Способ скрининга библиотеки фагового дисплея

Способ скрининга библиотеки фагового дисплея

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание

Настоящее изобретение относится к способу скрининга библиотек молекул, в частности библиотеки фагового дисплея, для идентификации или отбора одного или нескольких ее элементов, которые являются возможными партнерами связывания одного или нескольких объектов-мишеней, в частности возможными партнерами связывания молекул клеточной поверхности. Изобретение, кроме того, относится к улучшенному способу отделения вероятных партнеров связывания указанных объектов-мишеней от других элементов библиотеки.

Методика фагового дисплея антител показала себя как очень подходящую методику скрининга и отбора антител к заданным антигенам-мишеням (для обзора см. Hoogenboom et al., 1998, Immunotechnol., 4:1-20). Большинство стратегий основано на наличии очищенных и/или рекомбинантных антигенов, которых скринируют после иммобилизации на твердую подложку.

Исследование разнообразия поверхностей клеток и идентификация партнеров связывания молекул на поверхности клеток, специфичных для определенных типов клеток или состояний, связанных с заболеванием, является наиболее многообещающим подходом для развития целевых терапий. Однако идентификация таких партнеров связывания часто связана с представляющими сложность экспериментами.

Общепринятые способы идентификации партнеров связывания молекул клеточной поверхности основаны на инкубации клеток в суспензии или культуре с комплексными одноцепочечными Fv (scFv) библиотеками фагового дисплея с последующими несколькими промывками (обычно 5 или больше) и кислой или щелочной элюцией связавшихся фагов (см., например, Hoogenboom et al., 1999, Eur. J. Biochem., 260: 774-784; Ridgeway et al., 1999, Cancer Research, 59: 2718-2723; Wong et al., 2001, Cancer Immunol. Immunother., 50: 93-101). Перед этим процессом часто осуществляют удаление не имеющих отношения партнеров связывания посредством отрицательного пэннинга на не имеющих отношения клетках. Разработанный позднее и более высокоэффективный способ представляет скрининг клеток библиотекой фагового дисплея после иммобилизации клеток на нитроцеллюлозную мембрану (Radosevic et al., 2003, J. Immunol. Methods, 272:219-233).

Альтернативный и времясберегающий подход по сравнению с общепринятым подходом скрининга, отбора и сортировки пептидов, связывающихся с клеточной поверхностью, с использованием библиотеки фагового дисплея, был описан авторами Giordano et al., и назван методом BRASIL (Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands (Биопэннинг и Быстрый Анализ Селективно Взаимодействующих Лигандов), 2001, Nature Med., 11; 1249-1253). Этот метод основан на одностадийном разделении в органической фазе свободных и связанных с клетками фагов, преимуществом которого является отсутствие стадий промывки, необходимых для общепринятого способа (то есть стадий, в которых свободные фаги смываются с клеток), которые являются трудоемкими, неэффективными и приводят к потере клеток и потенциальных лигандов.

Неожиданно оказалось, что вразрез с идеей способа BRASIL, существенно улучшенный способ скрининга, отбора и идентификации связывающих партнеров молекул клеточной поверхности включает применение по меньшей мере одной стадии промывки перед стадией разделения в органической фазе. Было показано, что описанный метод также имеет существенные улучшения по сравнению с общепринятыми способами промывки и элюции, описанными выше.

В наиболее общем смысле, настоящее изобретение поэтому относится к способу скрининга библиотеки молекул для идентификации или отбора одного или нескольких ее элементов, которые являются вероятными партнерами связывания одного или нескольких объектов-мишеней, предусматривающему:

(а) контактирование экспрессионной библиотеки с одним или несколькими объектами-мишенями;

(b) проведение для указанных объектов-мишеней по меньшей мере одной стадии промывки;

(c) отделение объектов-мишеней, которые связались с одним или несколькими элементами экспрессионной библиотеки, от несвязанных элементов экспрессионной библиотеки посредством разделения через органическую фазу, таким образом, отделяя вероятных партнеров связывания указанных объектов-мишеней от других элементов библиотеки.

С альтернативной точки зрения, настоящее изобретение относится к улучшенному способу отделения от экспрессионной библиотеки вероятных партнеров связывания, которые связались с объектом-мишенью, от несвязанных элементов библиотеки, в котором предусмотрены этапы от (а) до (c), определенные здесь.

Скринируемая библиотека молекул в соответствии с настоящим изобретением может быть белковой экспрессионной библиотекой, то есть любой пептидной или полипептидной экспрессионной библиотекой. Примеры соответствующих экспрессионных библиотек хорошо известны и описаны в данной области техники и включают библиотеки дисплеев, такие как библиотеки фаговых дисплеев (например, Winter et al., WO90/05144; McCafferty et al., WO92/01047), бактериальные (например, Samuelson et al., 2002, J. Biotechnol. 96, 129-154), ковалентные или нековалентные библиотеки дисплеев, такие как библиотеки рибосомных дисплеев (например, как опубликовано в WO92/02536, The Regents of the University of Colorado, WO93/03172, University Research Corporation и WO91/05058, Kawasaki), или PROfusion библиотеки (Phylos, Inc.), где экспрессируемый белок связан с мРНК, кодирующей его, или ковалентные или нековалентные системы дисплеев, где экспрессируемый белок связан с ДНК, кодирующей его (например, через ковалентную связь, как в системах, описанных в WO98/37186, Actinova Ltd, или через цис-действующие белки в цис-дисплей системах, как описано в WO 04/022746), или системы дрожжевых дисплеев (например, описанные Wittrup, K. D. et al., WO 99/36569; Wittrup, K. D. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 395-399; Lee, S. Y. et al (2003) Trends in Biotechnol. 21, 45-52), или бактериальные двухгибридные системы (например, Chien et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578). Альтернативные типы экспрессионных библиотек также могут быть легко применены, такие как бактериальные экспрессионные библиотеки или другие библиотеки, где белки экспрессируются и секретируются в виде растворимых фрагментов. Также можно скринировать химически созданные библиотеки, например синтезированные пептидные библиотеки. Для применения в изобретении предпочтительными являются библиотеки фаговых дисплеев.

Белок, экспрессируемый в экспрессионной библиотеке, может иметь любую соответствующую длину при условии, что указанная длина является достаточной для функционирования белка (или возможного функционирования) в качестве связывающего партнера объекта-мишени. Поэтому указанные белки могут быть короткими линейными пептидами (например, порядка 5-50 или 7-30 аминокислот в длину) или более длинными пептидами или полипептидами, которые скорее могут быть более правильно свернуты (могут обладать более правильной конформацией), чем линейные. В противоположность ранее известному в данной области методу BRASIL, описанному Giordano et al. выше, способы настоящего изобретения преимущественно показаны являющимися применимыми для скрининга экспрессионных библиотек, которые содержат более длинные полипептиды, более конкретно, экспрессионных библиотек антител в отличие от библиотек коротких пептидов.

Таким образом, белки экспрессионной библиотеки могут быть кодированы целыми генами или их фрагментами, например нуклеиновые кислоты, кодирующие элементы экспрессионной библиотеки, могут быть библиотекой кДНК или мРНК или их фрагментов, например, полученной из определенного типа клеток, или могут быть библиотекой геномной ДНК или ее фрагментов.

Предпочтительные экспрессионные библиотеки экспрессируют полипептидные связывающие партнеры, которые являются потенциальными лигандами, рецепторами, ферментами, субстратами, антигенами и т.п. или их фрагментами, и особенно предпочтительные экспрессионные библиотеки экспрессируют молекулы антител или фрагменты антител, которые затем можно скринировать для поиска кандидатов, которые связывают один или несколько известных или неизвестных антигенов-мишеней. Указанные экспрессионные библиотеки антител экспрессируют антитела в любой соответствующей форме и могут содержать молекулы целых антител или фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела (например, scFv), Fab, Fv, Fab'2, димерные антитела (одноцепочечные Fv фрагменты, образующие димеры), биспецифичные антитела, минитела (малые версии целых антител, которые кодируют в единственной цепи все необходимые элементы целого антитела), тяжелые цепи или легкие цепи, камелоидные антитела, тетратела (одноцепочечные Fv фрагменты, образующие тетрамеры), однодоменные антитела, тритела (одноцепочечные Fv фрагменты, образующие тримеры) и т.п. Предпочтительным форматом фрагментов антител являются scFv фрагменты.

Молекулы антител или фрагменты могут быть любого Ig (иммуноглобулинового) изотипа, такие как IgG, IgM или IgA и т.д., и экспрессионные библиотеки могут содержать антитела одного или нескольких этих подтипов.

Множество библиотек антител известно и описано в данной области, и любая из них может быть скринирована с применением способов изобретения.

Когда в настоящем документе упоминается экспрессионная библиотека, то этот термин может быть использован для ссылки на такую библиотеку на уровне нуклеиновой кислоты или белка, то есть до или после того, как экспрессия кодируемых белков имела место. Однако ясно, что такие экспрессионные библиотеки должны присутствовать на белковом уровне для того, чтобы произошло взаимодействие с объектами-мишенями.

Способы конструирования таких экспрессионных библиотек и кодирующих их нуклеиновых кислот хорошо известны и описаны в данной области, и любая известная экспрессионная библиотека или только что разработанная экспрессионная библиотека может быть использована при этом. Например, такие библиотеки могут состоять из природных полипептидов или их фрагментов, или могут быть полностью или частично случайными или синтетическими. Например, в случае экспрессионных библиотек антител, библиотеки могут быть получены клонированием нуклеиновых кислот из “наивной” популяции лимфоцитов здорового донора (например, как описано в ЕР-А-368684), или из обогащенной популяции лимфоцитов, например лимфоцитов, полученных у пациента, который был подвергнут действию антигена или иммунизирован вакциной, или, например, раковыми клетками (например, как описано в WO03/095491, Affitech AS), или из популяций лимфоцитов, которые были обогащены посредством “пэннинга” на определенные антигены.

Экспрессионные библиотеки и, в частности, экспрессионные библиотеки антител могут быть получены из любого соответствующего источника, предпочтительно из источника, относящегося к млекопитающим, более предпочтительно источника, относящегося к человеку. Также можно использовать химерные экспрессионные библиотеки или гуманизированные экспрессионные библиотеки. Библиотеки также могут быть созданы путем выбора природного каркаса и включения рандомизированных последовательностей в соответствующие места. Альтернативно, каркас в качестве основы может иметь одну или несколько консенсусных последовательностей, полученных из множества природных каркасных участков.

Как правило, методики, используемые для получения конструкций библиотеки, будут основаны на известных методах генной инженерии. При этом последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие фактический белок или пептид, который будет экспрессироваться в экспрессионной библиотеке и который обычно меняется между различными элементами библиотеки, таким образом, обеспечивая разнообразие библиотеки, включают в экспрессионные векторы, соответствующие типу используемой экспрессионной системы. Соответствующие экспрессионные векторы для применения в фаговом дисплее, ковалентном или нековалентном дисплее, бактериальной экспрессии и т.п. хорошо известны и описаны в данной области (см., например, документацию экспрессионной библиотеки, обсужденную выше). Если в качестве экспрессионной библиотеки выбран фаговый дисплей, то можно использовать или фаговые или фагмидные векторы, хотя фагмидные векторы являются предпочтительными.

Полученные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие различные элементы библиотеки (то есть кодирующие пептиды, которые меняются между элементами библиотеки), также могут быть затем диверсифицированы перед скринингом с использованием стандартных методик, например посредством мутации, включающей добавление, делецию и/или замену одного или нескольких нуклеотидов контролируемым (например, сайт-направленным мутагенезом) или случайным образом, или посредством перестановки доменов, кассетного мутагенеза, перетасовки цепей и т.п. Синтетические нуклеотиды могут быть использованы для создания разнообразных последовательностей нуклеиновых кислот. Таким образом, все или часть нуклеиновых кислот, кодирующих экспрессирующиеся пептиды, могут быть синтезированы химически или получены из различных организмов или типов клеток.

Конструкции библиотеки могут необязательно или дополнительно содержать другие соответствующие компоненты, например точки начала репликации, индуцибельные или неиндуцибельные промоторы для инициации транскрипции, энхансеры, гены устойчивости к антибиотикам и маркеры, общие таги или репортерные молекулы, участки связывания праймеров для возможной амплификации конструкций посредством, например, ПЦР или другие желательные элементы последовательности. Соответствующие источники и местоположение таких дополнительных компонентов в конструкциях библиотеки, с тем чтобы они желательным образом функционировали, входят в обычную практику специалиста в данной области.

Включение маркеров или репортерных молекул может быть особенно эффективным в экспрессионных библиотеках, которые используются в настоящем изобретении. Такие маркеры или репортерные молекулы могут быть обнаружены прямым или косвенным способом и включают, например, короткие последовательности тагов, которые могут быть распознаны с помощью антител, радиоактивных меток, флуоресцентных меток или меток, которые могут быть обнаружены с помощью ферментов. Другие маркеры, которые могут быть использованы, включают один из партнеров связывающейся пары, такой как стрептавидин:биотин. Такие маркеры являются обычными маркерами, которые присутствуют во всех конструкциях библиотеки и могут быть использованы для обнаружения элементов библиотеки. В дополнение, силу детектируемого сигнала также можно использовать для количественного определения присутствия отдельного элемента библиотеки. Такое количественное определение присутствия отдельного элемента библиотеки может оказаться очень удобным для определения аффинности объекта-мишени в отношении элемента библиотеки. В качестве альтернативы или дополнительно, если, например, одна или несколько нуклеиновых кислот, составляющих молекулы библиотеки, помечены различными метками или иммобилизованы на разные по размеру или помеченные разными метками шарики, то можно получить информацию о составе, например можно получить последовательность молекул нуклеиновой кислоты.

В вариантах осуществления изобретения, где способы по изобретению объединены с методом AffiSelect (см. ниже), включение общих тагов или маркеров в конструкции библиотеки и в экспрессирующиеся элементы библиотеки (вероятные партнеры связывания) является особенно важным, и такие таги используются для облегчения связывания элементов библиотеки (вероятных партнеров связывания) с твердофазным носителем. Соответствующие таги и маркеры описаны ниже в описании метода AffiSelect.

Термин “объект-мишень”, используемый в описании, относится к представляющим интерес объекту или молекуле, для которых желательно найти партнеров связывания из экспрессионной библиотеки и которые прикреплены или каким-либо путем связаны с частью, которая может быть подвергнута разделению через органическую фазу, например частью, которая будет проходить сквозь и собираться внизу органической фазы при соответствующих условиях разделения, например центробежной силы. Такие объекты-мишени могут быть известными или неизвестными молекулами, для которых желательно идентифицировать вероятных партнеров связывания.

Такие объекты-мишени также должны быть способными связывать или по-другому взаимодействовать с элементами скринируемой белковой экспрессионной библиотеки. Поэтому указанные объекты-мишени являются объектами, способными связывать белки или пептиды, и могут быть белками/пептидами, гликопептидами, углеводами, липидами, гликолипидами, малыми химическими молекулами, нуклеиновыми кислотами и т.п., прикрепленными или по-другому ассоциированными с (например, присутствуя на поверхности) соответствующей частью, которая может быть подвергнута разделению через органическую фазу, такой как клетка или твердая фаза, в частности твердая фаза в виде частиц, такая как шарики. Поэтому такие объекты-мишени могут быть молекулами клеточной поверхности, прикрепленными к или являющимися компонентами целой клетки, или мембранных фракций клеток, или молекулами, например свободными, “голыми”, выделенными или очищенными молекулами, прикрепленными к твердой фазе, или фракциями клеточных мембран, прикрепленными к твердой фазе. Предпочтительными объектами-мишенями являются белки или пептиды, например антигены. Более предпочтительными объектами-мишенями являются молекулы клеточной поверхности (то есть молекулы, присутствующие in situ на поверхности клеток или мембранных фракций клеток) и, в частности, белки клеточной поверхности или пептиды, например, антигены клеточной поверхности.

В вариантах осуществления изобретения, где объект-мишень является молекулой, прикрепленной к поверхности твердой фазы, эта молекула может быть получена из любого соответствующего источника, то есть может быть природным белком, углеводом, липидом, гликолипидом и т.п., который выделен или очищен из своего природного окружения, или может быть рекомбинантной или синтезированной молекулой, например рекомбинантным белком или пептидом, или синтезированной химической молекулой. Выделенные, очищенные или рекомбинантные антигены являются особенно предпочтительными объектами-мишенями при этом.

Термин «клетка», используемый здесь, относится к любому виду биологической частицы, представляющей интерес, которая может быть разделена через органическую фазу. Например, этот термин включает прокариотические клетки, такие как бактерии, вирусы (в частности, агрегированные вирусные частицы, например частицы, агрегированные антителами или химической модификацией, или покрытые оболочкой вирусные частицы с большим сродством к органической фазе в отличие от водной фазы), эукариотические клетки (включая низшие эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки, и высшие эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, в частности человеческие клетки). Биологические частицы, которые обычно не имеют достаточной плотности, чтобы быть разделенными через органическую фазу, как правило, исключены из термина «клетка», используемого здесь. Фрагменты клеток также включены в пределы этого термина, например мембранные фракции, фракции клеточной стенки, белки клеточной стенки, мембранные белки и т.п., при условии, что они сохраняют или наделены способностью быть разделенными через органическую фазу. (Например, в случае белков клеточной стенки и мембранных белков они могут нуждаться в агрегации для облегчения разделения через органическую фазу).

Клетки могут быть природными клетками или смесью клеток (например, клетками, полученными из пробы биопсии или какого-либо другого образца, взятого у млекопитающего субъекта), или клеточными линиями (включая иммортализованные клетки и клеточные линии, полученные методами генной инженерии, например клетки, трансформированные или трансфицированные нуклеиновой кислотой, кодирующей определенный объект-мишень, или множество клеток, трансформированных или трансфицированных библиотекой объектов-мишеней, например библиотекой кДНК, которые затем экспрессируют объекты-мишени на клеточной поверхности), и т.п. Предпочтительными библиотеками объектов-мишеней являются библиотеки, полученные из ассоциированных с болезнью объектов, например ассоциированных с болезнью клеток или патологических агентов, таких как вирусы или бактерии. Особенно предпочтительной библиотекой является библиотека опухолевых клеток или вирусная клеточная библиотека (например, библиотека кДНК), дающая возможность идентифицировать вероятных партнеров связывания белков, ассоциированных с опухолью или вирусом. Соответствующие эукариотические клетки (или другие типы клеток) для трансфекции, такие как, например, COS клетки, хорошо известны в данной области, и любые из них можно использовать. Клетки, которые сверхэкспрессируют указанный объект-мишень, также можно использовать.

Предпочтительными «клетками» для применения в настоящем изобретении являются эукариотические клетки или их мембранные фракции. Особенно предпочтительными являются те клетки, которые ассоциированы с болезненным состоянием, такие как, например, раковые клетки или клеточные линии, например клетки или клеточные линии раков молочной железы и легких, или лимфоциты (например, лимфоциты периферической крови) больного пациента, или клетки, инфицированные вирусом и, таким образом, представляющие вирусные белки на поверхности клетки.

Клетки для использования в способах изобретения могут быть получены из любого соответствующего источника, например клетки могут быть получены напрямую у млекопитающего субъекта, или их можно получить из культур in vitro. Если используется культура in vitro, тогда указанные клетки могут быть культивированы в суспензии или в виде монослоя и могут быть использованы в способах изобретения живыми или зафиксированными. Обычно предпочтительным является использование живых клеток, так как тогда объект-мишень на поверхности клетки присутствует в своей нативной конформации, что означает, что выбранные вероятные партнеры связывания тогда распознают объект-мишень в его нативной конформации, таким образом, повышая шансы, что такие вероятные партнеры связывания будут применимы в терапии или диагностике. Как правило, в способах изобретения свежевыделенные клетки используются более предпочтительно, чем замороженные или сохраненные клетки. Однако пэннинг на тканевых слайдах и замороженном материале также является возможным.

В вариантах осуществления настоящего изобретения, где объект-мишень прикреплен к поверхности твердой фазы, можно использовать любую соответствующую твердую фазу при условии, что она может быть разделена через органическую фазу. Чтобы достичь этого, специалист в данной области легко выберет твердую фазу с соответствующей плотностью, размером и формой. Однако видно, что твердые подложки в виде частиц были бы наиболее предпочтительными для достижения этого. Особенно предпочтительными подложками являются шарики, которые необязательно могут быть магнитными или по меньшей мере способными намагничиваться, например можно использовать полимерные шарики, несущие суперпарамагнитные частицы. Такие подложки хорошо известны и документально зафиксированы в данной области, и в обычную практику специалиста входит подбор наиболее соответствующей подложки для применения в способах изобретения.

Подложки в виде частиц, например шарики, являются особенно предпочтительными, потому что с ними легко работать in vitro и они облегчают автоматизирование процесса. Например, если шарики являются магнитными, их можно отделить от образца с помощью магнитного поля и затем промыть. В качестве альтернативы, если шарики помечены, например, флуоресцентной меткой, шарики можно разделить проточной цитометрией. Подходящие меченые, немеченые и магнитные шарики коммерчески доступны от компании Dyno Specialty Polymers AS из Lillestrom, Norway и Dynal Biotech ASA. Конкретными примерами магнитных шариков, которые могут быть использованы в способах, описанных здесь, являются шарики М-450, М-270 или М-280 от Dynal Biotech ASA, Norway. Конкретными примерами немагнитных шариков, которые могут быть использованы в способах, описанных здесь, являются 5 мкм микрошарики из глицидилметакрилата (производства Bangs Laboratories, Carmel, IN). Способы прикрепления биомолекулярных объектов-мишеней к твердым фазам также хорошо известны и описаны в данной области.

Термин “один или несколько”, используемый здесь в сочетании с термином “объект-мишень”, относится к одному или нескольким определенным типам объектов-мишеней, например одной или нескольким молекулам клеточной поверхности или полипептидам. Другими словами, способы изобретения могут быть использованы для поиска вероятных партнеров связывания одного объекта-мишени, или множества, или библиотеки объектов-мишеней (например, могут быть использованы для скринирования библиотеки против библиотеки, что является особенно выгодным). Если более чем один объект-мишень вовлечен в процесс скрининга, они могут быть прикреплены к или ассоциированы с теми же или другими частями, которые можно подвергнуть разделению через органическую фазу. Например, можно видеть, что если объекты-мишени являются молекулами клеточной поверхности, прикрепленными к целым клеткам или их мембранным фракциям, тогда возможно найти вероятных партнеров связывания для ряда различных молекул клеточной поверхности (другими словами, это является примером случая, где происходит поиск вероятных партнеров связывания для библиотеки объектов-мишеней, то есть представляет собой вид скрининга библиотека против библиотеки). Конечно, если желательно, эта процедура может быть смещена в направлении отбора вероятных партнеров связывания конкретной молекулы клеточной поверхности, например, в случае клетки, имеющей иммунодоминантный объект-мишень, или путем отбора клетки, которая известна, или была выбрана для сверхэкспрессии объекта-мишени, представляющего интерес, или была создана для сверхэкспрессии такого объекта-мишени. Дополнительными примерами библиотек объектов-мишеней являются библиотеки кДНК или другие геномные библиотеки, трансфицированные и экспрессированные в клетках, например вычтенная опухолевая кДНК библиотека, трансфицированная и экспрессированная в эукариотических клетках.

Конечно, каждый объект-мишень может быть представлен множеством копий в скрининге (несомненно, это обычно является предпочтительным), например, если объект-мишень является молекулой клеточной поверхности, тогда ее множественные копии предпочтительно присутствуют или на той же клетке, и/или на множестве клеток того же или другого типа.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения экспрессионная библиотека является библиотекой антител (более предпочтительно, библиотекой фагового дисплея антител), и объекты-мишени являются молекулами клеточной поверхности (антигенами клеточной поверхности). Такие способы скринирования называются Отбор Антител на Основе Клеток (CBAS).

Этап осуществления контакта объектов-мишеней с экспрессионной библиотекой, или наоборот, может быть проведен любым соответствующим образом при таких условиях, чтобы соответствующие связывающиеся партнеры в экспрессионной библиотеке могли взаимодействовать с или связывать присутствующие объекты-мишени. Такие условия обычно будут варьировать в зависимости от природы экспрессионной библиотеки, объекта-мишени и части, с которой связан объект-мишень. Однако специалист легко определит соответствующие условия для облегчения связывания. Такой этап «контактирования» будет обычно проходить в растворе, или в жидкой среде, или каком-либо другом окружении, таком, что смесь экспрессионной библиотеки и объекта-мишени не будет смешиваться с органической фазой, так как это облегчит последующий этап разделения органической фазы. Таким образом, если объект-мишень присутствует на клетке, которую культивируют в виде монослоя, или клетках, которые получены от млекопитающего субъекта, например, из органа или ткани млекопитающего, тогда обычно их собирают и ресуспендируют в водной среде с помощью соответствующих методик перед контактированием с экспрессионной библиотекой. Однако также возможно контактирование экспрессионной библиотеки с монослоем клеток, после которого эти клетки могут быть собраны и ресуспендированы в водной среде с помощью соответствующих методик.

Примерные условия «контактирования» могут включать инкубацию на льду или при 4°С в течение времени от 30 минут до 4 часов. В качестве альтернативы, возможно проведение этапа контактирования при комнатной температуре или 37°С, и в некоторых случаях может быть предпочтительным. Смесь экспрессионной библиотеки и объекта-мишени необязательно может быть подвергнута мягкому качанию, перемешиванию или вращению. В дополнение, могут быть добавлены другие соответствующие реагенты, такие как блокирующие агенты для уменьшения неспецифического связывания. Например, можно использовать 1-4% раствор БСА или другой подходящий блокирующий агент (например, молоко). Однако следует понимать, что условия контактирования могут быть изменены или адаптированы специалистом в зависимости от цели способа скринирования. Например, если увеличить температуру инкубации до, например, комнатной температуры, это может увеличить возможность идентификации агентов, связывающихся с другой популяцией объектов-мишеней, например связывающихся с белками клеточной поверхности, которые легко интернализуются. В свою очередь, такие адаптации условий входят в компетенцию специалистов.

Размер и сложность экспрессионной библиотеки, применяемой в способах настоящего изобретения, могут варьировать, так же как и общее число копий объектов-мишеней, включенных в этап контактирования. Например, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения, где экспрессионной библиотекой является библиотека фагового дисплея, предпочтительно использовать фаги с титром в области 10⁸-10¹³, наиболее предпочтительно в области 10¹¹.

Удобно, чтобы число копий объектов-мишеней можно было варьировать путем изменения числа присутствующих частей, с которыми ассоциированы объекты-мишени. Например, когда объект-мишень является молекулой клеточной поверхности или полипептидом и т.п., прикрепленными к твердой подложке, тогда число объектов-мишеней может быть доведено до нужного путем увеличения или уменьшения числа клеток или твердых подложек, присутствующих в контактирующей смеси, или путем увеличения или уменьшения числа полипептидов и т.п., прикрепленных к отдельной твердой подложке. В свою очередь, число требующихся объектов-мишеней может быть легко определено методом проб и ошибок, но, например, когда объект-мишень является молекулой клеточной поверхности, удобно использовать от 10⁵ до 10⁷ клеток.

Соответствующая концентрация объектов-мишеней могла бы быть также легко определена методом проб и ошибок, но, например, когда объект-мишень является молекулой клеточной поверхности, удобно использовать концентрацию 1×10⁵-2×10⁶ клеток/мл.

Промывочные этапы (b) проводят после того, как объекты-мишени побывают в контакте с экспрессионными библиотеками при соответствующих условиях, таких, чтобы произошло связывание/взаимодействие между объектами-мишенями и соответствующими элементами библиотеки, но перед разделением в органической фазе. Важно отметить, что заявленный способ скринирования не устраняет дополнительные промывочные этапы, проводимые на других этапах процедуры, например, перед этапом (а), например, при приготовлении объектов-мишеней для контакта с экспрессионной библиотекой, или после этапа (c), например, в дополнительном анализе объектов-мишеней или элементов экспрессионной библиотеки. Однако способы, которые не включают стадию промывки после стадии контактирования экспрессионной библиотеки с объектами-мишенями и перед разделением в органической фазе (например, метод BRASIL, Giordano et al., выше), исключены.

Промывочные этапы могут быть проведены любым соответствующим путем в зависимости от природы объекта-мишени и части, к которой он прикреплен. Например, если объект-мишень прикреплен к клетке или мембранной фракции клетки, то удобно проводить указанные промывки центрифугированием смеси экспрессионной библиотеки и объекта-мишени при таких условиях, чтобы клетки образовывали осадок, удалением супернатанта, а затем ресуспендированием осадка в соответствующей водной среде (например, в той же среде, в которой был проведен этап контактирования). Такие шаги по осаждению клеток и их ресуспендированию составляли бы одну промывку. Такие условия, как правило, также были бы подходящими для промывания объектов-мишеней, ассоциированных с твердой фазой в виде частиц. Однако если объекты-мишени были ассоциированы, например, с магнитной твердой фазой, то промывочные этапы (b) могли бы быть удобно проведены путем приложения магнитного поля к сосуду, в котором был проведен этап контактирования, удалением супернатанта и ресуспендированием твердой фазы в подходящей водной среде. Подходящие методы промывания твердых фаз в виде частиц хорошо известны специалистам. В свою очередь, такие шаги по разделению с помощью магнитного поля и ресуспендирования составляли бы один промывочный этап.

В способе изобретения проводят по меньшей мере один промывочный этап (b), например могут быть проведены по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3 или по меньшей мере 4 промывочных этапа. Предпочтительно проводить менее чем 5 промывок, то есть предпочтительно проводить 1, 2, 3 или 4 промывки на стадии (b). Наиболее предпочтительно проводить 1, или 2, или 3 и особенно предпочтительно 2 промывки на этапе (b) способа. Это предпочтительное число промывок имеет дополнительное преимущество в том, что способ остается значительно более быстрым и менее трудоемким, чем общепринятый способ, который включает по меньшей мере пять промывок.

Эти промывочные этапы приводят к удалению части не связавшихся элементов экспрессионной библиотеки, то есть элементов, которые не взаимодействовали или неспецифически взаимодействовали с объектом-мишенью. Оставшаяся часть несвязавшихся элементов экспрессионной библиотеки будет затем удалена на этапе (c) способа, то есть на этапе разделения в органической фазе.

Для облегчения разделения в органической фазе, после промывок (b) объекты-мишени, содержащиеся в соответствующей полярной среде, например в водной среде, приводят в контакт с органической фазой. Указанная водная среда может быть наслоена сверху на органическую фазу или можно поместить органическую фазу поверх водной среды. В первом случае, при центрифугировании, связанные объекты-мишени собираются и предпочтительно осаждаются в органической фазе, в то время как несвязавшиеся элементы библиотеки остаются в водной среде. В последнем случае, при центрифугировании, водная среда, содержащая несвязавшиеся элементы экспрессионной библиотеки, проходит вверх через органическую фазу, в то время как связанные объекты-мишени собираются и предпочтительно осаждаются под органической фазой. В качестве альтернативы, также возможно смешать две фазы, которые тогда разделятся в процессе центрифугирования. Следовательно, достигается одинаковый результат.

Термин «органическая фаза», используемый в данном описании, относится к жидкой фазе, которая не смешивается с водой или другой полярной средой или водной средой. Органическими фазами, подходящими для применения в изобретении, являются те, которые при соответствующих условиях, например центрифугировании, будут позволять отделение связанных комплексов объекта-мишени и элемента экспрессионной библиотеки от несвязанных элементов экспрессионной библиотеки, например позволять связанным комплексам объекта-мишени и элемента экспрессионной библиотеки проходить сквозь, но будут исключать несвязанные элементы экспрессионной библиотеки, то есть будут исключать не образовавшие комплексы или свободные элементы экспрессионной библиотеки. Ясно, что любая из таких экспериментальных систем не является совершенной на 100%. Следовательно, соответствующая органическая фаза является такой, которая исключает большинство или значительную часть или к