Растения томатов, имеющие более высокие уровни устойчивости к botrytis

Растения томатов, имеющие более высокие уровни устойчивости к botrytis

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к селекции растений и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу обнаружения локуса количественного признака (QTL), связанного с устойчивостью к Botrytis cinerea у томата, к способу получения растений томата, устойчивых к Botrytis, а также к полученным таким способом растениям томата и их частям, устойчивым к Botrytis.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Botrytis cinerea представляет собой некротрофный патогенный гриб с исключительно широким диапазоном организмов-хозяев, содержащим по меньшей мере 235 возможных организмов-хозяев. Из-за такого широкого диапазона организмов-хозяев и из-за его влияния на экономически важные части растений B. cinerea является основной проблемой для многих сельскохозяйственных культур, выращиваемых для коммерческих целей. Среди производителей указанный гриб обычно называется Botrytis. Культурный томат (преимущественно Lycopersicon esculentum) также восприимчив к инфекции Botrytis, причем гриб в основном поражает стебель, листья и плоды растения томата. В обогреваемых парниках возникновение инфекций Botrytis на стеблях особенно распространено.

Botrytis интенсивно убивает зараженные клетки, вызывая мягкую гниль, увядание, пятнистость листьев, черную ножку и рак стебля. Пораженные листья покрываются конидиофорами и конидиями и впоследствии разрушаются и увядают. Гриб прорастает из больных листьев в стебель и вызывает сухие светло-коричневые поражения длиной от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров. Поражения также могут образовываться при обрезке рубцов на стебле. Указанные поражения стебля также могут быть покрыты серой гнилью. В тяжелых случаях инфекция опоясывает стебель и убивает растение. Более старая, увядающая ткань растения томата обычно более восприимчива к поражению Botrytis, чем молодая ткань.

Для предотвращения развития Botrytis в парнике, где выращивают томаты, следует внимательно контролировать температуру и относительную влажность. Также важно подавать воду без увлажнения листьев. На полях, где выращивают растения, должен быть обеспечен хороший дренаж и контроль над сорняками. Кроме того, уровни питательных веществ растений должны сохраняться высокими. Тем не менее, эти профилактические меры не могут полностью предотвратить значительную потерю урожая в случае возникновения инфекции.

Для контроля Botrytis и в оранжерее, и на полях, где выращивают томаты, имеются фунгициды. В качестве примеров некоторых фунгицидов можно привести Dowicide А® и хлорталонил, которые также можно использовать для плодов томатов после сбора урожая. Однако у Botrytis, как известно, развивается устойчивость к некоторым обычно используемым фунгицидам. Кроме того, использование фунгицидов является нежелательным как с экономической, так и с экологической точки зрения. В настоящее время существует потребность в коммерческих сортах томатов, которые проявляют устойчивость к Botrytis.

Частичная устойчивость к Botrytis была обнаружена у нескольких диких видов Lycopersicon (Egashira et al. 2000; Nicot et al. 2002; Urbasch 1986). Однако эти растения не дают коммерческих культур томатов.

Из WO 02/085105 известно, что L. hirsutum содержит генетическую область в 10-й хромосоме генома, которая связана с частичной устойчивостью к Botrytis. Интрогрессия этого генетического материала в культурные сорта томатов, вероятно, будет способствовать получению культурных растений томата, частично устойчивых к Botrytis.

На настоящий момент, однако, программы селекции, направленные на обеспечение устойчивости к Botrytis у томатов, имели ограниченный успех. Причина таких плохих результатов на настоящий момент не ясна. С одной стороны, это может быть связано с недостаточным знанием генетической основы и наследования устойчивости к Botrytis. С другой стороны, это может быть связано с отсутствием подходящих биоанализов для оценки уровней устойчивости к Botrytis у томатов, полученных в программах селекции. Отсутствие знаний и методов также усложняет селекцию растений как среди диких образцов, так и среди потомства, содержащего гены, связанные с устойчивостью к Botrytis.

Цель настоящего изобретения состоит в повышении успеха программ скрещивания, направленных на получение коммерческих сортов томатов, устойчивых к Botrytis. Другой целью настоящего изобретения является получение дополнительной и/или улучшенной устойчивости к Botrytis у коммерческих сортов томата. Еще одна цель настоящего изобретения состоит в создании способа обнаружения дополнительных диких образцов Lycopersicon в качестве источников устойчивости к Botrytis и в нахождении дополнительного генетического материала в геноме таких растений, который связан с устойчивостью томатов к Botrytis. Такие дополнительные источники и дополнительный генетический материал можно использовать для расширения основы для получения устойчивых к Botrytis сортов культурного томата.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что специфический количественный биоанализ, который заключается в измерении начальных и/или прогрессирующих параметров инфекции Botrytis у растений томата в сочетании со способом обнаружения молекулярного маркера, обеспечивает очень эффективный способ обнаружения источников устойчивости к Botrytis среди диких образцов Lycopersicon и способ обнаружения генетического материала в геноме таких растений, который связан с повышением устойчивости томатов к Botrytis.

При использовании указанной комбинации способов авторы настоящего изобретения успешно идентифицировали частичную устойчивость к Botrytis в двух линиях диких родственников томата, т.е. Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 и Lycopersicon parviflorum G1.1601.

Авторы смогли впоследствии получить Botrytis-устойчивые растения томата, скрещивая растения указанных Botrytis-устойчивых диких (донорных) линий томата с неустойчивыми реципиентными растениями томата. Было показано, что эти растения обладают более высоким уровнем устойчивости, чем растения, содержащие геномную область в 10-й хромосоме L. hirsutum, связанную с устойчивостью к Botrytis, как описано в WO 02/085105.

Оценивая уровень устойчивости к Botrytis в изолированных популяциях (популяции F₂) этих недавно полученных гибридов в отношении присутствия молекулярных маркеров растения донора, авторы настоящего изобретения смогли идентифицировать множественные локусы количественного признака (QTL), связанные с Botrytis-устойчивостью в устойчивых линиях диких томатов, и смогли таким образом установить расположение в геноме множественных последовательностей ДНК, придающих устойчивость. В результате авторы настоящего изобретения установили, что устойчивость к Botrytis у томатов наследуется полигенетически, что может частично объяснить плохие результаты скрещивания. На основании этого открытия были усовершенствованы способы получения Botrytis-устойчивых растений томата. В последующем описании локус количественного признака (QTL), связанный с устойчивостью к Botrytis у томатов, сокращен до "QTL Botrytis-устойчивости" или "QTL, связанный с Botrytis-устойчивостью".

В общей сложности шесть новых QTL Botrytis-устойчивости были обнаружены в двух линиях диких томатов. Четыре из указанных шести QTL могли быть связаны с количественным параметром, который отражает способность растения к снижению начального распространения инфекции, называемым далее "параметр частоты возникновения заболевания". Два из этих шести QTL могли быть связаны с количественным параметром, который отражает способность растения к замедлению развития инфекции, называемым далее "параметр темпа роста повреждений".

При составлении карт генетического сцепления было обнаружено, что хромосома 1 L. hirsutum LYC 4/78 несет QTL, который связан со снижением скорости роста повреждений, вызванных инфекцией Botrytis, и что обе хромосомы 2 и 4 из того же самого указанного образца несут QTL, который связан с пониженной заболеваемостью. В L. parviflorum G1.1601 QTL, ответственный за снижение скорости роста повреждений, как было установлено, расположен на хромосоме 9, в то время как два отдельных QTL, отвечающих за пониженную заболеваемость, как было найдено, расположены на хромосомах 3 и 4. QTL в хромосоме 10, как сообщалось в предшествующем уровне техники, не мог быть обнаружен этим способом. При использовании вышеуказанного количественного биоанализа все QTL L. hirsutum LYC 4/78, протестированные до настоящего времени, могут быть подтверждены в оценке сопротивления болезни в BC₂S₁ (обратное скрещивание 2, сами с собой) потомства, расщепляющихся на QTL при исследовании.

Настоящее изобретение относится в первом аспекте к растению томата, устойчивому к Botrytis, где указанное растение обладает восприимчивостью к Botrytis cinerea, которая по меньшей мере в 3 раза ниже, чем у контрольного растения, при измерении биоанализом, где средняя длина повреждений стебля, вызванных инфекцией Botrytis cinerea у взрослых растений, измерена в течение трехнедельного периода при стандартных условиях опыта. Длина повреждений стебля в течение трех недель, используемых в настоящем описании как критерий уровня устойчивости, должна быть определена стандартными условиями опыта, как описано в настоящем описании. В предпочтительном варианте осуществления указанное растение, представляющее собой Botrytis-устойчивый томат, характеризуется тем, что содержит в своем геноме по меньшей мере один QTL или его участок, ответственный за устойчивость к Botrytis, выбранный из группы, состоящей из QTL на хромосомах 1, 2 и 4 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 и QTL на хромосомах 3, 4 и 9 Lycopersicon parviflorum G1.1601, связанных с устойчивостью к Botrytis, и где указанный QTL или его часть, ответственная за устойчивость к Botrytis, отсутствует в естественном генетическом фоне.

Настоящее изобретение относится в другом аспекте к способу обнаружения локуса количественного признака (QTL), связанного с устойчивостью к Botrytis у растений томата. В способе предусмотрены стадии скрещивания донорного Botrytis-устойчивого растения томата с неустойчивым или частично устойчивым (Botrytis-восприимчивым) реципиентным растением томата; контакт одного или нескольких растений потомства с инфекционной дозой Botrytis; количественное определение заболеваемости и/или скорости роста повреждений у одного или нескольких указанных растений потомства; создание карты генетического сцепления, которая связывает наблюдаемую заболеваемость и/или скорость роста повреждений с присутствием хромосомных маркеров указанного донорного растения томата у одного или нескольких указанных растений потомства; а также назначение в качестве локуса количественного признака смежных маркеров на указанной карте, которые связаны с пониженной заболеваемостью и/или уменьшенной скоростью роста повреждений.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к QTL, которые получают способом обнаружения QTL Botrytis-устойчивости по настоящему изобретению, как описано выше. Эти QTL отличаются от QTL предшествующего уровня техники. Во-первых, в предшествующем уровне техники QTL не может быть обнаружен. Кроме того, QTL по настоящему изобретению более информативны, чем QTL предыдущего уровня техники, поскольку они являются показателями либо характеристики, касающейся способности растения противостоять началу болезни, либо характеристики, связанной со способностью растения замедлить развитие болезни. Такая информация является очень ценной для программ селекции, так как их сочетания могут надлежащим образом обеспечить более высокую устойчивость и лучший контроль за правильным наследованием признака устойчивости от одного поколения к другому.

Настоящее изобретение дополнительно относится к QTL Botrytis-устойчивости у растений томата, где указанный QTL выбран из группы, состоящей из QTL на хромосомах 1, 2 и 4 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 и QTL на хромосомах 3, 4 и 9 Lycopersicon parviflorum G1.1601, связанных с устойчивостью к Botrytis. Эти QTL расположены в положениях генома, которые ранее не были связанны с устойчивостью к Botrytis. Более подробно эти QTL описаны ниже.

Аллели, присутствующие в положениях генома, обозначенные этими QTL, представляют собой один из аспектов настоящего изобретения.

QTL по настоящему изобретению может быть в форме выделенной, предпочтительно, двунитевой последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей указанный QTL или его часть, вызывающую устойчивость. Очень удобно, что размер последовательности нуклеиновой кислоты, которая может, например, быть выделена из хромосомы подходящего донорного растения, может иметь генетическое расстояние, равное 1-100 сМ (сантиморган), предпочтительно, 10-50 сМ на указанной хромосоме. Указанная нуклеиновая кислота может содержать по меньшей мере 50, более предпочтительно, по меньшей мере 500 или, еще более предпочтительно, по меньшей мере 1000, однако, еще более предпочтительно, по меньшей мере 5000 пар оснований. Одна или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, содержащих QTL или его часть, придающую устойчивость, по настоящему изобретению могут в свою очередь быть включены в конструкцию нуклеиновой кислоты, причем указанная конструкция может дополнительно содержать области, которые фланкируют указанные одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, и области, которые способны к интеграции в подходящий вектор для переноса указанной одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот в подходящее восприимчивое к Botrytis реципиентное растение томата. Вектор может дополнительно содержать подходящие промоторные области или другие регуляторные последовательности. QTL может также находиться в форме, присутствующей в геноме растения томата. QTL по настоящему изобретению, предпочтительно, содержит по меньшей мере один маркер, предпочтительно, два, более предпочтительно, три, еще более предпочтительно, четыре и, еще более предпочтительно, более четырех маркеров, которые связанны с Botrytis-устойчивостью, и выбраны из группы, состоящей из маркеров, перечисленных в таблицах 1 и 2, а также маркеров, показанных на фиг.1, 5 и 6, связанных с указанным QTL.

Настоящее изобретение относится в другом аспекте к способу обнаружения QTL Botrytis-устойчивости, в котором предусмотрено обнаружение по меньшей мере одного маркера, выбранного из группы, состоящей из маркеров, перечисленных в таблицах 1 и 2, и маркеров, показанных на фиг.1, 5 и 6, связанных с указанным QTL Botrytis-устойчивости в предположительно устойчивом к Botrytis растении томата.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу создания Botrytis-устойчивого растения томата. В указанном способе предусмотрена стадия обнаружения QTL Botrytis-устойчивости в Botrytis-устойчивом донорном растении томата путем применения любого из способов обнаружения локуса количественного признака (QTL) Botrytis-устойчивости по настоящему изобретению, а также стадия переноса нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один QTL, обнаруженный указанным способом, или его часть, ответственную за устойчивость к Botrytis, из указанного растения-донора в Botrytis-восприимчивое реципиентное растение томата.

Для получения дочерних растений перенос нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один QTL или его часть, ответственную за устойчивость к Botrytis, удобно осуществлять путем скрещивания указанного Botrytis-устойчивого донорного растения томата с Botrytis-восприимчивым реципиентным растением томата; и отбора из числа дочерних растений растения, которое содержит в своем геноме нуклеиновую кислоту, интрогрессированную от указанного донорного растения томата, где указанная интрогрессированная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один QTL Botrytis-устойчивости по настоящему изобретению или его часть, ответственную за устойчивость к Botrytis. Наличие в указанной интрогрессированной нуклеиновой кислоте по меньшей мере одного QTL Botrytis-устойчивости по настоящему изобретению или его части, ответственной за устойчивость к Botrytis, может соответственно быть обнаружено способом по настоящему изобретению, в котором обнаруживают по меньшей мере один маркер, выбранный из группы, состоящей из маркеров, перечисленных в таблицах 1 и 2, и маркеров, показанных на фиг.1, 5 и 6, связанных с указанным QTL Botrytis-устойчивости.

Таким образом, в предпочтительном способе селекции предусмотрена маркер-опосредованная селекция (MAS) (см., например, Tanksley et al. 1998) указанной интрогрессированной ДНК, в которой один или несколько маркеров, связанных с указанным QTL, обнаружены в растениях потомства. MAS может, например, быть выполнен путем выделения генетического материала из указанных дочерних растений и определения в них наличия молекулярными методами одного или нескольких маркеров растения-донора. Альтернативно, молекулярные методы обнаружения маркера могут использоваться без предшествующего выделения генетического материала. Необязательно, кроме обнаружения маркера, может быть выполнен фенотипический тест на устойчивость к Botrytis, для отбора подходящего растения. Наиболее подходящий тест, таким образом, представляет собой количественный биоанализ, описанный в настоящем описании, посредством которого определяют такие параметры, как заболеваемость и/или скорость роста повреждений. Подтверждение наличия по меньшей мере одного маркера QTL Botrytis-устойчивости в комбинации с определением наличия устойчивого фенотипа обеспечивает подтверждение успешного переноса нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере один QTL или его часть, ответственную за устойчивость к Botrytis, от растения-донора к растению-реципиенту.

В альтернативном варианте осуществления способа получения устойчивого к Botrytis растения томата указанный перенос нуклеиновой кислоты может быть выполнен соответствующим способом трансгенными методами (например, трансформацией), слиянием протопластов, методом удвоения гаплоидов или изъятия эмбриона.

В предпочтительном варианте осуществления способа получения растения томата, устойчивого к Botrytis, растениями-донорами являются Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 и/или Lycopersicon parviflorum G1.1601, а нуклеиновая кислота, перенесенная из указанных растений-доноров в растения-реципиенты, предпочтительно содержит по меньшей мере один QTL Botrytis-устойчивости, выбранный из группы, состоящей из QTL на хромосомах 1 (QTL-1h), 2 (QTL-2h) и 4 (QTL-4h) Lycopersicon hirsutum LYC 4/78, и QTL на хромосомах 3 (QTL-3p), 4 (QTL-4p) и 9 (QTL-9p) Lycopersicon parviflorum G1.1601, связанных с устойчивостью к Botrytis, или его часть, ответственную за устойчивость к Botrytis.

В другом предпочтительном варианте осуществления способа получения растения томата, устойчивого к Botrytis, в указанном способе предусмотрено скрещивание указанного Botrytis-устойчивого донорного растения томата с Botrytis-восприимчивым реципиентным растением томата, с получением первого поколения дочерних растений; отбор из первого поколения дочерних растений растения, которое содержит в своем геноме нуклеиновую кислоту, интрогрессированную от указанного донорного растения томата, где указанная интрогрессированная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один QTL, предпочтительно, два, еще более предпочтительно, более двух QTL Botrytis-устойчивости по настоящему изобретению, или его часть, ответственную за устойчивость к Botrytis; скрещивание указанного отобранного дочернего растения с подходящей коммерческой линией томатов с получением второго поколения дочерних растений; отбор из второго поколения дочерних растений растения, которое содержит в своем геноме нуклеиновую кислоту, интрогрессированную от указанного донорного растения томата первого поколения, где указанная интрогрессированная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один QTL, предпочтительно, два, еще более предпочтительно, более двух QTL Botrytis-устойчивости по настоящему изобретению, или часть QTL, ответственную за устойчивость к Botrytis, и, необязательно, создание последующих поколений дочерних растений. Указанные, предпочтительно, два, более предпочтительно, более двух QTL Botrytis-устойчивости, которые интрогрессированы в дочерние растения, могут быть QTL заболеваемости, QTL скорости роста повреждения или комбинацией этих типов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к Botrytis-устойчивому растению томата, или его частям, полученному способом по настоящему изобретению.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к Botrytis-устойчивому растению томата, или его части, содержащему в своем геноме по меньшей мере один QTL или часть QTL, ответственную за устойчивость к Botrytis, где указанный QTL выбран из группы, состоящей из QTL на хромосомах 1, 2 и 4 Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 и QTL на хромосомах 3, 4 и 9 Lycopersicon parviflorum G1.1601, связанных с устойчивостью к Botrytis, и где указанный QTL или указанная часть QTL, ответственная за устойчивость к Botrytis, отсутствует в природном генетическом фоне.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения Botrytis-устойчивого инбредного растения томата. В указанном способе предусмотрены стадии получения Botrytis-устойчивого растения томата способом по настоящему изобретению, самоопыляемое указанное растение, новые растения, выращенные из семян, полученных от указанного самоопыляемого растения; стадии идентификации растений, которые демонстрируют устойчивость к Botrytis и обладают коммерчески требуемыми характеристиками из числа указанных новых растений, а также повторения стадий самоопыления и селекции до тех пор, пока не будет получено инбредное растение томата, которое демонстрирует устойчивость к Botrytis и обладает коммерчески требуемыми характеристиками.

В способе получения Botrytis-устойчивого инбредного растения томата может быть дополнительно предусмотрена стадия отбора гомозиготных инбредных растений томата, которые демонстрируют устойчивость к Botrytis и обладают коммерчески требуемыми характеристиками.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения Botrytis-устойчивого инбредного растения томата или его частям, получаемым способом по настоящему изобретению.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к гибридному растению томата или его частям, которые демонстрируют устойчивость к Botrytis, где указанное гибридное растение томата можно получить, скрещивая Botrytis-устойчивое инбредное растение томата, получаемое способом по настоящему изобретению, с инбредным растением томата, которое обладает коммерчески требуемыми характеристиками.

Изобретение дополнительно относится к культуре ткани регенерируемых клеток растений томата по настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления указанной культуры ткани, клетки или протопласты указанных клеток, выделенных из ткани, выбранной из группы, состоящей из листьев, пыльцы, эмбрионов, корней, концов корней, пыльников, цветов, плодов, а также стеблей и семян.

Изобретение дополнительно относится к применению маркера, выбранного из группы, состоящей из маркеров, перечисленных в таблицах 1 и 2, и маркеров, показанных на фиг.1, 5 и 6, для обнаружения QTL Botrytis-устойчивости по настоящему изобретению и/или для обнаружения Botrytis-устойчивых растений томата.

Botrytis-устойчивое донорное растение томата, используемое в способах по настоящему изобретению, предпочтительно, выбрано из группы, состоящей из Lycopersicon cerasiforme, Lycopersicon cheesmanii, Lycopersicon chilense, Lycopersicon chmielewskii, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon hirsutum, Lycopersicon parviflorum, Lycopersicon pennellii, Lycopersicon peruvianum, Lycopersicon pimpinellifolium и Solanum lycopersicoides, более предпочтительно, образец дикого Lycopersicon используется как растение-донор. Наиболее предпочтительными растениями-донорами являются Lycopersicon hirsutum и Lycopersicon parviflorum, особенно Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 и Lycopersicon parviflorum G1.1601.

Botrytis-восприимчивое донорное растение томата, используемое в способах по настоящему изобретению, предпочтительно, является растением вида Lycopersicon esculentum, более предпочтительно, культурным сортом L. esculentum, которые обладают коммерчески требуемыми характеристиками, или другой коммерческой томатной линией.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показано расположение локусов количественных признаков (QTL) устойчивости к B. cinerea, происходящих из L. hirsutum LYC 4/78, с картами сцепления, представляющими хромосомы 1 и 2. Положения на карте дано в сМ (сантиморган). QTL, обнаруженный на хромосоме 1, относится к росту повреждений, а QTL, обнаруженный на хромосоме 2, относится к заболеваемости. Столбики показывают интервалы QTL. Рамка показывает LOD 1 интервал, а линия показывает LOD 2 интервал. Коды для маркеров AFLP более подробно описаны в таблице 1. Все маркеры, обозначенные как связанные с QTL, могут использоваться в качестве маркеров в аспектах настоящего изобретения.

На фиг.2 показан схематический обзор развития популяций L. esculentum × L. hirsutum LYC 4/78. Линии BC₄ обратно скрещены с L. esculentum сорта Moneymaker с получением линии BC₅, способствующей созданию линий QTL-NIL для двух главных эффектов, которые идентифицированы в популяции F₂. Линии BC₃ и BC₄ обратно скрещены с L. esculentum сорта Moneymaker с получением популяции обратно скрещенной инбредной линии (BIL) (см. пример 3).

На фиг.3 показано расщепление в двух популяциях BC₂S₁ (размер популяции 60 относительно 47), разделяющихся по росту повреждений (фиг.3B и 3D) и заболеваемости (фиг.3А и 3C). Рост повреждения приведен на оси X в мм (фиг.3B и 3D), деления равны 0,5 мм (2,75-3,25; 3,25-3,75 и так далее), а заболеваемость (фиг.3А и 3C) приведена в делениях, равных 5% (12,5-17,5%; 17,5-22,5% и так далее). На оси Y показано количество растений в каждом делении. Средние исходные значения обозначены стрелками для ММ относительно Lyc 4/78.

На фиг.4 показаны результаты скрещивания L. esculentum сорта Moneymaker × L. parviflorum G1.1601. Расщепление в популяции F₂ (основано на среднем значении линий F₃) для заболеваемости (фиг.4A) и скорости роста (фиг.4B). Заболеваемость приведена на оси X в процентах (фиг.4A) с делениями по 5% (12,6-17,5%; 17,5-22,5% и так далее). Рост повреждения приведен на оси X в мм (фиг.4B) с делениями по 0,5 мм (2,75-3,25; 3,25-3,75 и так далее). На оси Y показано количество растений в каждом делении.

На фиг.5 показана карта связей L. parviflorum QTL, как описано в описании. QTL-3p расположен в области, отмеченной маркерами P15M48-234, P18M50-167, TG599, P18M51-486, P22M50-151 и P14M60-65. QTL-4p расположен в области, отмеченной маркерами P14M48-158 и P14M48-34xCD (= P14M48-349 в таблице 2). QTL-9p расположен в области, отмеченной маркерами TG10, P22M50-56, P14M48-56, P14M50-82, P14M50-204, P15M48-138 (= P15M48-137 в таблице 2), P14M50-174 (= P14M50-176 в таблице 2), P22M51-201, P15M48-54, TM2a, P22M51-165, P14M48-120, TG551, P15M48-15xCD (= P15M48-155 в таблице 2).

На фиг.6 показана карта спления и участки QTL L. hirsutum QTL, как описано в описании. Карта представляет собой обновленный вариант карты фиг.1, на которой геномные области показаны более четко. Все маркеры, обозначенные как связанные с QTL (которые расположены на С1 от TG301 до TG460, включительно; которые расположены на C2 от TG145 до At5g64670, включительно; и те, которые расположены на C4 от TG339 до T1405, включительно), могут использоваться в качестве маркеров в аспектах настоящего изобретения. Эта обновленная версия дает основу для предпочтительных вариантов осуществления в аспектах настоящего изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обозначения

Приведенные в настоящем описании признаки не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения, которые могут использоваться по отношению к описанию изобретения в целом. Соответственно, термины, определенные ниже, более подробно определены по отношению к описанию изобретения в целом.

Используемый в настоящем описании термин "Botrytis" означает Botrytis cinerea, который также известен, как серая гниль или серая пятнистость, - болезнь, которая обычно обнаруживается на стебле, листьях и плодах томатов. В целом полагают, механизм инфицирования растительного патогенного гриба Sclerotinia sclerotiorum подобен механизму инфицирования B. cinerea (Prins et al., 2000). Хотя инфекция S. sclerotiorum у томатов экономически намного менее важна, чем инфекция B. cinerea, оба гриба выделяют спектр протеаз, ферментов деградации клеточной стенки растения, токсинов, а также щавелевую кислоту. Некоторые из этих факторов, как известно, играют роль в механизме инфицирования обоих грибов. В результате механизмы и гены, которые вызывают устойчивость к Botrytis, как полагают, одинаково эффективны в обеспечении устойчивости к инфекции S. sclerotiorum. Поэтому в том случае, когда дана ссылка на "Botrytis-устойчивость", под такой устойчивостью следует понимать устойчивость, включающую устойчивость к любому грибу семейства Sclerotiniaceae, предпочтительно, устойчивость к S. sclerotiorum и B. cinerea, более предпочтительно, устойчивость к B. cinerea.

Используемый в настоящем описании термин "аллель (аллели)" означает любую одну или несколько альтернативных форм гена, все аллели которого касаются по меньшей мере одного признака или характеристики. В диплоидной клетке или организме два аллеля данного гена занимают соответствующие локусы на паре гомологичных хромосом. Так как настоящее изобретение относится к QTL, т.е. геномным областям, которые могут включать один или несколько генов, а также и к регулирующим последовательностям, в некоторых случаях более точно ссылаться на "гаплотип" (т.е. аллель хромосомного сегмента), а не на "аллель", однако, в таких случаях, под термином "аллель" следует понимать и термин "гаплотип".

"Ген" определен в настоящем описании как единица наследственности, состоящая из последовательности ДНК, которая занимает определенное положение на хромосоме и которая содержит генетическую инструкцию для отдельных характеристик или признаков в организме.

"Локус" определен в настоящем описании как положение, которое данный ген занимает на хромосоме данной разновидности.

Используемый в настоящем описании термин "гетерозиготный" означает генетическое состояние, существующее, когда другие аллели располагаются в соответствующих локусах на гомологичных хромосомах.

Используемый в настоящем описании термин "гомозиготный" означает генетическое состояние, существующее, когда идентичные аллели располагаются в соответствующих локусах на гомологичных хромосомах.

Используемый в настоящем описании термин "гибрид" означает любое потомство скрещивания между двумя генетически различными особями, включающий, но не ограниченный скрещиванием между двумя инбредными линиями.

Используемый в настоящем описании термин "инбредный" означает по существу гомозиготную особь или линию.

В настоящей заявке под "актом рекомбинации" следует понимать мейотический кроссинговер.

Используемый в настоящем описании термин "интрогрессия", "интрогрессированный" и "интрогрессирующийся" относятся как к природному, так и к искусственному процессу, посредством которого гены одного вида, сорта или культурного сорта растения переносят в геном другого вида, сорта или культурного сорта растения путем скрещивания указанных видов. Процесс может дополнительно быть завершен обратным скрещиванием с родительской формой.

Все термины "генная инженерия", "трансформация" и "генетическая модификация" используются в настоящем описании как синонимы для переноса выделенных и клонированных генов в ДНК, обычно в хромосомную ДНК или геном, другого организма.

Используемый в настоящем описании термин "молекулярный маркер" относится к индикатору, который используют в способах для визуализации различий в характеристиках последовательностей нуклеиновых кислот. Примерами таких индикаторов являются маркеры полиморфизма длины фрагмента рестрикции (RFLP), маркеры полиморфизма длины амплифицированного фрагмента (AFLP), однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), микросателлитные маркеры (например, SSR), маркеры характеризованной последовательностью амплифицированной области (SCAR), маркеры расщепленной амплифицированной полиморфной последовательности (CAPS) или изозимные маркеры или комбинации маркеров, описанных в настоящем описании, которые определяют определенное генетическое и хромосомное положение.

Термины "устойчивые" и "устойчивость" охватывают как частичную, так и полную устойчивость к инфекции. Botrytis-восприимчивое растение томата может или быть неустойчивым, или иметь низкие уровни устойчивости к инфекции Botrytis.

Используемый в настоящем описании термин "часть растения" означает часть растения томата, включающую отдельную клетку и клеточные ткани, такие как растительные клетки, которые являются интактными в растениях, скоплениях клеток и культурах тканей, из которых могут быть регенерированы растения томатов. Примеры частей растения включают, но ими не ограничиваются, отдельные клетки и ткани пыльцы, яйцеклеток, листьев, эмбрионов, корней, концов корней, пыльников, цветов, плодов, стеблей, побегов и семян; а также пыльцу, яйцеклетки, листья, эмбрионы, корни, концы корней, пыльники, цветы, плоды, стебли, побеги, отростки, корневища, семена, протопласты, мозоли и т.п.

Используемый в настоящем описании термин "популяция" означает генетически гетерогенную коллекцию растений, объединенную общим генетическим происхождением.

Используемый в настоящем описании термин "томат" означает любое растение, линию или популяцию Lycopersicon, включающее, но ими не ограниченное, Lycopersicon cerasiforme, Lycopersicon cheesmanii, Lycopersicon chilense, Lycopersicon chmielewskii, Lycopersicon esculentum (или Solanum lycopersicum), Lycopersicon hirsutum, Lycopersicon parviflorum, Lycopersicon pennellii, Lycopersicon peruvianum, Lycopersicon pimpinellifolium или Solanum lycopersicoides. Хотя Линней сперва классифицировал современный томат как Solanum и его научным названием много лет являлось Lycopersicon esculentum. Точно также дикие родственники современного томата были классифицированы в пределах рода Lycopersicon, как L. pennellii, L. hirsutum, L. peruvianum, L. chilense, L. parviflorum, L. chmielewskii, L. cheesmanii, L. cerasiforme и L. pimpinellifolium. За последние несколько лет между исследователями томатов и ботаниками были дебаты по поводу переклассификации названия этих видов. Новым предложенным научным названием для современного томата является Solanum lycopersicum. Точно так же могут быть изменены названия диких видов. L. pennellii может стать Solanum pennellii, L. hirsutum может стать S. habrochaites, L. peruvianum может разделиться на S. 'Nperuvianum' и S. 'Callejon de Huayles', S. peruvianum и S. corneliomuelleri, L. parviflorum может стать S. neorickii, L. chmielewskii может стать S. chmielewskii, L. chilense может стать S. chilense, L. cheesmaniae может стать S. cheesmaniae или S. galapagense, и L. pimpinellifolium может стать S. pimpinellifolium (Solanacea Genome Network (2005) Spooner и Knapp; httr>://www.sgn.comell.edu/help/about/solanum nomenclature.html).

Используемый в настоящем описании термин "сорт" или "культурный сорт" означает группу подобных растений, которые по структурным или генетическим особенностям и/или по продуктивности можно отличить от других сортов в пределах одного и того же вида.

Термин "QTL" используется в настоящем описании в значении, принятом в данной области техники. Термин "QTL, связанный с устойчивостью к B. cinerea у томата", так же как и более короткий термин "QTL Botrytis-устойчивости" относится к области, расположенной на специфической хромосоме томата и которая связана по меньшей мере с одним геном, кодирующим Botrytis-устойчивость, или по меньшей мере к регуляторной области, то есть области хромосомы, которая управляет экспрессией одного или нескольких генов, связанных с Botrytis-устойчивостью. Например, фенотипическая экспрессия указанного гена может наблюдаться в виде пониженной скорости роста повреждений и/или в виде пониженной заболеваемости. Например, QTL может содержать один или несколько генов, продукты которых вызывают генетическую устойчивость. Альтернативно, QTL может содержать, например, регуляторные гены или последовательности, продукты которых влияют на экспрессию генов в других локусах в геноме растения, вызывая таким образом Botrytis-устойчивость. QTL по настоящему изобретению могут быть определены путем указания их генетического положения в геноме соответствующего дикого образца Lycopersicon, используя один или несколько молекулярных геномных маркеров. Один или несколько маркеров, в свою очередь, показывают определенный локус. Расстояния между локусами обычно измеряют частотой кроссинговера между локусами на той же самой хромосоме. Чем дальше два локуса отстоят друг от друга, тем более вероятно, что между ними произойдет кроссовер. Наоборот, если два локуса будут располагаться близко друг к другу, то кроссовер между ними произойдет с меньшей вероятностью. Как правило, один сантиморган (сМ) равен 1%-й рекомбинации между локусами (маркерами). Когда QTL может быть обозначен множественными маркерами, генетическое расстояние между маркерами конечной точки показывает размер QTL.

Используемый в настоящем описании термин "Botrytis-восприимчивое реципиентное растение томата" используется в настоящем описании, чтобы указать растение томата, которое должно получить ДНК, полученную от донорного растения томата, который включает QTL Botrytis-устойчивости. Указанное "Botrytis-восприимчивое р