Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая

Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики оспы овец и оспы коз.

Оспа овец и оспа коз - высококонтагиозные вирусные заболевания мелких жвачных, проявляющиеся интоксикацией организма, лихорадкой, папулезно-пустулезными поражениями кожи и слизистых оболочек, часто с летальным исходом, особенно среди молодняка. Они наносят животноводству огромный экономический ущерб, слагающийся из гибели и вынужденного убоя больных животных, снижения продуктивности, затрат на проведение ветеринарно-санитарных и охранно-карантинных мероприятий.

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV) вирус оспы относится к роду 00.058.1.04 Capripoxvirus, принадлежащему к подсемейству 00.058.1 Chordopoxvirinae семейства 00.058 Poxviridae (1).

Род Capripoxvirus включает вирус оспы овец (BOO), вирус оспы коз (ВОК) и вирус кожной бугорчатки КРС (вирус нодулярного дерматита (ВБ)). Представители рода близкородственны, что доказывается иммунологическим анализом и структурой генома. Так ВОК является близкородственным BOO, но таксономически самостоятельным видом. BOO и ВОК не обладают четко выраженной хозяйской специфичностью: несмотря на то что обычно вирусы вызывают наиболее выраженное заболевание либо у овец, либо у коз, некоторые штаммы патогенны для обоих видов животных-хозяев (2, 3).

В связи с этим на практике, как правило, не дифференцируют два этих заболевания, а обычно обозначают как единое заболевание - оспа овец и коз.

Именно под таким названием заболевание оспа овец и коз приводится в перечне Международной организации здравоохранения животных (МЭБ) болезней, обязательных к декларированию, хотя это и затрудняет анализ реальной распространенности оспы овец и оспы коз как отдельных заболеваний.

По данным МЭБ эти заболевания регистрируются на всех континентах, за исключением Австралии и Океании. В последние годы оспа получила широкое распространение и в тех странах, где раньше никогда не регистрировалась (Вьетнам, 2005; Монголия, 2006; Греция, 2007).

Напряженная ситуация остается в странах СНГ Среднеазиатского и Кавказского регионов (Казахстан, Таджикистан, Киргизия, Азербайджан, Грузия). В 1996-2003 гг. неблагополучными по этим заболеваниям были 55 стран, в том числе 7 стран СНГ. Так, в Таджикистане в 2000 г. оспу коз регистрировали в виде отдельных случаев, в 2001 г. - уже во всех зонах республики. Вначале заболевание выявлялось только у коз ангорской породы, а в 2002 г. - и у коз местных пород.

В течение длительного времени Россия оставалась благополучной по данным заболеваниям. Однако во время вспышки в 1993 г. на юге Российской Федерации (РФ) в Ставропольском крае и Дагестане в 5 очагах оспой заболело 1413 животных, из которых пало 628 голов. В дальнейшем в России отмечалось увеличение количества очагов и оспа мелкого рогатого скота в 1994-1999 гг. проявлялась ежегодно. За это время было зарегистрировано 85 очагов оспы преимущественно среди овец. В 2002 г. во время вспышки оспы овец на Дальнем Востоке отмечались единичные случаи заболевания коз, а в 2003 г. оспа коз проявила себя как самостоятельное заболевание.

В связи с тем что Россия имеет общую границу и тесные экономические связи со многими неблагополучными по оспе государствами, заболевание представляет большую угрозу для нашей страны в отношении возможности заноса возбудителей болезни.

Создавшаяся эпизоотическая ситуация по оспе овец и оспе коз свидетельствует о необходимости иметь высокоэффективные диагностические препараты и средства специфической профилактики как против оспы овец, так и против оспы коз, которые в короткие сроки позволили бы идентифицировать возбудителей этих заболеваний и быстро купировать распространение инфекций.

Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов BOO и ВОК, пригодных для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики оспы овец и оспы коз.

В странах, где отмечены вспышки этих заболеваний, специфическая профилактика оспы овец и оспы коз проводится с помощью культуральных вирусвакцин из аттенуированных штаммов возбудителей заболеваний и инактивированных тканевых и культуральных вакцин, которые производят в виде монопрепаратов.

В результате многочисленных исследований установлено, что инактивированные вакцины уступают вирусвакцинам по иммуногенной активности.

Известно использование в ряде стран вирусвакцины из аттенуированного штамма RM/65 BOO, но она оказалась не эффективной против некоторых местных полевых изолятов BOO в Индии и Марокко (4, 5, 6). В связи с этим были получены аттенуированные варианты BOO из местных эпизоотических штаммов (7, 8).

В нашей стране получили культуральную вирусвакцину против оспы овец из вируса, адаптированного к культуре клеток почки крольчат, и проверили ее в производственных условиях (9).

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма Variola ovina ВГНКИ (НИСХИ) №77 BOO, полученного в культуре клеток почки ягнят с титром инфекционной активности 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см³, и целевую добавку в виде стабилизатора, в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	40,0÷60,0
Стабилизатор до	100,0 (10).

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма Sheep capripoxvirus ВГНКИ №6 BOO, полученного в подкожной клетчатке овец с титром инфекционной активности 4,0÷6,5 ИД_50/0,2 см³, и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	40,0÷60,0
Стабилизатор	до 100,0 (11).

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток гонад козы Capra hircus L. (в культуре клеток Ch-91) с титром инфекционной активности 5,0÷6,5 ТЦД_50/см³, и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	80,0÷90,0
Стабилизатор	до 100,0 (12).

Известна вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «НИСХИ» BOO, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с инфекционной активностью 5,5-6,0 ТЦД_50/см³, и целевую добавку в виде стабилизатора в объемном соотношении 1:1 (13).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Durg» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (14).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «GT₄-STV₄₂» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (15).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Mysore» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (16).

Известна вирусвакцина против оспы коз, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «Gorgan» BOK, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде стабилизатора в эффективном соотношении (17).

Известна вирусвакцина против оспы коз культуральная сухая, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ОК/А-04» BOK, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с титром инфекционной активности 5,5÷6,0 ТЦД_50/см³, и целевую добавку в виде лактозо-пептонного стабилизатора в объемном соотношении 1:1 (18).

Недостатки вышеприведенных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз состоят в том, что они являются монопрепаратами и содержат в своем составе лишь один из двух вакцинных штаммов, и их последовательное независимое введение оказывает более сильное стрессовое воздействие на организм иммунизированных животных и требует удвоенного количества трудовых затрат при вакцинации.

Указанные недостатки могут быть устранены созданием ассоциированных вакцин. Уже известна первая попытка создания таких препаратов.

Известна ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец, содержащая смесь из суспензии жизнеспособных спор сибиреязвенного вакцинного штамма «55-ВНИИВВиМ» в исходной концентрации 180-360 млн спор/см³ и антигенного материала из аттенуированного штамма «НИСХИ» BOO, полученного в культуре клеток почки овцы ПО-ВНИИВВиМ с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД_50/см³, и лактозо-пептонный стабилизатор в эффективном соотношении (19).

Недостаток указанной вакцины состоит в том, что она обладает низкой иммуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты животных против эпизоотического BOO, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вирусвакцина против оспы овец, содержащая активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с титром инфекционной активности 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см³, и целевую добавку в виде стабилизатора в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	80,0÷90,0
Стабилизатор	до 100,0 (12).

Существенный недостаток вирусвакцины-прототипа состоит в том, что она не создает защиты против оспы коз.

В связи с этим проблема создания ассоциированной вирусвакцины против оспы мелких жвачных животных, обладающей высокой иммуногенной активностью и безвредностью, продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, создающей эффективную защиту мелких жвачных животных против возбудителей оспы.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз культуральных сухих, способных защитить мелких жвачных животных от возбудителей оспы.

Указанный технический результат достигнут созданием ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз культуральной сухой, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Согласно изобретению предлагаемая вирусвакцина содержит смесь активных веществ, состоящих из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO (авторское наименование), из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК (авторское наименование), полученных в культурах клеток животного происхождения, и целевую добавку стабилизатор; в объемном соотношении и в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животных после введения им целевого препарата.

BOO из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» выращивают в культуре клеток Ch-91, которая является гетерологичной по отношению к овцам.

ВОК из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» выращивают в культуре клеток Ch-91, которая является гомологичной по отношению к козам.

Для изготовления предлагаемой вирусвакцины используют вышеуказанные антигенные материалы с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см³, в равном объемном соотношении.

В качестве стабилизатора используют защитную среду, содержащую 5% сахарозы, 1% желатозы и 3% гидролизата лактальбумина (ГЛА).

В результате проведенных исследований авторами изобретения определен оптимальный состав предлагаемой вирусвакцины:

1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см³, в количестве 40,0÷45,0 мас.%.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см³, в количестве 40,0÷45,0 мас.%.

3. Стабилизатор в количестве 10,0÷20,0 мас.%.

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO получен путем адаптации исходного BOO ВГНКИ (НИСХИ) №77 к перевиваемой культуре клеток Ch-91. При стационарном способе культивирования в культуре клеток Ch-91 вирус накапливается в титрах 5,0-6,0 lg ТЦД_50/см³.

Аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ» BOO депонирован 27.06.1996 г. в качестве вакцинного во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ ВГНКИ и ему присвоен регистрационный номер (шифр) - «ВНИИЗЖ».

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO характеризуется следующими признаками и свойствами (12).

Морфологические свойства

Вирус штамма «ВНИИЗЖ» обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя оспы овец.

Антигенные свойства

При подкожном введении овцам вызывает образование вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител.

Биотехнологические характеристики

Штамм «ВНИИЗЖ» BOO выращивают и поддерживают в перевиваемой культуре клеток Ch-91. Вирус адаптируют к указанной культуре клеток путем проведения 3-5 пассажей. Цитопатогенное действие вируса наступает через 48-96 часов на 98÷100% поверхности зараженного монослоя культуры клеток. При стационарном способе выращивания в культуре клеток Ch-91 вирус накапливается в титрах 5,0÷6,0 lg ТЦД_50/см³.

Иммуногенные свойства

При подкожном введении BOO штамма «ВНИИЗЖ» в дозе 1000 ТЦД₅₀ создает стойкий иммунитет у привитых овец на 4÷5 день после вакцинации продолжительностью 12 месяцев.

Безвредность

BOO штамма «ВНИИЗЖ» безвреден для овец при подкожном введении. Не передается контактным путем чувствительным животным. Для лабораторных животных (кроликов, морских свинок, мышей) не является патогенным. При введении вакцины в прививной дозе в разведении 1:25 кожной и температурной реакции не отмечается.

Реактогенность

BOO штамма «ВНИИЗЖ» ареактогенен для овец при подкожном введении. У овец может вызывать исчезающую через 5÷7 дней местную реакцию в виде воспалительного отека размером 2×3 см при введении вируса в нативном виде по 5,0 см³ подкожно в бесшерстный участок подмышечной области.

Реверсибельность и контагиозность

BOO штамма «ВНИИЗЖ» не восстанавливает вирулентных свойств после 5 последовательных пассажей на овцах (не реверсибелен) и не передается при совместном содержании привитых и интактных овец (не контагиозен).

Стабильность свойств при пассировании

Основные иммунобиоогические свойства штамма стабильно сохраняются на протяжении 10 пассажей в перевиваемой культуре клеток Ch-91 (срок наблюдения).

Сохраняемость

В нативном состоянии штамм «ВНИИЗЖ» BOO не снижает своей активности в течение 3 месяцев при плюс 4°С, в лиофилизированном виде в присутствии 3% пептона, 5% сахарозы и 1% желатина его активность остается на исходном уровне при плюс 4°С и минус 20°С в течение 2 лет (срок наблюдения). После восстановления из лиофилизированного состояния физиологическим раствором вирус не инактивируется при комнатной температуре в течение 24 часов, при минус 4°С - 7 суток.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003», ВОК был выделен в 2003 г. в Приморском крае Российской Федерации от больных оспой коз.

Для получения вируса, обладающего оптимальными биологическими свойствами, использовали различные системы культивирования, в том числе линии клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, BHK-21 и Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что гомологичная система культивирования перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для выращивания выделенного вируса. В результате проведения 35 последовательных пассажей изолята на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуировнный штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства.

В зависимости от дозы заражения и количества пассажей в условиях стационарного культивирования накопление ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне от 6,0 до 7,5 lg ТЦД_50/см³.

По сравнению с исходным изолятом штамм «ВНИИЗЖ 2003» имеет генетические и фенотипические отличия. По результатам сравнительного изучения иммунобиологических характеристик различных штаммов ВОК установлено, что штамм «ВНИИЗЖ 2003» является авирулентным, обладает хорошей антигенной и иммуногенной активностью и защищает от контрольного заражения гомологичным эпизоотическим вирусом.

Преимущество штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК по сравнению с аналогичными штаммами заключается в стабильно высоком накоплении вируса в культуре клеток Ch-91 и его высокой биологической, антигенной иммуногенной активности.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК депонирован 6 июня 2006 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве. Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) под регистрационным номером (ссылкой) - производственный вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003» - ДЕП ВОК.

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК относится к роду Capripoxvirus, семейства Poxviridae и обладает морфологическими признаками, характерными для ВОК.

Вирион ВОК состоит из вирусной сердцевины (нуклеоида), овальных латеральных тел и наружной оболочки. Нуклеоид окружен гладкой мембраной толщиной 5 нм. Внутри него находится нуклеопротеин (ДНК, связанная с белком), имеющий S-образную или более сложную форму. Чувствительные к трипсину структуры, называемые боковыми телами, сдавливают нуклеоид, придавая ему форму двояковогнутого диска, имеющего на срезе вид гантели. Нуклеоид и боковые тела окружены наружной оболочкой, состоящей из липидов и трубчатых белковых структур (10×5 нм).

Геном представлен двухцепочечной ДНК. Две цепи ДНК соединены шпилькообразными петлями, в результате чего образуется одна непрерывная, ковалентно связанная полинуклеотидная цепь. Флип-флоп формы ДНК (т.н. «шпильки») образованы инвертированными концевыми повторами: идентичными, но противоположно ориентированными последовательностями ДНК, длина которых варьирует даже в пределах одного рода (Классификация и номенклатура вирусов позвоночных, 2002).

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ 2003» относится к ВОК.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Ch-91, в реакции диффузионной преципитации (РДП) и в реакции длительного связывания комплемента (РДСК). Штамм проявляет антигенную активность в РДП 1:16÷1:32, в РДСК 1:120÷1:160 и в иммуноферментном анализе (ИФА) 1:1000÷1:4000.

Испытания вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» в лабораторных условиях показали, что иммунизация коз сопровождается образованием вируснейтрализующих антител в крови животных в титре не менее 2,0 log₂.

Биотехнологические характеристики

Штамм «ВНИИЗЖ 2003» ВОК проявляет высокую биологическую, антигенную иммунологическую активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ 2003» репродуцируется в монослойных культурах клеток: первичнотрипсинизированной культуре клеток почки овцы и перевиваемой культуре клеток Ch-91, - и в течение 5-7 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 lg ТЦД_50/см³. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 35 пассажей.

Генотаксономическая характеристика

Геном ВОК не обладает инфекционностью и представлен молекулой линейной двухцепочечной ДНК с центральным менее вариабельным участком длиной около 145 нв и более вариабельными концами.

Физические свойства

При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для каприпоксвирусов.

Вирионы оспы имеют линейную двухслойную ДНК длиной 45÷60 мкм, молекулярной массой 80÷240 МДа. Плавучая плотность ДНК вирусов оспы в хлористом цезии и сахарозе равна 1,676÷1,723 г/см³. Важной особенностью ДНК вируса оспы является необычно прочная структура двухспиральной молекулы. Обе нити молекулы ДНК связаны между собой ковалентно.

Устойчивость к внешним факторам

ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» устойчив к высушиванию эфиром, не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например формалину (0,5÷1%), слабым растворам йода (1:10000), соляной, серной кислот (2,5%), спирту, его инфекционная активность сохраняется при pH 6,0÷7,4.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе живой лиофилизированной вакцины.

Реактогенность - в месте подкожного введения нативного вируса в объеме 5 см³ образуется кожный тяж длиной до 4 см.

Патогенность - при внутримышечном введении животным заболевания не вызывает. При испытании вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» на козах было установлено, что она не вызывала ответной местной реакции на подкожное введение в объеме 5 см³ (125 прививных доз), была безвредна и ареактогенна для коз.

Вирулентность - авирулентен для мелких жвачных животных при контрольном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Антигенные свойства - вирус индуцирует у коз и овец образование вируснейтрализующих антител.

Стабильность биологических свойств - сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток Ch-91 в течение 35 пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 5 пассажей на козах.

При изготовлении вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO и антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученных в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см³, смешивают в равном объемном соотношении, а затем к полученной смеси добавляют стабилизатор в соотношении, мас.%:

Антигенный материал из аттенуированного
штамма «ВНИИЗЖ» BOO	40,0÷45,0
Антигенный материал из аттенуированного
штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК	40,0÷45,0
Стабилизатор	до 100,0.

Содержание антигенных материалов и стабилизатора в прививной дозе предлагаемой вирусвакцины в вышеуказанном соотношении является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию каждого антигена в организме иммунизированных животных.

Полученную смесь расфасовывают в ампулы по 2,0 см³ или во флаконы по 4,0 см³, замораживают при температуре минус 50°С и подвергают лиофильному высушиванию. После сублимации ампулы (флаконы) заполняют сухим стерильным воздухом или инертным газом, ампулы запаивают, а флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают металлическими колпачками. Контроль качества полученного препарата проводят на стерильность, безвредность, специфичность и иммуногенную активность в соответствии с показателями, установленными стандартом организации-изготовителя.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая.

2. Смесь активных веществ.

3. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток животного происхождения, в эффективном количестве.

4. Активное вещество в виде антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток животного происхождения, в эффективном количестве.

5. Стабилизатор.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вирусвакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вирусвакцина ассоциированная против оспы овец и оспы коз культуральная сухая.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток животного происхождения и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ».

3. Стабилизатор.

По сравнению с вирусвакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вирусвакцины является то, что она содержит дополнительно антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК Variola virus caprinum, сем. Poxviridae, подсем. Chordopoxvirinae, рода Capripoxvirus, полученного в культуре клеток животного происхождения и депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «ВНИИЗЖ 2003» - ДЕП, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91, в эффективном количестве.

2. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см³, в количестве 40,0÷45,0 ТЦД_50/см³.

3. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91, в эффективном количестве.

4. Антигенный материал из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученного в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см³, в количестве 40,0÷45,5 мас.%.

5. Стабилизатор в эффективном количестве.

6. Стабилизатор в количестве 10,0÷20,0 мас.%.

7. Смесь из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ» BOO, из антигенного материала из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, полученных в культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 5,5 lg ТЦД_50/см³, и стабилизатора, взятых в соотношении, мас.%:

Антигенный материал из аттенуированного
штамма «ВНИИЗЖ» BOO	40,0÷45,0
Антигенный материал из аттенуированного
штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК	40,0÷45,0
Стабилизатор	до 100,0.

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал вирусвакцин ассоциированных против оспы овец и оспы коз культуральных сухих, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивающих эффективную защиту мелких жвачных животных от возбудителей оспы.

В результате проведенных исследований авторами предлагаемого изобретения установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вирусвакцины, отсутствует конкуренция.

Авторами предлагаемого изобретения обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:

фиг.1 представлено графическое изображение изменения титра ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» при его пассировании в культуре клеток Ch-91 (доза заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл.);

фиг.2 - фотографическое изображение под электронным микроскопом характерной морфологии ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение ×76000;

фиг.3 - хроматограмма результатов видовой дифференциации каприпоксвирусов, полученных методом мультиплексной ПЦР с видоспецифическими праймерами, на которой:

1 - отрицательный контроль;

2 - маркер (снизу вверх - 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

3 - BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

4 - BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

5 - BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

6 - BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

7 - BOO, эпизоотический штамм «Таджикский»;

8 - ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

9 - ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

10 - ВОК, эпизоотический штамм «Pellor»;

11 - ВБ;

12 - смесь BOO и ВОК;

13 - смесь BOO, ВОК и ВБ;

фиг.4 - хроматограмма результатов видовой дифференциации BOO и ВОК, полученных методом рестрикции гена «ankyrin-repeat», на которой:

1 - маркер (снизу вверх - 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 п.н. и т.д.);

2 - BOO, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ»;

3 - BOO, эпизоотический штамм «Афганский»;

4 - BOO, эпизоотический штамм «Приморский»;

5 - BOO, эпизоотический штамм «ЕАО»;

6 - ВОК, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ 2003»;

7 - ВОК, эпизоотический штамм «Приморский 2003»;

8 - ВОК, эпизоотический штамм «Таджикский»;

9 - ВОК, эпизоотический штамм «Pellor».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Технологический процесс изготовления вирусвакцины ассоциированной против оспы овец и оспы коз культуральной сухой состоит из двух этапов: получения посевного BOO штамма «ВНИИЗЖ» и посевного ВОК штамма «ВНИИЗЖ 2003» и производственной серии предлагаемого препарата.

Посевной BOO штамма «ВНИИЗЖ» выращивают в культуре клеток Ch-91. Для этого клетки штамма Ch-91, хранящиеся в жидком азоте, размораживают путем оттаивания в водяной бане при (+37)÷(+38)°C и проводят 1÷2 пассажа для восстановления исходной скорости роста в монослое. Из культурального сосуда с монослоем клеток удаляют среду культивирования. Монослой клеток дважды обрабатывают диспергирующим раствором, содержащим 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор версена, взятые в соотношении 1:3, с добавлением 0,5% декстрозы, до начала отслаивания клеток. Диспергирующий раствор сливают, вносят среду Игла с 10% сыворотки КРС и 0,03% глутамина и суспензию клеток разливают в клинские матрасы. Культуру клеток инкубируют при 37°С в течение 48÷72 часов до момента формирования плотного монослоя. Для получения антигенного материала используют суспензию лиофилизированного или нативного BOO штамма «ВНИИЗЖ» с титром инфекционной активности от 5,0 до 6,0 lg ТЦД_50/см³. Средняя инфицирующая доза вируса должна составлять 0,1 ТЦД₅₀/кл. Внесенную вирусную суспензию экспонируют на предварительно отмытый от остатков ростовой среды раствором Хенкса монослой в течение 1 часа при (37±0,5)°С, после чего в необходимом объеме вносят поддерживающую питательную среду ПСП. Культивирование BOO проводят в течение 12 суток при указанной температуре. При поражении вирусом площади монослоя не менее 80% (округление и появления светопреломляющего эффекта) проводят сбор вируса. Для этого содержимое клинских матрасов замораживают при температуре минус 40°С и проводят оттаивание при комнатной температуре, энергично встряхивая для отделения монослоя. Из каждого матраса берут пробу по 3 см³ для определения контаминирующих примесей и цитопатической активности. Полученный материал хранят при минус 20°С не более 6 месяцев. При активности BOO не ниже 5,5 lg ТЦД_50/см³ стерильный вируссодержащий материал используют для составления производственной серии ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз культуральной сухой.

Пример 2

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК, был выделен в 2003 г. от больных оспой коз в Приморском крае Российской Федерации. Подготовку материала проводили общепринятым методом.

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коз, к культурам первичнотрипсинизированных и перевиваемых линий клеток и его аттенуацию. Для выращивания ВОК были испытаны различные линии культур клеток: ПО, Ch-91, ПСГК, MDBK, СПЭВ, Vero, ВПК-21, Marc-145. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток Ch-91 высокочувствительна к ВОК и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления предлагаемой вирусвакцины.

В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре (37±0,5)°С. После этого вносили поддерживающую среду ПСП или Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при (37±0,5)°С до появления ЦПД вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) 3-кратным промораживанием культуральных матрасов проводили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием его в культуре клеток Ch-91.

Выделенный вирус обладал цитопатическим действием на культуре клеток Ch-91 с первоначальным титром 3,0÷4,0 lg ТЦД_50/см³. В последующих пассажах на этой же культуре клеток титр вируса повышался в 6÷7-м пассажах до 5,0÷5,5 lg ТЦД_50/см³, в 9÷10-м пассажах до 6,0 lg ТЦД_50/см³.

В зависимости от дозы заражения, составляющей 0,01÷1,0 ТЦД_50/кл., накопление аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК в культуре клеток Ch-91 обеспечивалось на уровне 5,33÷7,17 lg ТЦД_50/см³ за 4÷7 суток при 50÷90% поражении клеточного монослоя. Оптимальной инфицирующей дозой вируса считали 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл., вызывающей при стационарном культивировании в течение 5÷7 суток накопление вируса в титре от 6,67±0,08 до 7,17±0,10 lg ТЦД_50/см³ при 80÷90% поражении клеточного монослоя. Результаты исследований представлены в таблице 1. Стабильность культуральных свойств лиофилизированного вируса при определении степени его накопления в течение 35 пассажей в культуре клеток Ch-91 при заражающей дозе 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл. представлена на фиг.1.

Из данных, представленных на фиг.1, следует, что в процессе пассирования в условиях стационарного культивирования ВОК с дозой заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл. его инфекционная активность 6,0÷7,5 lg ТЦД_50/см³ отмечалась в течение первых 13 пассажей. При увеличении количества пассажей инфекционная активность вируса постепенно снижалась. Результаты исследования сроков культивирования ВОК в культуре клеток Ch-91 представлены в таблице 2.

Инфекционная активность штамма «ВНИИЗЖ 2003» ВОК при дозе заражения 0,01÷0,05 ТЦД_50/кл зависела от количества пассажей. На уровне 8÷13 пассажей продолжительность культивирования ВОК не превышала 7 дней. За это время достигалось наиболее выраженное 80÷90% ЦПД вируса и его максимальное накопление в культуре клеток Ch-91. В дальнейшем накопление вируса установлено на более низком уровне, и инфекционная активность вируса следующих пассажей характеризовалась меньшими значениями с увеличением продолжительности культивирования.

В результате осуществления 35 последовательных пассажей выделенного ВОК на культуре клеток Ch-91 был получен аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003», имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства, которые позволяют использовать его для получения антигенного материала при изготовлении диагностикумов и вирусвакцины против оспы коз.

В дальнейшем культуру клеток Ch-91 использовали для получения расплодки ВОК для изготовления вирусвакцины.

Полученный штамм ВОК был испытан сначала в лабораторных, а затем и в эпизоотических условиях. В результате проведенных исследований установлено следующее:

1. Проверку на стерильность осуществляли путем высева проб вируссодержащей жидкости на бактериальные питательные среды МПБ, МПА, МППБ, агар Сабуро (жидкий) и тиогликолев