Применение живых бактерий для стимуляции роста животных

Применение живых бактерий для стимуляции роста животных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области стимуляции роста животных. Точнее, настоящее изобретение относится к применению непатогенного штамма Escherichia coli, экспрессирующего фактор прикрепления F4 (или К88) либо для стимуляции роста животных, либо для усреднения роста животных в стаде.

Уровень техники

Стимуляция роста является ключевым предметом обсуждения для специалистов, работающих на сельскохозяйственных фермах и станциях для разведения животных, которые, в основном, ищут способы оптимизации продукции здоровых животных до их отправления на бойню или для исследовательских целей. Этот интерес должен приводить к применению ростовых стимулирующих продуктов, которые доказывали бы преимущество для животных (в случае выращивания для производства мяса) и людей.

Для специалистов было раскрыто (конкретно, в патенте США N 6500423), что применение формулировки, включающей F4-негативный штамм E. coli человеческого происхождения и растительной летучей фракции, которая, как утверждают, улучшает увеличение веса у поросят. Наблюдаемое увеличение веса связывали с растительной летучей фракцией, а не с F4-негативным штаммом E. coli.

Одним из основных предостерегающих признаков на фермах и при разведении животных является потеря веса, низкая скорость роста в сочетании с возобновлением сопутствующих заболеваний, стоимость лекарств и смертность, которые приводят уменьшению продукции животных и, в конечном итоге, к значительным экономическим потерям. В связи с этим животные после отлучения от грудного кормления и после вылупления являются особенно уязвимыми по отношению к агентам, задерживающим рост.

Среди других наиболее общих факторов, приводящих к вышеупомянутым проблемам, находятся инфекции, вызванные плохими гигиеническими условиями или теснотой при содержании животных.

Одним из традиционных решений, применяемых для смягчения этой проблемы, было применение пищевых антибиотических стимуляторов роста (antibiotir growth promoters). Однако применение антибиотических стимуляторов роста представляется весьма сомнительным, поскольку хорошо известно, что даже при субтерапевтических дозах продолжительное применение антибиотиков может привести к селекции резистентных по отношению к антибиотикам штаммов бактерий у животных, подвергнутых лечению (Amold S et al.; Wegener HC et al. and Schwarz S et al.). Фактически в последние десять лет произошло появление более патогенных и более резистентных к антибиотикам штаммов Escherichia coli и/или постепенных изменений (раннее прекращение грудного кормления) и/или новых Европейских норм регуляции, запрещающих применение антимикробных агентов в качестве стимуляторов роста или для профилактической обработки (профилактика заболевания) и применения в пище высоких доз тяжелых металлов, таких как оксид пинка. Период отлучения животных от грудного кормления ассоциирован, в частности, с наиболее интенсивным применением антибиотиков во время производства мяса животных.

Следовательно, в настоящее время растет сопротивление применению антибиотических стимуляторов роста и тяжелых металлов, обусловленное возникновением резистентности по отношению к антибиотикам, аллергическими реакциями на антибиотики и загрязнением культивируемой почвы.

Другим предостережением является то, что сотрудники ферм и специалисты по разведению животных встретились также с ростом гетерогенности внутри стада животных. Более конкретно, например, для оптимизации производства мяса с целью устранения повышенных расходов фермеры ищут способы производства устойчивых стад животных с наиболее усредненной возможной скоростью роста до скотобойни. Однако для животных в основном характерны различные скорости роста и различная уязвимость по отношению к инфекционным агентам.

Таким образом, существует постоянная потребность в инновационных агентах, которые стимулируют рост животных, а также в агентах, которые дополнительно вносят вклад в усреднение и оптимизацию роста животных.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является применение эффективного количества непатогенного штамма Escherichia coli F4⁺ для стимуляции роста животного.

Другой целью настоящего изобретения является применение эффективного количества непатогенного штамма Escherichia coli F4⁺ для усреднения роста в стаде животных.

Дополнительно целью настоящего изобретения является обеспечение способа стимуляции роста животного, названный способ включает стадию скармливания названному животному эффективного количества непатогенного штамма Escherichia coli F4⁺.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа усредненного роста в стаде животных, названный способ включает стадию скармливания названному животному эффективного количества непатогенного штамма Escherichia coli F4⁺.

Вследствие применения непатогенных штаммов Escherichia coli F4⁺ изобретение обеспечивает преимущество в ситуациях, когда особенно необходимы быстрая стимуляция роста и усреднение роста животного. Например, применение непатогенных штаммов Escherichia coli F4⁺ у животных, выращиваемых для производства мяса, позволяет довести этих животных до рыночного или убойного веса в более короткий период, чем тот, что требуется для необработанных животных.

Настоящее изобретение может дополнительно иметь преимущества для усиления роста и усреднения роста лабораторных животных, таких как крысы и мыши. Можно будет оценить, что достижение этими лабораторными животными данного веса более быстро и более усреднение обеспечивает предпочтительно более усредненные и легкодоступные образцы животных.

Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что нет необходимости в применении антибиотиков для стимуляции роста животных. Таким образом, устраняются такие проблемы, как развитие резистентных по отношению к антибиотикам штаммов бактерий или аллергий к антибиотикам, которые, в частности, влияют на животных после их отлучения от грудного кормления.

Более того, поскольку тяжелые металлы, такие как оксид цинка, не добавляются в корм животных, устраняется также загрязнение почвы. Другими словами, настоящее изобретение обеспечивает также экологически безопасное применение и способы применения.

Улучшенная эффективность превращения пищи, достигнутая с применением настоящего способа, дает возможность обрабатываемым животным достигать любого желаемого веса о потреблением меньшего количества пищи, чем в случае выращивания до того же веса необработанных животных.

Более того, при применении способа настоящего изобретения у обработанных животных не наблюдается ни токсических побочных эффектов, ни снижения основного статуса здоровья, обусловленных бактериями.

Изобретение и его преимущества будут лучше поняты при чтении следующего неограниченного описания его предпочтительных воплощений, сделанных со ссылками на сопроводительные рисунки.

Краткое описание фигур

Фигура 1 представляет собой фотографию, показывающую результат гель-электрофореза в пульсирующем поле переваренной под действием рестриктазы XbaI геномной ДНК предпочтительного непатогенного штамма Escherichia coli F4⁺, примененного в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительный штамм представляет собой штамм coliPRO-tec.

Фигура 2 представляет собой график, отражающий процент прибавки веса у свиней для каждого периода после обработки непатогенными штаммами Escherichia coli F4⁺.

Фигура 3 представляет собой график, отражающий процент прибавки веса у мышей после обработки непатогенными штаммами Escherichia coli F4⁺.

Осуществление изобретения

Оригинальность настоящего изобретения является результатом новых применений непатогенных штаммов Escherichia coli F4⁺. Более подробно и в соответствии с первым аспектом настоящее изобретение относится к применению эффективного количества непатогенного штамма Escherichia coli F4⁺ для стимуляции роста животного.

В соответствии со вторым аспектом настоящее изобретение относится к применению эффективного количества непатогенного штамма Escherichia coli F4⁺ для усреднения роста внутри стада животных.

В соответствии со родственными аспектами настоящее изобретение относится к способу стимуляции роста животных и к способу усреднения роста в стаде животных. Оба способа включают стадию скармливания животному(ым) эффективного количества непатогенного штамма Escherichia coli F4⁺.

Штамм, примененный в настоящем изобретении, характеризуется тем, что он экспрессирует фактор прикрепления F4⁺, оставаясь непатогенным. В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения непатогенный штамм Escherichia coli F4⁺ выбран из группы, состоящей из coliPROtec (инвентарный номер IDAC 210105-01), JG1329, М226, Р03-7586(175) или рМК005. Более предпочтительно, настоящее изобретение рассматривает применение штамма coliPROtec, и/или мутантов или вариантов его (подробнее см. Пример 1).

Термины «мутанты» и «варианты штамма coliPROtec», как они применяются здесь, применяются для штаммов, которые имеют все идентифицируемые характеристики штамма coliPROtec, как это обеспечивается в Примере 1. Мутантные или вариантные штаммы могут быть идентифицированы как имеющие геном или его часть, которая гибридизуется в очень жестких условиях с геномом штамма coliPROtec.

В соответствии с вышеупомянутыми аспектами изобретения вышеописанный штамм применяется в «эффективном количестве». Под выражением «эффективное количество» понимают, что количества непатогенного штамма Escherichia coli F4⁺ является количеством, которое будет вызывать биологический ответ ткани, системы или животного, который является искомым, например, для исследователя или ветеринара. Другими словами, такое эффективное количество непатогенного штамма Escherichia coli F4⁺ является количеством, которое достаточно для усиления роста животного, а также для усреднения роста в стаде животных.

Будет понятно, что предпочтительным эффективным количеством штамма, рассматриваемым настоящим изобретением является, по меньшей мере, 5*10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ, CFU, colony-forming units), и более предпочтительно, примерно от 5*10⁷ до 5*10⁹ КОЕ интересующего штамма на животное. «Примерно» означает, что значение КОЕ названного штамма может варьировать в определенном ряду в зависимости от погрешности метода, используемого для подсчета количества КОЕ для такого штамма.

Применяемое эффективное количество может варьировать в соответствии с рядом факторов. Например, факторами, которые могут быть приняты во внимание, являются тип животного, начальный вес животного, фаза роста животного, условия содержания, то есть места содержания животного, тип и способ управления производством продукции, гигиенический статус мест содержания, стресс после отлучения от груди или вылупления, используемая пища и добавки, здоровье животного и сопутствующие заболевания или лечение.

Как упоминалось выше, цели стимуляции роста и усреднения роста достигнуты на животном. Термин «животное», как он применяется здесь, относится к любому молодому или взрослому животному, подходящему для применения в соответствии с настоящим изобретением. Более предпочтительно, термин «животное» относится к животному в период после прекращения грудного кормления или вылупления.

Поскольку животным после прекращения грудного кормления или вылупления кормление матерью и ее забота становятся недоступными, ростовые стимулирующие агенты приобретают важное значение. Такой интерес особенно значителен, например, в случае выращивания животных на мясо.

В контексте настоящего изобретения предпочтительными применяемыми животными могут быть любое одно из следующих: животные ферм, такие как свиньи, и более предпочтительно, свиньи после отлучения от грудного кормления; домашняя птица, такая как цыплята, утки, гуси, куры или индейки, предпочтительно цыплята и более предпочтительно цыплята-бройлеры; крупный рогатый скот, такой как коровы, кастрированные бычки, быки и волы; игровые животные, такие как страусы и бизоны, домашние животные, например кошки и собаки, и лабораторные животные, такие как мыши или крысы. Конечно, все эти животные характеризуются тем, что стимуляция роста и усреднение роста являются желаемыми свойствами, в частности, когда целью является производство мяса.

С точки зрения сказанного выше будет понятно, что животные могут получать штамм изобретения главным образом в течение всего периода их роста или только в течение части периода роста, например, в ранней части и/или в период перед бойней.

В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения животным, отлученными от грудного кормления, является предпочтительно свинья, предпочтительно в возрасте примерно 10-28 дней, в начале периода испытаний. Интересующая свинья наиболее предпочтительна в возрасте 17 дней.

В соответствии с другим предпочтительным аспектом изобретения животным, отлученными от грудного кормления, является предпочтительно мышь, предпочтительно в возрасте примерно 18-28 дней, в начале периода испытаний. Интересующая мышь наиболее предпочтительна в возрасте 21 день.

В соответствии с еще одним предпочтительным аспектом изобретения животным после вылупления является предпочтительно цыпленок, предпочтительно в возрасте примерно 1-7 дней, в начале периода испытаний. Интересующий цыпленок более предпочтителен в возрасте 1 день. Будет понятно, что выражение «в возрасте примерно 1 день» означает 24 часа или менее после рождения или вылупления.

В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения эффективное количество, которое может быть дано свиньям, предпочтительно варьирует в ряду 5*10⁷-5*10⁹ КОЕ/свинью, и более предпочтительно примерно 1*10⁹ КОЕ/свинью.

В соответствии с другим предпочтительным аспектом эффективное количество, которое может быть дано цыплятам, предпочтительно варьирует в ряду 5*10⁷-5*10⁹ КОЕ/цыпленка, и более предпочтительно примерно 5*10⁸ КОЕ/цыпленка.

В соответствии с еще одним предпочтительным аспектом эффективное количество, которое может быть дано мышам, предпочтительно варьирует в ряду 5*10⁷-5*10⁹ КОЕ/мышь, и более предпочтительно примерно 5*10⁸ КОЕ/мышь.

В особом контексте способов изобретения эффективное количество штамма может быть скормлено животному как единичная доза или может быть дано в соответствии режимом, при котором оно является эффективным. Под термином «скармливание» должно быть понято, что непатогенный штамм Escherichia coli F4⁺ изобретения обеспечивается животному, которое обрабатывают так, что штамм в конечном итоге достигает желудочно-кишечного тракта, и более предпочтительно кишечника.

Например, и в соответствии с предпочтительным аспектом изобретения скармливание может быть произведено как оральное скармливание штамма интересующему животному.

В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения штамм предпочтительно скармливают животному в лиофилизированной форме. В соответствии с другим предпочтительным аспектом штамм изобретения разводят или суспендируют разбавителем или носителем.

В соответствии с настоящим изобретением непатогенный штамм Escherichia coli F4⁺ применяют для «стимуляции роста» животного или для «усреднения роста в стаде животных». Эти выражения относятся к применению штамма Escherichia coli для увеличения скорости роста животного. Другими словами, при обработке интересующим штаммом вес животного увеличивается более быстро и более усреднено по сравнению с его необработанными двойниками. Более точно, выражение «усреднение роста» в контексте настоящего изобретения относится к относительному контролю над ростом в стаде животных. Этот тип контроля имеет особый интерес в области разведения животных и производства мяса, при котором все животные данной группы должны идеально достигать их пика роста быстрее при относительно том же времени среди группы с традиционным количеством пищи вместе с нетоксическим стимулирующим рост агентом. Когда выполняются все эти условия, могут быть оптимизированы цена кормов, убойная цена и цена доставки.

Для того чтобы оценить стимуляцию роста и усреднение роста, может быть определен ряд параметров, известных в данной области. Более точно, такие параметры, оцененные либо по отдельности, либо в сочетании, могут включать:

i. Средний вес тела (MBW): средние веса тела группы животных;

ii. Среднее ежедневное увеличение веса (DWG): среднее увеличение веса за день в группе животных во время определенного периода;

iii. Потребление корма (FI): количество съеденного корма на животное или на группу животных во время определенного периода; и

iv. Коэффициент превращения корма (FCR): потребление корма на животное или на группу животных в течение определенного периода, разделенное на увеличение веса того же животного или группы животных в тот же самый определенный период.

Преимущественно штамм изобретения может быть применен один или вместе с пищевым приемлемым носителем. Как это применяется здесь, выражение «пищевой приемлемый носитель» относится к любому носителю, разбавителю или эксципиенту, который совместим со штаммом изобретения, и может быть дан животному без вредных эффектов. Подходящие пищевые приемлемые носители, известные специалистом, включают, но не ограничиваются этим, воду, соли, глюкозу, декстрозу или буферные растворы. Такой носитель предпочтительно нетоксичен для штамма и не вреден для животного. Он может быть также биодеградируемым. Специалистам будет известно, как выбрать подходящие носители, такие носители, которые не навредят окружающей среде. Предпочтительно также, чтобы этот носитель являлся подходящим твердым или жидким пищевым приемлемым носителем.

Подходящий твердый пищевой приемлемый носитель является нетоксичным потребляемым носителем. Например, этот твердый пищевой приемлемый носитель может быть распространенным твердым пищевым продуктом, таким как компонент типичной диеты животного, состоящей из зерновых продуктов, такие как ячменная мука, кукурузная мука или пшеничный корм, ореховые и зерновые продукты, такие как ошелушенный молотый ореховый жмых или жмых из семян хлопка, или экстрагированный жмых из семян хлопка, вместе с минорными количествами, например, перьевой муки, муки морских водорослей, костной муки, угля, соли, мочевины и витаминов; или он может быть инертным твердым разбавителем или носителем непищевой природы, например, каолином, тальком, карбонатом кальция, валяльной глиной, аттапульгированной глиной, молотыми раковинами устриц или молотым известняком; или он может быть крахмалом или лактозой.

Подходящий жидкий пищевой приемлемый носитель является, например, водой и предпочтительно питьевой водой, молоком, таким как цельное или снятое молоко, или культуральной средой, такой как триптон-соевый бульон (TSB).

Следующие примеры иллюстрируют широкий ряд возможных применений настоящего изобретения и не имеют намерения ограничить его рамки. Могут быть произведены модификации и вариации этого без уклонения от духа и рамок изобретения. Хотя в практике для тестирования настоящего изобретения может быть применен любой способ и материал подобный или эквивалентный тем, что описаны здесь, описаны предпочтительные способы и материалы.

Примеры

Пример I: Описание штамма Escherichia coli (coliPROtec штамм) и его клонов.

В соответствии с предпочтительным свойством изобретения применяется непатогенный штамм Escherichia coli F4⁺ (называемый здесь coliPROtec или JFF4 штаммом). Штамм ColiPROtec был депонирован в Международном депозитарии интеллектуальной собственности Канады (ШАС) 21 января 2005 года, и ему был присвоен инвентарный номер ШАС 210105-01.

1. Происхождение

Штамм был изолирован из фекалий здоровой свиньи в Escherichia coli лаборатории на факультете Ветеринарной медицины, университета Монреаля, Сан-Гиацинт, Квебек, Канада. Животные были куплены на местных фермах, находящихся в Монреале, Квебек, Канада.

2. Стабильность штамма

Экспрессия F4 иммуногенного белка бахромы штамма coliPROtec была стабилизирована применением пассажей in vitro. Было сделано три (3) последовательных 10 л ферментации. После каждой ферментации культуру высевали на агаре, и тестировали 10 колоний на экспрессию белка F4 бахромы с применением агглютинапионного теста на стекле. Бактерий из колоний F4⁺ собирали и использовали для последовательных ферментации. Затем штамм был заморожен в TBS с добавлением 20% глицерина. После размораживания экспрессия F4 не была полностью стабильна, и для получения стабильного штамма было необходимо провести несколько (приблизительно 10) последовательных ферментации. Стабильный штамм был лиофилизирован примерно после 15 пассажей из свиньи. Эту лиофилизированную культуру применяли для производства типовых посевов coliPROtec.

3. Биохимический анализ

Идентификация штамма была проведена с применением API системы. Полученный идентификационный код 5544572 относится к штамму Escherichia coli.

4. Виротипирование

Виротипирование coliPROtec штамма было выполнено путем гибридизации колоний и/или полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Результаты виротипирования показали, что штамм coliPROtec был позитивен по F4, в то время как он был негативен в отношении следующих токсинов:

LT, Sta, STb, StaH, Stx1, Stx2, VT2vp1, VY2vh, Aero, Tsh, CDT3, CDT4, CNF1, CNF2, H1yA, H1yC, Ehx, East1.

Дополнительно штамм coliPROtec был также негативен в отношении следующих адгезинов или возможных адгезинов:

F5, F6, F18, F41, F17, Р бахромы, AIDA, AFA, SFA, CS31a, daaE, Paa, aggR, ARF/1, Eae, CFAI, CFAII(CS1coo), CFAII(CS3cst).

5. ДНК фингерпринт

Штамм coliPROtec был охарактеризован с применением гель-электрофореза в пульсирующем поле (Фигура 1).

Отдельные клоны штамма, для которых после ферментации была характерна стабильная экспрессия белка F4 бахромы, отбирали последующими последовательными пассажами in vitro.

6. Сводная таблица и спецификация

Штаммы, примененные в следующих экспериментах, детально описаны в следующей таблице и спецификации.

Таблица 1
Непатогенные штаммы Escherichia coli F4+ дикого типа
Название	Серотип	Источник
JFF4 (coliPROtec)	O8:K87	Фекалии здоровой свиньи
JG1329	O8:K87	Фекалии свиньи
М226	O9	Фекалии свиньи
Р03-7586(175)	O8	Фекалии свиньи
Непатогенный рекомбинантный штамм Escherichia coli F4+
РМК005	О9	Плазмида рМК005, кодирующая F4
F4-негативный непатогенный штамм Escherichia coli
Р82-862	0115:KV165	Фекалии свиньи
Сводная таблица и спецификация
	Определено стандартным способом серотипирования с применением «О» антигена и в «Государственном Институте Сыворотки, (Staten Serum Institut 5 Artillerivej 2300) Копенгаген S, Дания»
Патотип	Негативный по отношению к следующим токсинам
- LT, Sta, STb, StaH, Stx1, Stx2, VT2vp1, VY2vh, Aero, Tsh, CDT3, CDT4, CNF1, CNF2, H1yA, H1yC, Ebx, East1
Негативный по отношению к следующим вирулентным факторам
- F5, F6, F18, F41, F17, Р бахромы, AIDA, AFA, SFA, CS31a, daaE, Paa, aggR, ARF/1, Eae, CFAI, CFAII (CS1coo), CFAII (CS3cst)
Подтверждено ПЦР и гибридизацией колоний
Среда для экспрессии бахромы

Антибиограмма, резистентен по отношению к	Ампипиллин, тетрациклин, спектиномицин, тиамулин, тилозин
Антибиограмма, чувствителен по отношению к	Апрамицин, цефтиофур, цефалотин, гентамипин, неомицин, трим/сульфаметаксазол
Среда хранения	Высушен в замороженном виде (лиофилизация) в среде: 5% декстран Т-40,7% сахароза, 1% глутамат натрия
Источник выделения для	Изолирован в Escherichia coli лаборатории, факультет Медицинской ветеринарии, Сант-Гиацин, 1999, из фекалий нормальной свиньи

Пример II: Отлученные от грудного кормления свиньи

Эффекты непатогенных штаммов Escherichia coli F4⁺ в оральной форме на рост свиней

А). Эффект coliPROtec на увеличение веса у отлученных от грудного кормления свиней

1. Штамм Escherichia coli:

Живой непатогенный штамм Escherichia coli F4⁺ coliPROtec, суспендированный в TBS, скармливали орально отлученным от грудного кормления свиньям. Этот штамм описан в Примере I.

2. Эксперименты

2.1 Животные

Было проведено пять (5) испытаний для общего количества 45 свиней, получавших штамм, и 45 необработанных свиней. Эти свиньи поступили из различных коммерческих ферм.

2.2 Тестирование

Тестирование было проведено на факультете Ветеринарной медицины университета Монреаля по следующей схеме.

2.2.1 Группы для тестирования

Группа No. (n)	Описание
1 (45)	Необработанные
2 (45)	Обработанные coliPROtec (5E9 КОЕ/свинью)

2.2.2 Схема тестирования

День No	Описание
1	Прибытие отлученных от грудного кормления 17-дневных свиней
1-4	Период адаптации
5	Обработка животных единственной дозой coliPROtec или только TBS (контрольная группа)
20	Взвешивание животных; Конец эксперимента

2.2. Оцениваемые параметры

В настоящем анализе оцениваемыми параметрами были вес и ежедневное увеличение веса свиней, отлученных от грудного кормления, на 5 и 20 день в Группах 1 и 2.

3. Результаты

Во время исследования на безвредность (innocuity) штамма coliPROtec наблюдалось положительное действие продукта на увеличение веса животных. Как показано в Таблицах 2 и 3, свиньи, получившие только одну оральную дозу coliPROtec в начале периода, начавшегося после отлучения их от грудного кормления, имели ежедневный прирост в весе более 53 г по сравнению с животными, не получавшими coliPROtec. Точнее, через 2 недели после обработки, свиньи, получившие coliPROtec, были на 849 г тяжелее, чем те, что не получали coliPROtec.

Таблица 2
Вес животных
День	Вес (кг)	Т-тест	Группа 2 против группы 1 (г)
Группа 1	Группа 2
5	6,053	6,137	р=0,754	+84
20	12,055	12,904	Р=0,020	+849

Таблица 3
Ежедневное увеличения веса
Дни	Ежедневный при рост в весе (г)	Т-тест	Группа 2 против группы 1 (г)
Группа 1	Группа 2
5-20	405	458	р=0,007	+53

4. Анализ и заключение

При получении coliPROtec на 5 день после отлучения от груди вес групп 1 и 2 (получавшей и не получавшей coliPROtec) не был статистически различным. Однако на 20 день после отлучения от груди (15 дней после получения coliPROtec), получавшие штамм животные были на 849 г более тяжелыми, и их ежедневный привес был на 53 г больше, чем у животных, которые не получали coliPROtec. Эти различия были статистически значимыми.

Известно, что традиционные стимуляторы роста антибиотики в основном увеличивают прирост веса на 3,3-8,8% (Doyle, M.E., Food Research Institute, University of Wisconsin, 2001). Как показано здесь, штамм coliPROtec увеличивал ежедневный прирост веса на 11% в течение 2 недель после единственной дозы.

В). Эффекты живых непатогенных штаммов Escherichia coli F4⁺ в оральной форме на рост свиней, отлученных от грудного кормления

1. Штаммы Escherichia coli

Примененные штаммы описаны в Примере I.

2. Эксперименты

2.1. Животные

В настоящих экспериментах были использованы сорок девять (49) отлученных от грудного кормления свиней в возрасте 17 дней, полученные из чистых традиционных свиноферм. Вес тела этих поросят составлял 5±1 кг.

2.2. Тестирование

2.2.1 Группы тестирования

При отлучении свиньи были переведены в герметичные комнаты мест содержания животных Лаборатории пищевой ветеринарии, Сант-Гиацинт, Квебек, Канада. Лабораторные анализы были проведены в EcL лаборатории, FMV, Сант-Гиацинт, Квебек, Канада.

No группы (n)	Описание
1 (7)	Необработанные свиньи
2 (7)	Обработанные непатогенным Р4-негативным штаммом Escherichia coli Р82-862
3 (7)	Обработанные непатогенным F4+ штаммом Escherichia coli JFF4 (coliPROtec)
4 (7)	Обработанные непатогенным F4+ штаммом Escherichia coli JG1329
5 (7)	Обработанные непатогенным F4+ штаммом Escherichia coli М226
6 (7)	Обработанные непатогенным F4+ штаммом Escherichia coli Р03-7586 (175)
7 (7)	Обработанные непатогенным F4+ штаммом Escherichia coli рМК005

2.2.2 Схема тестирования

День No	Описание
0	Прибытие 17-дневных свиней в места содержания
1	Идентификация, формирование групп и взвешивание свиней. Группирование проведено в соответствии с полом и весом. Взятие образцов фекалий для оценки экскреции позитивной по F4, LT, Sta и/или STb Escherichia coli (ПЦР)
1-4	Каждой свинье было дано приблизительно 5Е9 КОЕ Escherichia coli в триптон-соевом бульоне (TSB) орально с применением эзофагеальной трубки. Контрольная группа получала только TBS.
1, 4, 9, 14 и 17	Взвешивание животных, взятие образцов фекалий для оценки экскреции F4, LT, Sta и/или STb позитивных Escherichia coli (ПЦР)
17	Эвтаназия животных

2.2.3 Оцениваемые параметры

Во время исследования свиньи имели свободный (ad libitum) доступ к корму и воде. Их осматривали дважды в день для верификации здоровья и выявления наличия диареи. С дня 0 до дня 14 свиней кормили пищевым коммерческим стартерным кормом, содержащим 23% белка без добавления оксида цинка или антибиотиков. В течение последних 3 дней корм содержал 19% белка.

3. Результаты

3.1. F4⁺ Escherichia coli и патогенный ETEC статус свиней

В начале тестирования, следовательно, перед обработкой, некоторые свиньи из всех групп были колонизированы F4+ штаммом, обладающим токсином STb (таблица 4). Все свиньи контрольной группы (Группа 1) и группы, которой давали штамм Escherichia coli F4⁺ (Группа 2) были колонизированы этим штаммом F4:STb на 9 день (Таблица 5).

Хотя этот штамм (045:4:STb) не является обычным ЕТЕС штаммом, вызывающим диарею у свиней после прекращения грудного кормления, мы не можем исключить, что он является патогенным. Однако во время тестирования ни у кого из животных не было клинических признаков, ассоциированных с диареей, наблюдаемой после прекращения грудного кормления.

Поскольку обе контрольные группы были колонизированы этим F4⁺ штаммом, трудно выявить эффект тестируемых F4⁺ штаммов на рост животных.

Таблица 4
Идентификация статуса свиней по экскреции штамма Escherichia coli F4+ до обработки (День 1, ПЦР анализ фекалий)
	Число свиней с фекалиями, позитивными по F4	Другие идентифицированные вирулентные факторы
Группа 1*	1	LT и Stb
Группа 2	1	Stb
Группа 3	2	LT и Stb
Группа 4	1	LT и Stb
Группа 5	1	LT и Stb
Группа 6	3	LT и Stb
Группа 7	1	Stb
*Обработка: Группа 1; контроль, Группа 2; F4 негативный штамм Escherichia coli на 1 и 4 день, Группы 3-7; F4+ штамм в 1 и 4 дни.

Таблица 5
Идентификация статуса свиней по экскреции штамма Escherichia coli F4+ во время испытания
	Число свиней с фекалиями, позитивными по F4
	День!	День 4	День 9	День 14	День 17
Группа I*	1	3	7	4	0
Группа 2	1	2	7	3	0
Группа 3	2	4	6	5	5
Группа 4	1	7	7	6	0
Группа 5	1	6	6	5	6
Группа 6	3	1	1	7	4
Группа 7	1	1	1	0	0
*Обработка: Группа 1; контроль, Группа 2; F4 негативный штамм Escherichia coli 1 и 4 день, Группы 3-7; F4+ штамм в 1 и 4 дни.

3.2. Оценка состояния здоровья и наличие диареи

Во время испытания все животные были здоровыми. Некоторые животные групп 2, 3,4, 6 и 7 имели диаррею средней тяжести, но лишь один день.

3.3. Оценка роста

Таблица 6
Вес свиней после обработки штаммом Escherichia coli F4+
	Вес тела (кг)
	День 1*	День 4	День 9	День 14	День 17
Группа 1*	4,91	5,43	6,74	9,09	10,23
Группа 2	4,86	5,40	7,11	9,23	11,20
Группа 3	4,91	5,77	7,23	9,34	10,91
Группа 4	5,00	5,13	7,07	9,20	10,60
Группа 5	4,97	5,59	7,04	9,27	10,47
Группа 6	4,91	5,47	7,20	9,41	10,46
Группа 7	5,03	5,80	8,03	10,20	11,23
*Обработка: Группа 1; контроль, Группа 2; F4 негативный штамм Escherichia coli 1 и 4 день, Группы 3-7; F4+ штамм в 1 и 4 дни.

Линейная модель с повторными измерениями с применением дня как фактора внутри субъекта, и группы как фактора между субъектами, показала отсутствие эффекта обработки на рост свиней (р=0,90). Post hog анализ фиксировал различия между каждой обработанной группой (группы 2-7) и контрольной группой (группа 1) в каждый день (Таблица 6). Вес был значительно выше для группы 7 по сравнению с контрольной группой только на день 9 (р=0,045). Другие различия в весе были не значимыми.

Тем не менее, группы 3 и 7, обработанные JFF4 и рекомбинантными штаммами соответственно, имели более высокий вес в дни 4 и 9, но впоследствии веса между группами были более похожими (Таблица 6). Во время первого периода тестирования (дни 0-4) группы 3 и 7 имели процент привеса 18 и 15% соответственно, по сравнению с 11%, характерными для обеих контрольных групп (Группы 1 и 2; Фигура 2). Низкое увеличение веса, наблюдаемое в этот первый период для группы 4, был обусловлен тремя свиньями, которые теряли вес.

Во время второго периода (дни 4-9), группы 2, 4, 6 и 7 имели более высокий процент прироста веса, чем таковые в необработанной группе (группа 1). Процент прироста веса был более усредненным во время третьего периода (дни 9-14) и во время последнего периода был выше для групп 2 и 3, чем для группы 1.

Пример III: цыплята бройлеры

Эффект живых непатогенных штаммов Escherichia coli F4+ в оральной форме на рост цыплят бройлеров.

Использованные штаммы описаны в Примере I.

2. Эксперименты

2.1 Животные

Шестьдесят три (63) цыпленка самца в возрасте 1 день бройлерной линии Коббс (Cobbs), происходящие из чистых традиционных птицефабрик. После вылупления цыплята были переведены в места содержания животных.

2.2 Тестирование

2.2.1 Группы тестирования

После вылупления цыплята были переведены в герметичные комнаты в местах содержания животных Факультета медицинской ветеринарии, Сант-Гиацинт, Квебек, Канада. Лабораторные анализы были проведены в EcL лаборатории FMV, Сант-Гиацинт, Квебек, Канада.

No группы (n)	Описание
1 (10)	Необработанные цыплята
2 (10)	Обработанные непатогенным F4-негативным штаммом Escherichia coli Р82-862
3 (10)	Обработанные непатогенным F4+ штаммом Escherichia coli JFF4 (coliPROtec)
4 (10)	Обработанные непатогенным F4+ штаммом Escherichia coli JG1329
5 (10)	Обработанные непатогенным F4+ штаммом Escherichia coli М226
6 (10)	Обработанные непатогенным F4+ штаммом Escherichia coli Р03-7586 (175)
7 (10)	Обработанные непатогенным рекомбинантным штаммом F4+ pMK005

2.2.2 Схема тестирования

День No	Описание
0	Прибытие 1-дневных цыплят в места содержания; идентификация, взвешивание и формирование групп цыплят; взятие образцов фекалий для оценки экскреции позитивных по F4, LT, Sta и/или STb. Escherichia coli (ПЦР)
1-4	Каждому цыпленку было дано орально приблизительно 1Е9 КОЕ бактерий Escherichia coli в триптон-соевом бульоне (TSB) с применением эзофагеальной иглы. Контрольная группа получала только TBS.
0, 4, 9, 14, 18, 23 и 28	Взвешивание животных, оценка экскреции F4, LT, Sta и/или STb позитивных Escherichia coli (ПЦР)
2, 9, 17 и 24	Оценка 24 часового потребления пищи
28	Эвтаназия животных

2.2.3 Оцениваемые параметры

При проведении настоящего анализа были оценены средний вес тела (MBW), среднее ежедневное увеличение веса (DWG), потребление корма (FI) и коэффициент превращения корма (FCR).

Во время тестирования цыплята имели свободный дост