Мутантная фосфорибозилпирофосфатсинтетаза, днк, кодирующая ее, бактерия, содержащая указанную днк, способ продукции пуриновых нуклеозидов и cпособ продукции пуриновых нуклеотидов

Мутантная фосфорибозилпирофосфатсинтетаза, днк, кодирующая ее, бактерия, содержащая указанную днк, способ продукции пуриновых нуклеозидов и cпособ продукции пуриновых нуклеотидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способу продукции пуриновых рибонуклеозидов, таких как инозин и гуанозин, представляющих ценность в качестве сырья для синтеза 5'-инозиновой кислоты и 5-гуаниловой кисоты, соответственно. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому, устойчивому к ингибированию по типу обратной связи ферменту, вовлеченному в биосинтез пуринов. Более конкретно, настоящее изобретение касается новой, устойчивой к ингибированию по типу обратной связи мутантной фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP synthetase - phosphoribosylpyrophosphate synthetase) из бактерий рода Bacillus. Данное изобретение также относится к способу продукции пуриновых рибонуклеозидов и пуриновых рибонуклеотидов путем ферментации с использованием бактериальных штаммов, содержащих устойчивый к ингибированию по типу обратной связи фермент, кодируемый мутантным геном prs.

Описание предшествующего уровня техники

Существуют известные способы ферментативной продукции пуриновых нуклеозидов с использованием ауксотрофных по аденину штаммов или таких штаммов, которым, кроме того, придана устойчивость к различным соединениям, таким как аналоги пурина и сульфагуанидин, каковые штаммы принадлежат к роду Bacillus (опубликованные патенты Японии Nos.38-23039 (1963), 54-17033 (1979), 55-2956 (1980), и 55-45199 (1980), выложенная патентная заявка Японии No.56-162998 (1981), опубликованные патенты Японии Nos.57-14160 (1982) и 57-41915 (1982) и выложенная патентная заявка Японии No.59-42895 (1984)) или к роду Brevibacterium (опубликованные патенты Японии Nos.51-5075 (1976) и 58-17592 (1972), и Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)), или к роду Escherichia (международная заявка РСТ WO 9903988) и подобные им. Традиционное получение таких мутантных штаммов включает мутагенную обработку микроорганизмов, такую как УФ-облучение и обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-М-нитрозогуанидин), и отбор искомого штамма с использованием соответствующей селективной среды. С другой стороны, получение таких мутантных штаммов с использованием методов генной инженерии также практикуется для штаммов, принадлежащих к роду Bacillus (выложенные патентные заявки Японии Nos. 58-158197 (1983), 58-175493 (1983), 59-28470 (1984), 60-156388 (1985), 1-27477 (1989), 1-174385 (1989), 3-58787 (1991), 3-164185 (1991), 5-84067 (1993) и 5-192164 (1993), патент США 7326546 (2008)) и к роду Brevibacterium (выложенная патентная заявка Японии No.63-248394 (1988)). Продуктивность этих штаммов-продуцентов инозина может быть дополнительно улучшена путем увеличения способности к секреции инозина (патентные заявки РФ 2002101666, 2002104463 и 2002104464).

5-Фосфорибозил-α-1-пирофосфат (далее - "PRPP") и глутамин являются исходными субстратами при биосинтезе пуринов. PRPP-синтетаза [ЕС 2.7.6.1], катализирующая реакцию рибозо-5-фосфата с АТФ с образованием PRPP и АМФ, связывает пентозофосфатный путь с биосинтезом пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, с биосинтезом гистидина и триптофана и пиридин-нуклеотидных коферментов (Jensen K..F. In Metabolism of Nucleotides, Nucleosides and Nucleobases in Microorganisms (ed. Munch-Petersen A.), 1-25. Academic Press, London; 1983).

PRPP-синтетаза подвержена ингибированию пуринами, пиримидинами и аминокислотами по типу обратной связи. Многие пуриновые нуклеотиды ингибируют активность PRPP-синтетазы конкуретно с адениозин-5'-трифосфатом (далее, "АТР"). Однако единственный сильный нуклеотидный ингибитор - это аденозин-5'-дифосфат (ADP-adenosine-5'-diphosphate); он конкурирует с АТР и является аллостерическим ингибитором, который связывается с сайтом, отличным от активного центра (Hove-Jensen, В. et al., J. Biol. Chem. 261: 6765-6771 (1986); Amvig K. et al., Eur. J. Biochem. 192:195-200 (1990)).

Известно, что гиперурикемия человека и подагра обусловлены повышенной активностью и устойчивостью к пуриновым нуклеотидам PRPP-синтетазы (Becker M.A. et al. Arthritis Rheum, 18:6 Suppl: 687-94 (1975); Zoref E. et al., J. Clin. Invest., 56: 1093-9 (1975); Becker M.A. et al., J. Clin. Invest., 96: 2133-41 (1995)). Сверхсинтез мочевой кислоты у лиц с повышенной активностью PRPP-синтетазы является результатом повышенной продукции PRPP и последующего ускорения синтеза пуриновых нуклеотидов de novo. Показано, что повышенная активность PRPP-синтетазы является результатом нескольких мутаций в соответствующем гене, представляющих собой специфическую замену аминокислотных остатков в ферменте человека: аспарагина на гистидин в положении 51, аспарагина на серин в положении 113, лейцина на изолейцин в положении 128, аланина на валин в положении 189. Такая мутантная PRPP-синтетаза устойчива к пуриновым нуклеотидам, ингибирующим нормальный фермент по механизму, неконкурентному по отношению к АТР (Roessler. B.J. et al. J. Biol. Chem., v.268, No 35, 26476-26481 (1993); Becker, M.A. et al., J. Clin. Invest., 96: 2133-41 (1995)).

Раскрыт процесс продукции пуриновых нуклеозидов через ферментацию микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia и имеющего способность к продукции пуринового нуклеозида, с мутацией prs D128A (патентная заявка США 20070161090 (2007)). Кроме того, описан способ продукции L-гистидина с использованием мутантной PRPP-синтетазы, отличающейся тем, L-аминокислотный остаток, соответствующий положению 115 в PRPP-синтетазе дикого типа Escherichia coli замещен другим аминокислотным остатком (патентная заявка США 20050176033, (2005)). Кроме того, показано, что штамм Ashbya gossypii с повышенной экспрессией мутантной PRPP-синтетазы с мутацией H196Q, устойчивой к ингибированию ADP, синтезирует больше рибофлавина, чем штамм с повышенной экспрессией PRPP-синтетазы дикого типа (патент США 6878536 (2005)). Однако в настоящее время нет сообщений, описывающих мутантную PRPP-синтетазу из бактерии рода Bacillus, устойчивую к ингибированию пуриновыми нуклеотидами по типу обратной связи, и использование такой мутантной PRPP-синтетазы для улучшения продукции нуклеозида с использованием микроорганизма - продуцента пуринового нуклеозида, принадлежащего к роду Bacillus, в частности Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens. Более того, последовательность гена prs Bacillus amyloliquefaciens К никогда ранее не была опубликована.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является усовершенствование микроорганизма, предназначенного для продукции пуриновых нуклеозидов путем ферментации, и предоставление способа продукции пуриновых нуклеозидов с использованием полученных штаммов.

Эта цель была достигнута путем конструирования новой мутантной PRPP-синтетазы из Bacillus. С учетом большой степени консервативности белка PRPP-синтетазы (Eriksen Т. et al.. Nature Struct. Biol, v.7, No 4, pp.303-308 (2000)), сконструировали мутантные PRPP-синтетазы из В. subtilis и В. amyloliquefaciens с мутациями, соответствующими известным мутациям в ферменте человека. Было показано, что только некоторые мутации при введении в ген, кодирующий PRPP-синтетазу, приводят к увеличению продукции пуриновых нуклеозидов в штаммах-продуцентах пуриновых нуклеозидов. Таким образом было сделано настоящее изобретение.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию, принадлежащую к роду Bacillus, конкретно Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens, обладающую повышенной способностью к продукции пуриновых нуклеозидов.

Целью настоящего изобретения является предоставление мутантной бактериальной фосфорибозилпирофосфатсинтетазы (PRPP-синтетазы), отличающейся тем, что L-аминокислотный остаток, соответствующий положению 120, или 135, или 194 в последовательности PRPP-синтетазы дикого типа Bacillus subtilis, замещен остатком другой L-аминокислоты, и чувствительность фермента к ингибированию пуриновыми нуклеотидами по типу обратной связи снижена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше мутантной PRPP-синтетазы, отличающейся тем, что остаток аспарагина в положении 120 в последовательности PRPP-синтетазы дикого типа замещен остатком серина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше мутантной PRPP-синтетазы, отличающейся тем, что остаток лейцина в положении 135 в последовательности PRPP-синтетазы дикого типа замещен остатком изолейцина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше мутантной PRPP-синтетазы, отличающейся тем, что остаток аланина в положении 194 в последовательности PRPP-синтетазы дикого типа замещен остатком Валина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше мутантной PRPP-синтетазы, отличающейся тем, что PRPP-синтетазой дикого типа является PRPP-синтетаза из Bacillus subtilis или Bacillus amyloliquefaciens.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше мутантной PRPP-синтетазы, включающей делецию, замену, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или во множестве положений, отличных от положения 120, или 135, или 194, отличающейся тем, что ингибирование фермента пуриновыми нуклеотидами по типу обратной связи снижено.

Также целью настоящего изобретения является предоставление ДНК, кодирующую описанную выше мутантную PRPP-синтетазу.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, содержащей описанную выше ДНК и обладающей способностью к продукции пуриновых нуклеозидов.

Также целью настоящего изобретения является предоставление указанной бактерии, отличающейся тем, что указанной бактерией является Bacillus subtilis.

Также целью настоящего изобретения является предоставление указанной бактерии, отличающейся тем, что указанной бактерией является Bacillus amyloliquefaciens.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа продукции пуринового нуклеозида, включающего культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, приводящее к секреции указанного пуринового нуклеозида в указанную питательную среду, и выделение указанного пуринового нуклеозида из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что пуриновым нуклеозидом является инозин, ксантозин, гуанозин или аденозин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа продукции пуринового нуклеотида, включающего культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, приводящее к секреции указанного пуринового нуклеозида в указанную питательную среду, выделение указанного пуринового нуклеозида из культуральной жидкости, фосфорилирование указанного пуринового нуклеозида и выделение пуринового нуклеотида.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что пуриновым нуклеотидом является 5'-инозиновая кислота, ксантозин-5'-фосфат, 5'-гуаниловая кислота или 5'-адениловая кислота.

PRPP-синтетаза с заменой L-аминокислотного остатка, соответствующего положению 120, или 135, или 194 в последовательности PRPP-синтетазы дикого типа Bacillus может упоминаться как "мутантная PRPP-синтетаза", ДНК, кодирующая мутантную PRPP-синтетазу, может упоминаться как "мутантный ген prs" или "мутантный ген PRPP-синтетазы", а PRPP-синтетаза без замены может упоминаться как "PRPP-синтетаза дикого типа". Термин "мутантная PRPP-синтетаза" означает, что активность фермента благодаря мутациям, приводящим к замене аминокислотных остатков в положении 120, или 135, или 194, ингибируется пуриновыми нуклеотидами, в частности ADP, в меньшей степени, чем фермент штамма дикого типа.

Далее настоящее изобретение будет подробно описано.

1. Мутантная PRPP-синтетаза и мутантный ген prs согласно настоящему изобретению.

Известно, что повышенная активность PRPP-синтетазы человека является результатом нескольких мутаций соответствующего гена, приводящих к специфической замене аминокислотных остатков в зрелом ферменте: аспарагина на гистидин в положении 51, аспарагина на серии в положении 113, лейцина на изолейцин в положении 128, аланина на валин в положение 189. Такая мутантная PRPP-синтетаза устойчива к пуриновым нуклеотидам, ингибирующим нормальный фермент по механизму, неконкурентному в отношении АТР (Becker M.A. et al., J. Clin. Invest., 96: 2133-41 (1995)). С учетом большой степени консервативности гена prs (Eriksen Т. et al. Nature Struct. Biol, v.7, No 4, pp.303-308 (2000)), сконструировали мутантные PRPP-синтетазы Bacillus с мутациями D58H, N120S, L135I или A194V, соответсвующими мутациям N51H, N113S, L128I или A189V в ферменте человека. Такие мутации неизвестны для Bacillus PRPP-синтетаз. Термин "PRPP-синтетаза из Bacillus" означает PRPP-синтетазу бактерий, принадлежащих к роду Bacillus. Предпочтительны виды В. subtilis или В. amyloliquefaciens.

Мутантную PRPP-синтетазу получали с учетом известных последовательностей путем введения мутаций в ген prs дикого типа с использованием общепринятых методов. В качестве гена prs дикого типа могут быть упомянуты ген prs из В. subtilis (нуклеотиды с 57743 по 58696 в последовательности с инвентарным номером NC_000964 в базе данных GenBank; SEQ ID NO: 1) или ген prs из В. amyloliquefaciens К (SEQ ID NO: 3). Ген pr В. subtilis расположен между ORF gcaD и ORF ctc на хромосоме штамма В. subtilis 168. Следовательно, ген prs можно получить методом ПЦР (White, T.J. et al. Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, сконструированных на основании нуклеотидной последовательности гена. Ген, кодирующий PRPP-синтетазу В. amyloliquefaciens К (SEQ ID NO: 1), можно получить сходным образом.

Мутантная PRPP-синтетаза может включать делению, замену, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в одном или во множестве положений, отличных от положения 120, или 135, или 194, при условии, что активность PRPP-синтетазы не нарушена. Термин "активность PRPP-синтетазы" означает активность катализа реакции образования 5-фосфорибозил-α-1-пирофосфата (PRPP) из рибозо-5-фосфата и АТР с образованием AMP. Активность PRPP-синтетазы в экстрактах и степень ингибирования фермента ADP можно измерить с использованием частично модифицированного метода К. F. Jensen et al. (Analytical Biochemistry, 98, 254-263 (1979)). Конкретно, в качестве субстрата можно использовать [α-³²P]ATP и следует определять образующийся в реакции [³²P]AMP.

Количество "несколько" аминокислот различается в зависимости от положения или типа аминокислотных остатков в третичной структуре белка. Это связано со следующими причинами. А именно, некоторые аминокислоты имеют высокую степень гомологии друг с другом и поэтому такие изменения не очень влияют на третичную структуру белка. Следовательно, мутантная PRPP-синтетаза настоящего изобретения может быть ферментом с гомологией не менее 30-50%, предпочтительно 50-70% по отношению к полной аминокислотной последовательности основной PRPP-синтетазы, обладающим активностью PRPP-синтетазы.

В настоящем изобретении "L-аминокислотный остаток, соответствующий положению 120, или 135, или 194” означает аминокислотный остаток, соответствующий положению 120, или 135, или 194 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

Для определения L-аминокислотного остатка, соответствующего мутациям N51H, N113S, L128I или A189V PRPP-синтетазы человека, необходимо выполнить выравнивание аминокислотной последовательности PRPP-синтетазы человека и аминокислотной последовательности, представляющей интерес PRPP-синтетазы из бактерии рода Bacillus, и определить в представляющей интерес бактериальной PRPP-синтетазе L-аминокислотные остатки, соответствующие номерам 51, 113, 128 или 189 в аминокислотной последовательности PRPP-синтетазы человека.

Замена, деления, вставка или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков должны быть консервативными мутациями с тем, чтобы сохранялась активность фермента. Консервативные замены являются типичными консервативными мутациями. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gln, His или Lys, замену Asn на Glu, Gin, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gin, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Туr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Ile или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu.

ДНК, кодирующая по существу такой же белок, как описанные выше мутантные PRPP-синтетазы, получают, например, путем модификации нуклеотидной последовательности, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте предполагают делецию, замену, вставку или добавление. ДНК, модифицированную, как описано выше, получают традиционными известными методами мутагенеза. Мутагенная обработка включает метод обработки ДНК, содержащей мутантный ген prs, in vitro, например, гидроксиламином, и метод обработки микроорганизма, например, бактерии с мутантным геном prs, принадлежащей к роду Bacillus, ультрафиолетовым облучением или мутагеном, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) и азотистая кислота, используемые обычно для такой обработки. Замена, делеция, вставка или добавление нуклеотида как описано выше также включают природные мутации (мутант или вариант), обусловленные индивидуальными различиями или различиями между видами или родами бактерий, содержащих PRPP-синтетазу.

ДНК, кодирующую по существу такой же белок, как мутантная PRPP-синтетаза, можно получить путем выделения ДНК, гибридизующейся в жестких условиях с ДНК, имеющей последовательность известного гена prs, или с ее частью в качестве зонда, и кодирующей белок с активностью PRPP-синтетазы, из подвергшихся мутагенной обработке клеток с мутантной PRPP-синтетазой.

«Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды образуются, а неспецифические гибриды не образуются. Точно определить эти условия с использованием числовых величин трудно. Однако жесткие условия включают, например, условия, при которых ДНК с высокой степенью гомологии, например, ДНК с гомологией не менее 50%, гибридизуются друг с другом, а ДНК с более низкой гомологией не гибридизуются друг с другом.

Для оценки степени гомологии белков или ДНК можно использовать такие методы расчета как BLAST исследование, FASTA исследование и CrustalW.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - эвристический поисковый алгоритм, используемый программами blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn и tblastx; эти программы приписывают значения показателям с использованием статистических методов Karlin, Samuel и Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7). FASTA метод описан W.R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990, 183: 63-98). Clustal W метод описан Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680).

С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом при концентрации соли, соответствующей обычным условиям отмывки при гибрицизации по Саузерну, т.е., 60°С, 1 × SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1 × SSC, 0.1% SDS. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном prs, также можно использовать часть последовательности SEQ ID NO: 1. Такой зонд можно приготовить методом ПЦР с использованием олигонуклеотидов, сконструированных на основании нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, в качестве праймеров и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, в качестве матрицы. Когда в качестве зонда используют фрагмент ДНК длиной около 300 п.н., условия отмывки для гибридизации включают, например, 50°С, 2 × SSC и 0.1% SDS. Продолжительность отмывки зависит от типа мембраны, используемой для блоттинга, и, как правило, рекомендуется производителем. Например, рекомендованная продолжительность отмывки мембраны Hybond™ N+nylon (Amersham) в жестких условиях - 15 минут.

Ген, гибридизующийся в жестких условиях как описано выше, включает гены со стоп-кодоном, образовавшимся внутри кодирующей области, и кодирующие неактивный из-за мутации в активном центре белок. Однако такое затруднение легко можно устранить путем лигирования гена с коммерческим экспрессионным вектором и исследования экспрессированного белка на активность PRPP-синтетазы.

2. Бактерия настоящего изобретения

Бактерия настоящего изобретения - это бактерия-продуцент пуринового нуклеозида, содержащая ДНК, кодирующую мутантную PRPP-синтетазу согласно настоящему изобретению. Более конкретно, бактерия согласно настоящему изобретению содержит ДНК с мутантным геном prs, экспрессирующимся на хромосоме или плазмиде в бактерии, и обладает повышенной способностью к продукции пуриновых нуклеозидов.

Бактерия настоящего изобретения - это бактерия, принадлежащая к роду Bacillus.

Примеры микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают Bacillus subtilis subsp. subtilis strain 168 (В.subtilis 168) или Bacillus amyloliquefaciens (В. amyloliquefaciens). В. amyloliquefaciens - довольно гетерогенные виды. Известен ряд штаммов В. amyloliquefaciens: SB, Т, Р, W, F, N, К и Н (Welker N.E., Campbell L.L., Unrelatedness of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis. J. Bacteriol, 94: 1124-1130, 1967). Недавно из растений выделили штаммы Bacillus, которые можно рассматривать как отдельный экотип В. amyloliquefaciens (Reva et al., Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Ecol., 48: 249-259, 2004). Определена нуклеотидная последовательность одного из штаммов, В. amyloliquefaciens FZB42 (Chen et al., Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat. Biotechnol., 25: 1007-1014, 2007).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, также включают следующие виды: Bacillus licheniformis. Bacillus pumilis. Bacillus megaterium. Bacillus brevis. Bacillus polymixa, Bacillus stearothermophilus.

Кроме уже упомянутых свойств, бактерии настоящего изобретения могут обладать другими характерными свойствами, такими как потребность в различных питательных веществах, устойчивость к антибиотику, чувствительность к антибиотику, что не выходит за рамки настоящего изобретения.

Фраза "пуриновый нуклеозид", как она используется здесь, включает инозин, ксантозин, гуанозин и аденозин, предпочтительно, инозин.

Фраза "способность к продукции пуринового нуклеозида", используемая здесь, означает способность синтезировать и накапливать пуриновый нуклеозид в питательной среде. Фраза "бактерия способна к продукции пуринового нуклеозида" означает, что бактерия, принадлежащая к роду Bacillus, способна синтезировать и накапливать в среде пурины, такие как пуриновые нуклеозиды, в количестве, большем по сравнению со штаммом В. subtilis дикого типа, таким как В. subtil is 168. Предпочтительно эта фраза означает, что микроорганизм способен синтезировать и накапливать в питательной среде не менее 10 мг/л, более предпочтительно не менее 50 мг/л инозина, ксантозина, гуанозина или/и аденозина.

Трансформация бактерии ДНК, кодирующей белок, означает введение ДНК в клетку бактерии, например, традиционными методами для введения мутации настоящего изобретения в ген, кодирующий PRPP-синтетазу. Обычно для такого введения необходимо клонирование гена в векторе, способном функционировать в бактерии, принадлежащей к роду Bacillus. Для этих целей можно использовать челночные векторы: pH Y300PLK, pMWMXl, pLF22, pKSl. Замена гена дикого типа мутантным геном происходит благодаря гомологичной рекомбинации.

Методы приготовления хромосомной ДНК, гибридизации, ПЦР, приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) и т.п.

Ген, кодирующий белок PRPP-синтетазу Bacillus amyloliquefaciens К, ген prsBA, секвенирован авторами настоящего изобретения (SEQ ID NO: 3). Последовательность гена, кодирующего белок PRPP-синтетазу из Bacillus subtilis, ген prs Bacillus subtilis subsp.subtilis штамм 168, известна (нуклеотиды с 57743 по 58696 в последовательности с инвентарным номером NC_000964 в базе данных GenBank; (SEQ ID NO: 1)). Ген prs Bacillus subtilis локализован на хромосоме между генами gcaD и ctc в районе 7°. Следовательно, указанные гены prs можно получить методом ПЦР (polymerase chain reaction; refer to White, T.J. et al. Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, сконструированных на основе нуклеотидной последовательности гена. Гены, кодирующие белок PRPP-синтетазу других микроорганизмов, можно получить сходным образом (см. Пример 3).

Примеры гена prs Bacillus subtilis также включают ДНК, кодирующую белок PRPP-синтетазу с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2, и/или белок с аминокислотной последовательностью, включающей делецию, замену, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

Примеры гена prs Bacillus amyloliquefaciens К также включают ДНК, кодирующую белок PRPP-синтетазу с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, и/или белок с аминокислотной последовательностью, включающей делецию, замену, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4.

Бактерия настоящего изобретения может быть получена путем введения вышеупомянутых ДНК в бактерию, изначально способную к продукции пуринового нуклеозида. С другой стороны, бактерия настоящего изобретения может быть получена путем придания способности к продукции пуринового нуклеозида бактерии, содержащей вышеупомянутые ДНК.

Пример родительского штамма, принадлежащего к роду Bacillus, который может быть использован в настоящем изобретении, - это штамм-продуцент инозина В, subtilis KMBS375. (KMBS375: Ppur*-Δatt ΔpurA ΔpurR ΔpupG ΔdeoD guaB24; см. Справочный пример). Другие родительские штаммы, принадлежащие к роду Bacillus, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают штамм В. subtilis AJ 12707 (FERM P-12951) (патентная заявка Японии JP 6113876A2), штамм В. subtilis AJ3772 (FERM Р-2555) (патентная заявка Японии JP 62014794A2), Bacillus pumilus NA-1102 (FERM BP-289), Bacillus subtilis NA-6011 (FERM BP-291), Bacillus subtilis G1136A (ATCC No. 19222) (патент США 3575809), реидентифицированный как Bacillus amyloliquefaciens AJ 1991, депонированный 3 октября 2005 г. в ВКПМ как Bacillus amyloliquefaciens G1136A (VKPM B-8994), 13 октября 2006 г. было осуществлено международное депонирование штамма, Bacillus subtilis NA-6012 (FERM BP-292) (патент США 4701413), В. pumilis Gottheil No.3218 (ATCC No. 21005) (патент США 3616206), штамм В. amyloliquefaciens AS115-7 (VKPM B-6134) (патент РФ 2003678) и подобные им. Также может использоваться штамм В. subtilis KMBS16. Этот штамм является производным известного штамма В. subtilis 168 trpC2 с мутациями, введенными в ген purR, кодирующий репрессор пурина (purR::spc), ген рurА, кодирующий сукцинил-АМФ-синтазу (рurА::erm) и ген deoD, кодирующий пуриннуклеозидфосфорилазу (deoD::kan) (патентная заявка РФ 2002103333, патент США 7326546, 2008).

Бактерия настоящего изобретения может быть дополнительно улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез пурина. Примеры таких генов включают onepohpur из В. subtilis (Ebbole D.J. and Zalkin H.J. Biol. Chem., 262: 8274-87 (1987), Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002). Описан штамм-продуцент инозина В. subtilis с модифицированной регуляторной областью оперона риг (патент США 7326546, 2008).

3. Способ продукции нуклеозидов

Способ настоящего изобретения включает способ продукции нуклеозида, такого как инозин и/или гуанозин, включающий стадии культивирования бактерии настоящего изобретения в питательной среде для продукции и накапливания нуклеозида в среде и выделение нуклеозида из культуральной жидкости.

В настоящем изобретении культивирование бактерии, выделение нуклеозидов из культуральной жидкости и его очистка и т.п. может быть осуществлено способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых с использованием микроорганизма получают нуклеозид. Питательная среда для продукции пуринового нуклеозида может быть обычной средой, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические ионы, органические компоненты и другие необходимые компоненты. В качестве источника углерода можно использовать сахариды, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трегалоза, рибоза и гидролизаты крахмала; спирты, такие как глицерин, маннитол и сорбитол; органические кислоты, такие как глюконовая кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота, янтарная кислота и т.п. В качестве источника азота можно использовать неорганические аммонийные соли, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония; органический азот, такой как гидролизаты соевых бобов; аммиачный газ; водный раствор аммиака и т.д. Желательно, чтобы витамины, такие как витамин B₁, необходимые вещества, например, органические добавки, такие как нуклеиновые кислоты, аденин и РНК, или дрожжевой экстракт и т.п. могли присутствовать в соответствующих или даже в минимальных количествах. Кроме того, при необходимости могут быть добавлены малые количества фосфата кальция, сульфата магния, ионы железа, ионы марганца и т.п.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях в течение 16-72 часов, поддерживают температуру культивирования 30-45°С, рН 5-8. рН можно регулировать с использованием неорганических или органических кислых или щелочных веществ, таких как аммиачный газ.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевой пуриновый нуклеозид может быть выделен из культуральной жидкости и очищен с использованием любой комбинации традиционных методов, таких как ионообменная хроматография и осаждение.

4. Способ продукции пуриновых нуклеотидов

Способ настоящего изобретения включает способ продукции пуриновых нуклеотидов, включающий стадии выращивания бактерии настоящего изобретения в питательной среде, приводящего к секреции бактерией пуринового нуклеозида в питательную среду, фосфорилирования полученного пуринового нуклеозида и выделения пуринового нуклеотида. Кроме того, способ настоящего изобретения включает способ продукции 5'-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии настоящего изобретения в питательной среде, приводящего к секреции инозина в питательную среду, фосфорилирования инозина и выделения 5'-инозиновой кислоты. Кроме того, способ настоящего изобретения включает способ продукции 5'-ксантиловой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии настоящего изобретения в питательной среде, приводящего к секреции ксантозина в питательную среду, фосфорилирования инозина и выделения 5'-ксантиловой кислоты. Кроме того, способ настоящего изобретения включает способ продукции 5'-гуаниловой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии настоящего изобретения в питательной среде, приводящего к секреции гуанозина в питательную среду, фосфорилирования гуанозина и выделения 5'-гуаниловой кислоты. Способ настоящего изобретения включает и способ продукции 5'-гуаниловой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии настоящего изобретения в питательной среде, позволяющего секрецию ксантозина в питательную среду, фосфорилирования ксантозина, аминирования 5'-ксантиловой кислоты и выделения 5'-гуаниловой кислоты.

В настоящем изобретении выращивание бактерии, выделение инозина из питательной среды и очистка и т.п. могут быть осуществлены сходным образом с традиционными способами ферментации, при которых получают инозин с использованием микроорганизма. Кроме того, в настоящем изобретении стадии фосфорилирования инозина и выделения 5'-инозиновой кислоты могут быть осуществлены традиционными способами ферментации, при которых пуриновый нуклеотид, такой как 5'-инозиновая кислота, образуется из пуринового нуклеозида, такого как инозин.

Фосфорилирование пуринового нуклеозида может быть ферментативным, с использованием различных фосфатаз, нуклеозидкиназ или нуклеозидфосфотрансфераз, или химическим, с использованием фосфорилирующих агентов, таких как POCl₃ и т.п. Можно использовать фосфатазу, способную катализировать С-5'-селективный перенос фосфорильной группы пирофосфата к нуклеозидам (Mihara et. al., Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol., 66: 2811-2816 (2000)), или кислую фосфатазу, использующую в качестве донора фосфорной кислоты полифосфорную кислоту (соли), фенилфосфорную кислоту (соли) или карбамилфосфорную кислоту (соли) (WO 9637603 A1), или подобные им. Также в качестве примера фосфатазы можно использовать фосфатазу, катализирующую перенос фосфорильной группы на С-2', 3' или 5' нуклеотида с использованием в качестве субстрата п-нитрофенилфосфата (Mitsugi, К., et al., Agric. Biol. Chem., 28, 586-600 (1964)), неорганического фосфата (выложенная патентная заявка Японии No. JP 42-1186) или ацетилфосфата (выложенная патентная заявка Японии No. JP 61-41555), или подобные ей. В качестве примера нуклеозидкиназы можно использовать нуклеозидкиназу, гуанозин/инозинкиназу Е. coli (Mori, H. et al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 177: 4921-4926 (1995); WO 9108286) или подобные им. В качестве примера нуклеозидфосфотрансферазы можно использовать нуклеозидфосфотрансферазу, описанную Hammer-Jespersen, К. (Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen (ed.). Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York) или подобные им. Химическое фосфорилирование можно провести с использованием таких агентов как POCl₃ (Yoshikawa, К. et. al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 42:3505-3508 (1969)) или подобных.

Аминирование 5'-ксантиловой кислоты может быть ферментативным с использованием, например, ГМФ-синтетеазы Е. coli (Fujio et. al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1997. 61: 840-845; EP 0251489 B1).

Краткое описание рисунков

На Фигуре 1 изображено выравнивание последовательностей PRPP-синтетазы: Hum, изофермент I человека; Bs, Bacillus subtilis; Ba_K, Bacillus amyloliquefaciens, штамм К; Ba_FZB42, Bacillus amyloliquefaciens FZB42 _FZB42. Аминокислоты в ферменте человека, которые заменяются другими аминокислотами для придания ферменту устойчивости к ингибированию ADP и GDP, выделены жирным шрифтом. Соответствующие аминокислоты фермента Bacillus также выделены жирным шрифтом. На Фигуре 2 изображена организация плазмиды pKSl-PRSBS.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Клонирование гена prs дикого типа из В. subtilis и конструирование мутантных генов.

Полная нуклеотидная последовательность штамма В. subtilis 168 определена (F. Kunst, N. Ogasawara, I. Moszer, et al., The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature 390: 249-256 (1997)). На основании опубликованной нуклеотидной последовательности синтезировали праймеры 1 (SEQ ID NO. 5) и 2 (SEQ ID NO. 6) для амплификаци гена prs. С использованием этих праймеров и геномной ДНК B. subtilis 168 в качестве матрицы амплифицировали ген prs В. subtilis (prsBS) с прилегающими областями. Полученный фрагмент величиной 1.8 т.п.н. обрабатывали рестриктазами SalI и Ecl136I и клонировали в термочувствительном низкокопийном челночном векторе pKS, обработанном SalI и SmaI (Shatalin K.Y. and Neyfakh A.A., FEMS Microbiology Letters, 245: 315-9 (2005)), получив плазмиду pKSl-PRSBS. Затем содержащийся на этой плазмиде ген prsBS подвергли мутагенезу методом QuikChange сайт-направленного мутагенеза (Stratagene). Для этого использовали праймеры 3 (SEQ ID NO.7) и 4 (SEQ ID NO.8) для введения мутации N120S и праймеры 5 (SEQ ID NO.9) и 6 (SEQ ID NO.10) для введения мутации A194V и плазмиду pKSl-PRSBS в качестве матрицы. В результате получили плазмиды pKSl-PRSBS 120 и pKSl-PRSBS 194, содержащие prs_BSN120S или prs_BSA194V соответственно, и подтвердили наличие интересующих мутаций путем секвенирования.

Пример 2. Влияние мутаций prs_BSN120S или prs_BSA194V на продукцию инозина штаммом-продуцентом инозина В. subtilis

Плазмиды pKSl-PRSBS 120 и pKSl-PRSBS 194, содержащие prs_BSN120S или prs_BSA194V, методом трансформации вводили в штамм-продуцент инозина В. subtilis KMBS375, после чего prsBS штамма замещался prs_BSN120S или prs_BSA194V. Интеграцию мутантного гена в хромосому KMBS375 осуществляли с использованием метода, описанного для инактивации гена в В. anthracis (Shatalin and Neyfakh, FEMS Microbiology Letters, 2005) с модификациями, которые дали возможность ввести интересующие мутации (включая точечные мутации) в хромосому без селекции. Данный метод включает следующие стадии.

1) Введение полученной плазмиды методом трансформации в штамм Bacillus, отбор клонов с плазмидой при 30°С на LA (пептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 3 г/л, агар 18 г/л) с 10 мкг/мл эритромицина.

2) Выращивание трансформированного плазмидой штамма на среде LB (без эритромицина) с аэрацией при 37°С в течение ночи и рассев культуры на LB агар с 10 мкг/мл эритромицина. Около 100% устойчивых к эритромицину клеток такой ночной культуры содержат плазмиду, интегрированную в хромосому в результате единичного кроссинговера. Следовательно, полученные клоны содержат в хромосоме два аллеля интересующего гена: ген дикого типа и мутантный.

3) Выращивание отдельных клонов, содержащих интегрированную плазмиду на среде LB без эритромицина с аэрацией в течение 48 часов при 30°С. Высевали полученную культуру на чашки LA (без эритромицина) и выр