Полипептиды, обладающие противомикробным действием, и кодирующие их полинуклеотиды

Полипептиды, обладающие противомикробным действием, и кодирующие их полинуклеотиды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим противомикробным действием и выделенным полинуклеотидам, кодирующим эти полипептиды. Изобретение также относится к конструкциям нуклеиновых кислот, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды, а также к способам получения и применения полипептидов.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является разработка полипептидов, обладающих противомикробным действием, и кодирующих их полинуклеотидов.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к полипептидам, обладающим противомикробным действием, которые содержат аминокислотную последовательность, представленную: С-х(3)-С-х(7,9)-С-С; С-С-х(8)-С-х-С; или С-х-С-х(8,11)-С.

В варианте осуществления изобретения полипептиды являются дефензинами.

В еще одном варианте осуществления изобретения полипептиды выбраны из группы, состоящей из:

(а) полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 60% идентичности с:

аминокислотами с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислотами с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислотами с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислотами с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислотами с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислотами с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислотами с 1 по 59 из SEQ ID NO:28.

(b) полипептида, который кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется при по крайней мере средних условиях с (i)

нуклеотидами от 151 до 297 из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9;

нуклеотидами от 118 до 255 из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13;

нуклеотидами от 112 до 255 из SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19;

нуклеотидами от 118 до 252 из SEQ ID NO:21;

нуклеотидами от 151 до 297 из SEQ ID NO:23;

нуклеотидами от 121 до 252 из SEQ ID NO:25; или

нуклеотидами от 145 до 321 из SEQ ID NO:27; или (ii) комплементарной цепью (i); и

(с) варианта, содержащего консервативную замену, делецию и/или вставку одной или более аминокислот из:

аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислот с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислот с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислот с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислот с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислот с 1 по 59 из SEQ ID NO:28.

Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, обладающие противомикробным действием, выбранным из группы, состоящей из:

(а) полинуклеотида, кодирующего полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 60% идентичности с:

аминокислотами с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислотами с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислотами с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислотами с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислотами с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислотами с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислотами с 1 по 59 из SEQ ID NO:28.

(b) полинуклеотида, имеющего по крайней мере 60% идентичности с нуклеотидами от 151 до 297 из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9;

нуклеотидами от 118 до 255 из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13;

нуклеотидами от 112 до 255 из SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19;

нуклеотидами от 118 до 252 из SEQ ID NO:21;

нуклеотидами от 151 до 297 из SEQ ID NO:23;

нуклеотидами от 121 до 252 из SEQ ID NO:25; или

нуклеотидами от 145 до 321 из SEQ ID NO:27; и

(с) полинуклеотида, который гибридизуется при по крайней мере среднежестких условиях с (i):

нуклеотидами от 151 до 297 из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9;

нуклеотидами от 118 до 255 из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13;

нуклеотидами от 112 до 255 из SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:19;

нуклеотидами от 118 до 252 из SEQ ID NO:21;

нуклеотидами от 151 до 297 из SEQ ID NO:23;

нуклеотидами от 121 до 252 из SEQ ID NO:25; или

нуклеотидами от 145 до 321 из SEQ ID NO:27; или (ii) комплементарной цепью (i).

Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновых кислот, векторам для рекомбинантной экспрессии и рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды.

Настоящее изобретение также относится к способам получения таких полипептидов, обладающих противомикробным действием, содержащим (а) культивирование рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую полинуклеотид, кодирующий полипептид, при условиях, способствующих получению полипептида; (b) выделение полипептида.

Настоящее изобретение также относится к способам применения полипептидов и полинуклеотидов по изобретению.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Противомикробное действие: Термин «противомикробное действие» определен здесь как действие, способное лизировать клетки или ингибировать рост клеток микробов. Применительно к настоящему изобретению термин «противомикробный» означает, что присутствует бактерицидный, и/или бактериостатический, и/или фунгицидный, и/или фунгистатический эффект, и/или вирулицидный эффект, где термин «бактерицидный» следует понимать, как способный лизировать бактериальные клетки. Термин «бактериостатический» следует понимать, как способный ингибировать рост бактерий, т.е. ингибировать рост бактериальных клеток. Термин «фунгицидный» следует понимать, как способный лизировать клетки грибов. Термин «фунгистатический» следует понимать, как способный ингибировать рост грибов, т.е. ингибировать рост клеток грибов. Термин «вирулицидный» следует понимать, как способный инактивировать вирус. Термин «микробные клетки» означает бактериальные или грибные клетки (включая дрожжи).

Применительно к настоящему изобретению термин «ингибирование роста микробных клеток» означает, что клетки находятся в стационарной фазе, т.е. они не способны к размножению.

Для целей настоящего изобретения противомикробное действие может быть определено по методу, описанному Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) p. 167-174 (1991). В качестве альтернативы противомикробное действие может быть определено согласно руководству NCCLS (Национального Комитета по Клиническим и Лабораторным Стандартам) от CLSI (Института Клинических и Лабораторных Стандартов; ранее известного как Национальный Комитет по Клиническим и Лабораторным Стандартам).

Полипептиды, обладающие противомикробным действием, могут быть способны уменьшать количество живых клеток Escherichia coli (DSM 1576) до 1/100 после 8 часов (предпочтительно, после 4 часов, более предпочтительно, после 2 часов, наиболее предпочтительно, после 1 часа, и, в особенности, после 30 минут) инкубации при 20°С в 25% (по весу) водном растворе; предпочтительно, в 10% (по весу) водном растворе; более предпочтительно, в 5% (по весу) водном растворе; еще более предпочтительно, в 1% (по весу) водном растворе; наиболее предпочтительно, в 0,5% (по весу) водном растворе; и, в особенности, в 0,1% (по весу) водном растворе полипептида, обладающего противомикробным действием.

Полипептиды, обладающие противомикробным действием, могут также быть способными ингибировать разрастание Escherichia coli (DSM 1576) в течение 24 часов при 25°С в субстрате для роста микроорганизмов при добавлении в концентрации 1000 ppm (миллионных долей); предпочтительно, при добавлении в концентрации 500 ppm (миллионных долей); более предпочтительно, при добавлении в концентрации 250 ppm; еще более предпочтительно, при добавлении в концентрации 100 ppm; наиболее предпочтительно, при добавлении в концентрации 50 ppm; и, в особенности, при добавлении в концентрации 25 ppm.

Полипептиды, обладающие противомикробным действием, могут являться способными уменьшать число живых клеток Bacillus subtilis (ATCC 6633) до 1/100 после 8 часов (предпочтительно, после 4 часов, более предпочтительно, после 2 часов, наиболее предпочтительно, после 1 часа, и, в особенности, после 30 минут) инкубации при 20°С в 25% (по весу) водном растворе; предпочтительно, в 10% (по весу) водном растворе; более предпочтительно, в 5% (по весу) водном растворе; еще более предпочтительно, в 1% (по весу) водном растворе; наиболее предпочтительно, в 0,5% (по весу) водном растворе; и, в особенности, в 0,1% (по весу) водном растворе полипептида, обладающего противомикробным действием.

Полипептиды, обладающие противомикробным действием, могут также быть способными ингибировать разрастание Bacillus subtilis (ATCC 6633) в течение 24 часов при 25°С в субстрате для роста микроорганизмов при добавлении в концентрации 1000 ppm (миллионных долей); предпочтительно, при добавлении в концентрации 500 ppm; более предпочтительно, при добавлении в концентрации 250 ppm; еще более предпочтительно, при добавлении в концентрации 100 ppm; наиболее предпочтительно, при добавлении в концентрации 50 ppm; и, в особенности, при добавлении в концентрации 25 ppm.

Полипептиды согласно настоящему изобретению обладают по крайней мере 20%, предпочтительно по крайней мере 40%, более предпочтительно, по крайней мере 50%, более предпочтительно, по крайней мере 60%, более предпочтительно, по крайней мере 70%, более предпочтительно, по крайней мере 80%, еще более предпочтительно, по крайней мере 90%, наиболее предпочтительно, по крайней мере 95% и, еще наиболее предпочтительно по крайней мере 100% от противомикробной активности полипептида, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной

аминокислотами с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислотами с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислотами с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислотами с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислотами с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислотами с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислотами с 1 по 59 из SEQ ID NO:28.

Дефензин: Термин «дефензин», используемый здесь, относится к полипептидам, признанными специалистами, как принадлежащими к классу дефензинов противомикробных пептидов. Чтобы определить, является ли полипептид дефензином по изобретению, аминокислотная последовательность, предпочтительно, сравнивается с профайлами скрытой модели маркова (НММ профайлами) базы данных. PFAM посредством применения свободно доступного пакета программ НММЕR (см. Пример 6).

Семейства дефензинов PFAM включают Дефензин_1 или «Дефензин млекопитающих» (номер доступа PF00323), Дефензин_2 или «Дефензин членистоногих» (номер доступа PF01097), Дефензин_бета или «Бета дефензин» (номер доступа PF00711). Дефензин_пропеп или «Дефензиновый пропептид» (номер доступа PF00879) и Гамма-тионин или «Гамма-тиониновое семейство» (номер доступа PF00304).

Дефензины могут принадлежать к классу альфа-дефензинов, классу бета-дефензинов, классу тета-дефензинов, классам дефензинов насекомых или членистоногих или классу растительных дефензинов.

В варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность дефензина по изобретению содержит 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков цистеина, предпочтительно, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков цистеина, более предпочтительно, 6, 8 или 10 остатков цистеина, и, наиболее предпочтительно, 6 или 8 остатков цистеина.

Дефензины могут также являться синтетическими дефензинами, совмещая характерные свойства любого класса дефензинов.

Примеры дефензинов включают, но не ограничены этим, α-Дефензин HNP-1 (пептид нейтрофилов человека), HNP-2 и HNP-3; β-Дефензин-12, Дрозомицин, Хелиомицин, γ1-пуротионин, Дефензин А насекомых и дефензины, раскрытые в РСТ заявках WO 99/53053, WO 02/06324, WO 02/085934, WO 03/044049, PCT/DK2005/000725 и PCT/DK2005/000735.

Выделенный полипептид: Термин «выделенный полипептид», используемый здесь, относится к полипептиду, который обладает по крайней мере 20% чистотой, предпочтительно, по крайней мере 40% чистотой, более предпочтительно, по крайней мере 60% чистотой, еще более предпочтительно, по крайней мере 80% чистотой, наиболее предпочтительно, по крайней мере 90% чистотой и, еще наиболее предпочтительно, по крайней мере 95% чистотой, определенной посредством ДСН-ПААГ.

Практически чистый полипептид: Термин «практически чистый полипептид» означает здесь полипептидный препарат, который содержит самое большее 10%, предпочтительно, самое большее 8%, более предпочтительно, самое большее 6%, более предпочтительно, самое большее 5%, более предпочтительно, самое большее 4%, самое большее 3%, еще более предпочтительно, самое большее 2%, наиболее предпочтительно, самое большее 1% и, еще более предпочтительно, самое большее, 0,5% по весу другого полипептидного материала, с которым он связан неочищенным. Таким образом, предпочтительным является, что практически чистый полипептид имеет по крайней мере 92% чистоты, предпочтительно, по крайней мере 94% чистоты, более предпочтительно, по крайней мере 95% чистоты, более предпочтительно, по крайней мере 96% чистоты, более предпочтительно, по крайней мере 97% чистоты, более предпочтительно, по крайней мере 98% чистоты, еще более предпочтительно, по крайней мере 99% чистоты, наиболее предпочтительно, по крайней мере 99,5% чистоты и, еще более предпочтительно, по крайней мере 100% чистоты по весу от общего полипептидного материала, присутствующего в препарате.

Полипептиды согласно настоящему изобретению находятся, предпочтительно, в практически чистом виде. В частности, предпочтительно, чтобы полипептиды находились в преимущественно чистом виде, т.е., чтобы полипептидный препарат являлся преимущественно свободным от другого полипептидного материала, с которым он связан неочищенным. Это можно достичь, например, посредством получения полипептида широко известными рекомбинантными способами или классическими способами очистки.

Здесь, термин, «практически чистый полипептид» является синонимом терминам «выделенный полипептид» иди «полипептид в выделенном виде».

Идентичность: Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром «идентичность».

Для целей настоящего изобретения степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяется посредством использования программы FASTA, включенной в версию 2,0х пакета программ FASTA (см. W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; и W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). Используемой матрицей весов была BLOSUM50, штраф на пропуск был -12 и штраф на продолжение разрыва был -2.

Степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяли, используя тот же алгоритм и пакет программ, описанный выше. Используемой матрицей весов была матрица сходства, штраф на пропуск был -16 и штраф на продолжение разрыва был -4.

В качестве альтернативы, выравнивание двух аминокислотных последовательностей определяли посредством использования программы Needle из пакета EМBOSS (http://emboss.org) version 2.8.0. Программа Needle выполняет общий алгоритм выравнивания, описанный в Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453. Используемой матрицей подстановки является BLOSUM62, штраф на первую аминокислоту разрыва равен 10 и штраф на продолжение разрыва равен 0,5.

Степень идентичности между аминокислотной последовательностью настоящего изобретения («последовательностью изобретения»; например, аминокислотами от 1 до 49 из SEQ ID NO:2) и отличающейся аминокислотной последовательностью («чужеродной последовательностью») подсчитывается как число точных совпадений в перекрытии выравнивания двух последовательностей, разделенное на длину «последовательности изобретения» или длину «чужеродной последовательности», любую самую короткую. Результат представлен в процентах идентичности.

Полное совпадение случается, когда «последовательность изобретения» или «чужеродная последовательность» имеют идентичные аминокислотные остатки в одинаковых положениях перекрывания. Длина последовательности является числом аминокислотных остатков в последовательности (например, длина аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:2 равна 49).

Полипептидный фрагмент: Термин «полипептидный фрагмент» определен здесь как полипептид, имеющий одну или более аминокислот, удаленных с амино и/или карбокси конца SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:28, или последовательностей, гомологичных им, где фрагмент обладает противомикробным действием.

Субпоследовательность: Термин «субпоследовательность» определен здесь как нуклеотидная последовательность, имеющая один или более нуклеотидов, удаленных с 5' и/или 3' конца SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27 или последовательностей, гомологичных им, где субпоследовательность кодирует полипептидный фрагмент, обладающий противомикробным действием.

Аллельный вариант: Термин «аллельный вариант» обозначает здесь любую из двух или более альтернативных форм гена, занимающих одинаковый хромосомный локус. Аллельное разнообразие возникает в природе через мутации и может приводить к полиморфизму внутри популяций. Мутации генов могут быть молчащими (нет замен в кодируемом полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененные аминокислотные последовательности. Аллельный вариант полипептида является полипептидом, кодируемым аллельным вариантом гена.

Практически чистый полинуклеотид: Термин «практически чистый полинуклеотид», используемый здесь, относится к препарату полинуклеотида, свободному от других внешних или нежелательных нуклеотидов и в виде, подходящем для использования в системах получения созданных методами генетической инженерии белков. Поэтому, практически чистый нуклеотид содержит, самое большее 10%, предпочтительно, самое большее, 8%, более предпочтительно, самое большее 6%, более предпочтительно, самое большее 5%, более предпочтительно, самое большее 4%, более предпочтительно, самое большее 3%, еще более предпочтительно, самое большее 2%, наиболее предпочтительно, самое большее 1% и, еще более предпочтительно, самое большее, 0,5% по весу другого полинуклеотидного материала, с которым он связан неочищенным. Практически чистый полинуклеотид может, однако, включать естественные 5' и 3' нетранслируемые области, такие как промоторы и терминаторы. Предпочтительным является, что практически чистый полинуклеотид имеет по крайней мере 90% чистоты, предпочтительно, по крайней мере 92% чистоты, более предпочтительно, по крайней мере 94% чистоты, более предпочтительно, по крайней мере 95% чистоты, более предпочтительно, по крайней мере 96% чистоты, более предпочтительно, по крайней мере 97% чистоты, еще более предпочтительно, по крайней мере 98% чистоты, наиболее предпочтительно по крайней мере 99% чистоты и, еще наиболее предпочтительно, по крайней мере 99,5% чистоты по весу. Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению находятся предпочтительно в практически чистом виде. В частности, предпочтительно, чтобы полинуклеотиды, раскрытые здесь, находились в «преимущественно чистом виде», т.е. чтобы полинуклеотидный препарат являлся преимущественно свободным от другого полинуклеотидного материала, с которым он связан неочищенным. Здесь термин «практически чистый полинуклеотид» является синонимом терминам «выделенный полинуклеотид» или «полинуклеотид в выделенном виде». Полинуклеотиды могут быть геномного, кДНК, РНК, полусинтетического, синтетического происхождения или любой их комбинацией.

кДНК: Термин «кДНК» определен здесь как молекула ДНК, которая может быть получена путем обратной транскрипции из зрелой сплайсированной мРНК молекулы, полученной из эукариотической клетки. В кДНК отсутствуют интронные последовательности, которые обычно присутствуют в соответствующей геномной ДНК. Начальный первичный РНК-транскрипт является предшественником мРНК, который процессируется посредством серии этапов перед появлением в качестве зрелой сплайсированной мРНК. Эти этапы включают удаление интронных последовательностей посредством процесса, называемого сплайсингом. кДНК, производное от мРНК, не имеет, таким образом, никаких интронных последовательностей.

Конструкция нуклеиновой кислоты: Термин «конструкция нуклеиновой кислоты», используемый здесь, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, одно- или двух-цепочечной, которая выделена из встречающегося в природе гена, или которая является модифицированной для содержания сегментов нуклеиновых кислот так, что иным образом не существовала бы в природе. Термин конструкция нуклеиновой кислоты является синонимом термину «экспрессионная кассета», когда конструкция нуклеиновой кислоты содержит контролирующие последовательности, требующиеся для экспрессии кодирующей последовательности согласно настоящему изобретению.

Контролирующая последовательность: Термин «контролирующая последовательность» определен здесь как включающий все компоненты, которые являются необходимыми или преимущественными для экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид согласно настоящему изобретению. Каждая управляющая последовательность может быть своей или чужеродной для нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. Такие контролирующие последовательности включают, но не ограничены этим, лидер, последовательность полиаденилирования, последовательность пропептида, промотор, сигнальную пептидную последовательность и терминатор транскрипции. Самое меньшее управляющие последовательности включают промотор и транскрипционные и трансляционные стоп-сигналы. Контролирующие последовательности могут быть предоставлены с линкерами для цели введения особых сайтов рестрикции, облегчающих лигирование управляющих последовательностей с кодирующей областью нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид.

Функционально присоединенный: Термин «функционально присоединенный» означает здесь конфигурацию, в которой управляющая последовательность помещена в соответствующее положение, относительно кодирующей последовательности полипептидной последовательности так, что управляющая последовательность управляет экспрессией кодирующей последовательности полипептида.

Кодирующая последовательность: При использовании здесь термин «кодирующая последовательность» означает нуклеотидную последовательность, которая прямо определяет аминокислотную последовательность ее белкового продукта. Границы кодирующей последовательности обычно определены открытой рамкой считывания, которая обычно начинается с ATG старт-кодона или альтернативных старт-кодонов, таких как GTG или TTG. Кодирующая последовательность может быть ДНК, кДНК или рекомбинантной нуклеотидной последовательностью.

Экспрессия: Термин «экспрессия» включает любой этап, вовлеченный в получение полипептида, включая, но не ограничиваясь этим, транскрипцию, пост-транскрипционные модификации, трансляцию, пост-трансляционные модификации и секрецию.

Экспрессионный вектор: Термин «экспрессионный вектор» определен здесь как линейная или кольцевая молекула ДНК, которая содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид изобретения, и который функционально присоединен к дополнительным нуклеотидам, которые обеспечивают его экспрессию.

Клетка-хозяин: Термин «клетка-хозяин», используемый здесь, включает любой тип клеток, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции и им подобным конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид настоящего изобретения.

Модификация: Термин «модификация» означает здесь любую химическую модификацию полипептида, состоящего из

аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислот с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислот с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислот с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислот с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислот с 1 по 59 из SEQ ID NO:28; а также генетические манипуляции с ДНК, кодирующей этот полипептид. Модификация(и) может(гут) быть заменой(ами), делецией(ями) и/или вставкой(ами) аминокислот(ы), а также заменой(ами) в боковой(ых) цепи(ях) аминокислот; или использованием неприродных аминокислот с похожими характеристиками в аминокислотной последовательности. В частности, модификация(ии) может(гут) быть образованием амидной связи, таким как образование амидной связи на С-конце.

Искусственный вариант: При использовании здесь термин «искусственный вариант» означает полипептид, обладающий противомикробным действием, полученный с помощью организма, экспрессирующего модифицированную нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27. Модифицированную нуклеотидную последовательность получают посредством вмешательства человека посредством модификации нуклеотидной последовательности, раскрытой в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПОЛИПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОМИКРОБНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

В первом аспекте, изобретение относится к полипептидам, обладающим противомикробным действием, которые содержат аминокислотную последовательность, представленную: С-х(3)-С-х(7,9)-С-С; С-С-х(8)-С-х-С; или С-х-С-х(8,11)-С.

В варианте осуществления изобретения полипептиды содержат аминокислотную последовательность, представленную:

C-x(3)-C-x(7,9)-C-C и C-C-x(8)-C-x-C; или

C-C-x(8)-C-x-C и C-x-C-x(8,11)-C; или

C-x(3)-C-x(7,9)-C-C и C-x-C-x(8,11)-C; или

C-x(3)-C-x(7,9)-C-C и C-C-x(8)-C-x-C и C-x-C-x(8,11 )-C.

Консенсусы C-x(3)-C-x(7,9)-C-C; C-C-x(8)-C-x-C и C-x-C-x(8,11)-C следует интерпретировать, используя PROSITE (www.expasy.org/prosite/) формат определения консенсусов:

- для аминокислот использован стандартный однобуквенный код IUPAC;

- символ «х» использован для положения, где разрешена любая аминокислота;

- каждый элемент в образце отделен от соседнего посредством «-»; и

- повтор элемента в консенсусе указан посредством следующих за элементом численной величины или численного диапазона в скобках. Например: х(3) соответствует х-х-х, х(2,4) соответствует х-х или х-х-х или х-х-х-х.

Для большей информации по применению принципа PROSITE, обращайтесь Sigrist et al. PROSITE: a documented database using patterns and profiles as motif descriptors. Brief Bioinform. 3:265-274 (2002).

Во втором аспекте, который может быть вариантом осуществления первого аспекта, изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности с аминокислотами с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислотами с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислотами с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислотами с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислотами с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислотами с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислотами с 1 по 59 из SEQ ID NO:28 (т.е. зрелыми полипептидами) по крайней мере 60%, предпочтительно, по крайней мере 65%, более предпочтительно, по крайней мере 70%, более предпочтительно, по крайней мере 75%, более предпочтительно, по крайней мере 80%, более предпочтительно по крайней мере 85%, еще более предпочтительно, по крайней мере 90%, наиболее предпочтительно, по крайней мере 95% и, еще наиболее предпочтительно, по крайней мере 97%, которые обладают противомикробным действием (ниже «гомологичные полипептиды»). В предпочтительном аспекте гомологичные полипептиды имеют аминокислотную последовательность, которая отличается десятью аминокислотами, предпочтительно, пятью аминокислотами, более предпочтительно, четырьмя аминокислотами, еще более предпочтительно, тремя аминокислотами, наиболее предпочтительно, двумя аминокислотами и, еще более предпочтительно, одной аминокислотой от аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислот с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислот с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислот с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислот с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислот с 1 по 59 из SEQ ID NO:28.

Полипептид настоящего изобретения предпочтительно содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:28, или аллельный их вариант; или их фрагмент, который обладает противомикробным действием. В предпочтительном аспекте полипептид содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:28. В другом предпочтительном аспекте полипептид содержит аминокислоты с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислоты с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислоты с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислоты с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислоты с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислоты с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислоты с 1 по 59 из SEQ ID NO:28, или их аллельный вариант; или их фрагмент, который обладает противомикробным действием. В еще одном предпочтительном аспекте полипептид содержит аминокислоты с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислоты с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислоты с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислоты с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислоты с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислоты с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислоты с 1 по 59 из SEQ ID NO:28.

В еще одном предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:28, или их аллельного варианта; или их фрагмента, который обладает противомикробным действием. В еще одном предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:28. В еще одном предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислот с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислот с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислот с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислот с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислот с 1 по 59 из SEQ ID NO:28 или их аллельного варианта; или их фрагмента, который обладает противомикробным действием. В еще одном предпочтительном аспекте полипептид состоит из аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:10;

аминокислот с 1 по 46 из SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14;

аминокислот с 1 по 48 из SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:20;

аминокислот с 1 по 45 из SEQ ID NO:22;

аминокислот с 1 по 49 из SEQ ID NO:24;

аминокислот с 1 по 44 из SEQ ID NO:26; или

аминокислот с 1 по 59 из SEQ ID NO:28.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к выделенным полипептидам, обладающим противомикробным действием, которые кодируются полинуклеотидами, гибридизующимися при очень мягких условиях, предпочтительно, мягких условиях, более предпочтительно, средних условиях, более предпочтительно, средне-жестких условиях, еще более предпочтительно, жестких условиях и, наиболее предпочтительно, очень жестких условиях с (i) нуклеотидами от 151 до 297 из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9;

нуклеотидами от 118 до 255 из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13;

нуклеотидами от 112 до 255 из SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19;

нуклеотидами от 118 до 252 из SEQ ID NO:21;

нуклеотидами от 151 до 297 из SEQ ID NO:23;

нуклеотидами от 121 до 252 из SEQ ID NO:25; или

нуклеотидами от 145 до 321 из SEQ ID NO:27;

(ii) последовательностью кДНК, содержащейся в нуклеотидах от 1 до 297 из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9;

нуклеотидах от 1 до 255 из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13;

нуклеотидах от 1 до 255 из SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19;

нуклеотидах от 1 до 252 из SEQ ID NO:21;

нуклеотидах от 1 до 297 из SEQ ID NO:23;

нуклеотидах от 1 до 252 из SEQ ID NO:25; или

нуклеотидах от 1 до 321 из SEQ ID NO:27;

(iii) субпоследовательностью из (i) или (ii), или (iv) комплементарной цепью (i), (ii) или (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). Субпоследовательность из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27 содержит по крайней мере 100 сопряженных нуклеотидов, или, предпочтительно, 200 сопряженных нуклеотидов. Кроме того, субпоследовательность может кодировать полипептидный фрагмент, который обладает противомикробным действием.

Нуклеотидные последовательности из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27 или их субпоследовательности, а также аминокислотные последовательности из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:28, или их фрагменты могут быть использованы для создания зонда нуклеиновой кислоты для обнаружения и клонирования ДНК, кодирующей полипептиды, обладающие противомикробным действием, из штаммов различных родов или видов по способам, хорошо известным в данной области. В частности, такие пробы могут быть использованы для гибридизации с геномной или кДНК интересующего рода или вида, следуя стандартной методике Саузерн блоттинга, для обнаружения или выделения соответствующего гена в ней. Такие зонды могут быть значительно короче, чем полная последовательность, но должны иметь по крайней мере 14, предпочтительно, по крайней мере 25, более предпочтительно по крайней мере 35 и, наиболее предпочтительно по крайней мере 75 нуклеотидов в длину. Однако предпочтительным является, чтобы зонд нуклеиновой кислоты имел по крайней мере 100 нуклеотидов в длину. Например, зонд нуклеиновой кислоты может иметь по крайней мере 200 нуклеотидов, предпочтительно по крайней мере 250 нуклеотидов. Могут быть использованы как ДНК, так и РНК зонды. Зонды обычно метят для детекции соответствующего гена (например, ³²Р, ³Н, ³⁵S, биотином или авидином). Такие зонды являются охваченными настоящим изобретением.

Библиотеки геномной ДНК или кДНК, приготовленные из таких организмов, могут, таким образом, быть скринированы на ДНК, которая гибридизуется с пробами, описанными выше, и которая кодирует полипептид, обладающий противомикробным действием. Геномная или другая ДНК из таких других организмов могут быть разделены электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле, или другими методами разделения. ДНК из библиотек или выделенная ДНК могут быть перенесены и иммобилизованы на нитроцеллюлозе или другом подходящем материале-носителе. Для обнаружения клона или ДНК, которые гомологичны с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27, или их субпоследовательностью материал-носитель используется в Саузерн-блоте.

Для целей настоящего изобретения гибридизация показывает, что нуклеотидная последовательность гибридизуется с меченным зондом нуклеиновой кислоты, соответствующей нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27, ее комплементарной последовательности, или ее субпоследовательности при очень мягких до очень жестких условиях гибридизации. Молекулы, с которыми гибридизуется зонд нуклеиновой кислоты, могут быть обнаружены, используя рентгеновскую пленку.

В предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты является полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептиды из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:28, или их субпоследовательности. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты является SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27. В другом предпочтительном аспекте зонд нуклеиновой кислоты является областью, кодирующей зрелый полипептид, из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:27.

Для длинных зондов длиной по крайней мере 100 нуклеотидов определены условия гибридизации от очень мягких до очень жестких как предгибридизация и гибридизация при 42°С в 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 мкг/мл разрушенной и денатурированной ДНК из спермы лосося, и в или 25% формамиде для очень мягких или мягких условий, или 35% формамиде для средних или среднежестких условий, или 50% формамиде для жестких или очень жестких условий, следуя стандартной методике Саузерн блоттинга, оптимально, в течение от 12 до 24 часов.

Для длинных зондов длиной по крайней мере 100 нуклеотидов материал-носитель в конце промывают три раза, каждый по 15 минут, используя 2Х SSC, 0,2% SDS, предпочтительно, по крайне