легкая цепь
CDR1	RASQSVSSYLA	SEQ	ID	N0:10
CDR2	DASNRAT	SEQ	ID	N0:12
CDR3	HQYGSTPLT	SEQ	ID	N0:14

В другом варианте осуществления изобретения, данные антитела или их фрагменты могут обладать вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:8 и/или вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:16. IMC-11F8 является особенно предпочтительным антителом по данному изобретению. Это антитело обладает человеческими V_H и V_L областями структуры (framework regions, FWs), а также участками CDR. Вариабельный домен V_H IMC-11F8 (SEQ ID N0:8) обладает тремя участками CDR (SEQ ID NO:2, 4 и 6) и четырьмя FW, и V_L домен (SEQ ID NO:16) обладает тремя участками CDR (SEQ ID NO:10, 12 и 14) и четырьмя FW.

Предпочтительно, антитела или их фрагменты по данному изобретению нейтрализуют EGFR. Связывание лиганда, например, EGF или TGF-a, с внешним, внеклеточным доменом EGFR стимулирует димеризацию рецептора, автофосфорилирование EGFR, активацию внутреннего рецепторного цитоплазменного тирозин-киназного домена и инициацию множественных путей передачи сигнала и трансактивации, участвующих в регулировании синтеза ДНК (генная активация), а также развитии клеточного цикла или делении клеток. Также предпочтительно, анти-EGFR антитела (или их фрагменты) из данного изобретения являются специфичными к внеклеточной области EGFR. Данные антитела или их фрагменты дополнительно, предпочтительно, предотвращают связывание лиганда EGFR с его рецептором. В таком варианте осуществления изобретения, антитела по данному изобретению, или их фрагменты, связывают EGFR по крайней мере так же сильно, как природные лиганды EGFR (EGF и TFG-α).

Нейтрализация EGFR включает ингибирование, диминуцию, инактивацию и/или прерывание одной или более видов активности, связанных с передачей сигнала. Таким образом, нейтрализация EGFR влечет за собой множество эффектов, включая ингибирование, диминуцию, инактивацию и/или прерывание роста (пролиферации и дифференциации), ангиогенеза (восстановления, инвазии и метастазирования кровеносных сосудов), а также клеточной активности и метастазирования (клеточной адгезии и инвазивности).

Одной из мер при нейтрализации EGFR является ингибирование тирозин-киназной активности рецептора. Тирозин-киназное ингибирование можно определить с использованием широко известных методов, например, путем измерения уровня автофосфорилирования рекомбинантного киназного рецептора, и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Таким образом, анализы фосфорилирования полезны при определении нейтрализующих антител, в контексте данного изобретения. Фосфорилирование может быть обнаружено, например, с помощью использования антитела, специфичного к фосфотиразину, в ELISA анализе или Вестерн Блот анализом. Некоторые анализы для тирозин-киназной активности описаны в Panek et al., I. Pharmacol. Exp.Thera. 283:1433-44 (1997) и Batley et al., life Sci.62: 143-50 (1998).

Кроме того, методы обнаружения экспрессии белка могут использоваться для определения EGFR-нейтрализации, в том случае, если эти белки или белковая активность, или активированные состояния, регулируются тирозин-киназной активностью EGFR. Эти методы включают иммуногистохимию (IHC) для определения белковой экспрессии, флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) для определения амплификации генов, конкурентно-связывающий радиолигандный анализ, техники блотов на твердой основе, такие как нозерн-блот и саузерн-блот (Northern and Southern blots), полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) и ELISA. Смотреть, например, Grandis et al., Cancer, 78:1284-92 (1996); Shimizu et al., Japan J. Cancer Res., 85:567-71 (1994); Sauteretal., Am. J. Path., 148:1047-53 (1996); Collins, Glia, 15:289-96(1995); Radinsky et al., Clin. Cancer Res., 1:19-31 (1995); Petrides et al., Cancer Res., 50:3934-39 (1990); Hofmiann et al., Anticancer Res., 17:4419-26 (1997); Wikstrand et al., Cancer Res., 55:3140-48 (1995).

In vivo анализы также могут быть использованы при определении нейтрализации EGFR. Например, тирозин-киназное ингибирование рецептора можно наблюдать с помощью митогенного анализа с использованием клеток, стимулированных рецепторным лигандом в присутствии и отсутствие ингибитора. Например, клетки А431 (American Type Culture Collection (АТСС), Rockville, MD), стимулированные при помощи EGF, могут быть использованы для анализа ингибирования EGFR. Другой метод включает проверку на ингибирование роста экспрессирующих EGFR опухолевых клеток, используя, например, человеческие опухолевые клетки, внедренные в мышей. См., например, патент США No. 6 365 157 (Rockwell et al.).

Данное изобретение не ограничено никаким конкретным механизмом нейтрализации EGFR. Анти-EGFR антитела по данному изобретению могут наружно связываться с поверхностным рецептором клеток EGF, блокировать связывание лигандов (например, EGF или TGF-a) и соответствующую передачу сигнала, происходящую при участии связанной с рецептором тирозин-киназы, а также препятствовать фосфорилированию EGFR и других последующих белков в каскаде передачи сигнала. Рецепторно-антительный комплекс также может быть поглощен и разрушен, что приводит к ослаблению активности рецептора на поверхности клетки. Активность матриксных металлопротеиназ, которые участвуют в инвазии и метастазировании опухолевых клеток, также может быть ослаблена антителами по данному изобретению. Более того, антитела по даннму изобретению могут способствовать ингибированию продукции фактора роста и ангиогенеза.

Фрагменты антител могут быть получены путем разделения целого антитела или экспрессией ДНК, которая кодирует фрагмент. Возможные методы получения фрагментов антител описаны в Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235-243 (1983) и Parham, I. Immunol. 131:2895-2902 (1983). Такие фрагменты могут содержать один или оба Fab фрагмента из F(ab')₂ фрагмента. Такие фрагменты могут также содержать одноцепочечные фрагменты вариабельных областей антител, например scFv, димерные антитела, или другие фрагменты антител. Методы получения таких функциональных эквивалентов раскрыты в заявке РСТ WO 93/21319, европейской патентной заявке No. ЕР 239400; заявке РСТ WO 89/09622; европейской патентной заявке ЕР 338745 и европейской патентной заявке ЕР 332424.

Предпочтительными клетками-хозяевами для трансформации векторов и экспрессии рецепторных антагонистов являются клетки млекопитающих, например клетки COS-7, клетки яичника китайского хомяка (Chinese hamster ovary, СНО), и колонии клеток лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы, миеломы (например, NSO) или гибридомы. Альтернативно, могут использоваться другие эукариотические реципиенты, такие как дрожжи.

В случае если желательно экспрессировать генную конструкцию в дрожжах, подходящим выбором гена для использования в дрожжах является ген trpl, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7. Stinchcomb et al. Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979). Ген trpl предоставляет селекционный маркер для мутационнного дрожжевого штамма, лишенного возможности к росту в триптофане, например, АТСС No. 44076 или РЕР4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). Наличие повреждения trpl в геноме дрожжевой клетки-хозяина, таким образом, предоставляет удобную среду для определения трансформации при росте в отсутствие триптофана. Похожим образом, дрожжевые штаммы с недостатком Leu2 (АТСС 20, 622 или 38, 626) дополняются известными плазмидами, несущими ген Leu2.

Трансформированные клетки-хозяева культивируются с помощью методов, известных в этой области, в жидкой среде, содержащей ассимилируемые источники углерода (углеводороды, такие как глюкоза или лактоза), азота (аминокислоты, пептиды, белки или продукты их деградации, такие как пептоны, аммониевые соли и подобные), и неорганических солей (сульфаты, фосфаты и/или карбонаты натрия, калия, магния и кальция). Среда, кроме того, содержит, например, вещества, способствующие росту, такие как микроэлементы, например железо, цинк, марганец и подобные).

Как описано в примерах ниже, высокоспецифичные анти-EGFR антитела, в соответствии с данным изобретением, могут быть выделены из библиотеки фагового дисплея, составленной из генов вариабельных областей человеческих легких и тяжелых цепей. Например, вариабельный домен по данному изобретению может быть получен из лимфоцита периферической крови, который содержит перегруппированный ген вариабельной области. Альтернативным образом, части вариабельного домена, такие как CDR и FW участки, могут быть получены из различных человеческих последовательностей. Более 90% полученных клонов после трех повторов селекции специфичны к EGFR. Аффинность к связыванию с EGFR для исследованных Fab находится в наномолярном диапазоне, что является таким же высоким значением, как для нескольких бивалентных анти-EGFR моноклональных антител, созданных по гибридомной технологии.

Антитела и фрагменты антител по данному изобретению могут быть получены, например, из природных антител, или библиотек фаговых дисплеев Fab или scFv. Принимается во внимание, что для создания однодоменного антитела из антитела, содержащего V_H и V_L домены, могут быть желательны определенные замены аминокислот вне участков CDR, для повышения связывания, эспрессии или растворимости. Например, может быть желательным модифицировать аминокислотные остатки, которые в противном случае окажутся скрытыми при V_H-V_L взаимодействии.

Дополнительно антитела и фрагменты антител по данному изобретению могут быть получены по стандартной технологии гибридом (Harlow & Lane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998), включается в виде ссылки) с использованием трансгенных мышей (например, мыши КМ от Medarex, San Jose, Calif.), которые продуцируют гамма тяжелые и каппа легкие цепи человеческого иммуноглобулина. Предпочтительным образом, значительная часть человеческого генома, кодирующего антитело, внедряется в геном мыши и компенсирует недостаток продукции эндогенных мышиных антител. Такие мыши могут быть подкожно (subcutaneously, s.c.) иммунизированы с