Способ получения водорастворимых полисахаридов из плодового тела трутовика лекарственного, обладающих иммунотропной активностью

Способ получения водорастворимых полисахаридов из плодового тела трутовика лекарственного, обладающих иммунотропной активностью

Реферат

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения субстанций, влияющих на иммунные процессы в организме.

Известен способ получения бета-глюканов из клеточной стенки дрожжей воздействием ультразвуком (Патент RU №2216595). Недостатком данного способа является использование дорогостоящего оборудования.

Известен способ выделения полисахаридного комплекса пектина и каррагинана из сырья растительного происхождения путем пропускания экстрагирующей жидкости через неподвижный слой полисахаридсодержащего сырья растительного происхождения с целью одновременного осуществления гидролиза и экстракции полисахарида из сырья растительного происхождения и отделения раствора, содержащего полисахарид, от остающегося твердого материала растительного происхождения (заявка на изобретение №95109852).

Известен способ получения «Бефунгина» (экстракт наростов березового гриба чаги), обладающего иммуномодулирующим действием (Трутнева И.А., Горовая Т.Л., Дудченко Л.Г. Высшие базидиальные грибы - объект медицинских исследований: иммуномодулирующая активность. - Фитотерапия на Украине. - 2003. - №1. - С.32-36), который заключается в следующем: наросты чаги, раздробленные до размера частиц около 3 мм (±0,4 мм), экстрагируют водой по принципу противотока в диффузионной батарее из 6 диффузоров при последовательно повышающейся от 40 до 65°С температуре от головного диффузора до хвостового, при продолжительности настаивания в каждом диффузоре - 1 час. Соки, получаемые с головных диффузоров, фильтруют. В фильтрате определяют по удельному весу сухой остаток, а затем добавляют водный раствор кобальта хлорида или кобальта сульфата, в количествах, предусмотренных регламентом, после чего упаривают при температуре 50-55° при остаточном давлении 70 мм рт. ст. Концентрат охлаждают до 40°С до содержания сухих веществ не выше 20%. В целях консервирования добавляют спирт этиловый из расчета 10% от веса концентрата (Якимов Н.А., Андреева С.М., Алексеева Е.В. Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. - М.-Л., 1961. - С.129-137).

Бефунгин (полугустой экстракт плодового тела чаги) имеет горький вкус, помимо полисахаридов содержит полифенолкарбоновый комплекс, чаговые кислоты и др. В связи с недостаточной высокой онкостатической активностью бефунгин применяют длительно, в комплексной терапии, что вызывает дискенетические явления и аллергические реакции у больных. Кроме того, бефунгин содержит соли тяжелого металла - кобальта. Недостатком данного способа полисахаридов является низкий коэффициент использования сырья, которое заключается в извлечении только водорастворимых (ВРПС) компонентов чаги, не предусматривающем дальнейшую переработку сырья.

Данный способ получения полисахаридов является наиболее близким к предлагаемому и поэтому взят нами за прототип.

Технической задачей предлагаемого изобретения является получение водорастворимых полисахаридов из трутовика лекарственного безотходным способом, обладающих повышенной иммунотропной активностью. Технический результат достигается при использовании предложенного способа, который состоит в следующем.

Плодовое тело трутовика лекарственного (Fomitopsis officinalis (Vill.) Bondartsev & Singer), сем. Polyporaceae, класса базидиомицетов - Basidiomycetes), измельченное до размеров не более 3 мм, экстрагируют в аппарате Сокслета смесью хлороформ-спирт этиловый 95% (1:2) до полного истощения сырья. Полученное извлечение упаривают при температуре 50-60°С до состояния густой массы, затем высушивают при температуре 100°С до остаточной влажности 5%. Полученный экстракт используют для получения липидной фракции и агарициновой кислоты; обезжиренное сырье высушивают до удаления запаха растворителей, взвешивают и экстрагируют трижды горячей водой на кипящей водяной бане с обратным холодильником (при суммарном соотношении сырья и экстрагента 1:20, 1:15, 1:10). Суммарная продолжительность трех экстрагирований - 6 часов. Полученные водные экстракты объединяют и упаривают на роторно-пленочном испарителе при температуре 50°С до 1/5 первоначального объема, фильтруют. Из полученного концентрата водорастворимые полисахариды выделяют добавлением четырехкратного объема спирта этилового 95% и выдерживанием при температуре -5°С в течение 12-ти часов. После центрифугирования осадок отделяют, промывают спиртом этиловым 95% и ацетоном на стеклянном фильтре, сушат при температуре 30°С и взвешивают.

Пример конкретного выполнения способа.

100,0 г сырья плодового тела трутовика лекарственного, измельченного до размера частиц не более 3 мм, экстрагируют в аппарате Сокслета смесью хлороформ-спирт этиловый 95% (1:2) до полного истощения сырья. Полученное извлечение упаривают при температуре 50-60°С до состояния густой массы, затем высушивают при температуре 100°С до остаточной влажности 5%. Полученный экстракт используют для получения агарициновой кислоты и липидной фракции; обезжиренное сырье высушивают до удаления запаха растворителей, взвешивают и экстрагируют трижды горячей водой на кипящей водяной бане с обратным холодильником (при суммарном соотношении сырья и экстрагента 1:20, 1:15, 1:10). Суммарная продолжительность трех экстрагирований - 6 часов. Полученные водные экстракты объединяют и упаривают на роторно-пленочном испарителе при температуре 50°С до 1/5 первоначального объема, фильтруют. Из полученного концентрата водорастворимые полисахариды выделяют добавлением четырехкратного объема спирта этилового 95% и выдерживанием при температуре -5°С в течение 12-ти часов. После центрифугирования осадок отделяют, промывают спиртом этиловым 95% и ацетоном на стеклянном фильтре, сушат при температуре 30°С. Взвешивают. Выход составляет 6,5% в пересчете на абсолютно сухое сырье.

Выявляя влияние водорастворимых полисахаридов трутовика лекарственного на иммунную систему животных, изучают как специфические, так и неспецифические факторы иммунного ответа. Эксперимент проводят на белых беспородных крысах обоего пола, содержащихся в общевиварийном режиме, массой 200-220 г. Животных для исследования получают из питомника лабораторных животных «Рапполово» АМН РФ и содержат в условиях вивария ПятГФА при одинаковых условиях и на стандартном рационе питания. Все травматические манипуляции на животных проводят под эфирным наркозом. Животных делят на три группы: 1) контроль-1;

2) контроль-2; 3) опытная группа.

Контрольной группе интактных животных (контроль-1) вводят физиологический раствор в тех же объемах и в те же сроки, что животным второй и третьей групп.

Контроль-2 составляют животные, получающие в качестве препарата сравнения официальный препарат «Бефунгин», вводимый в перерасчете на терапевтическую дозу в течение 5 дней.

Опытной группе животных вводят исследуемое вещество (фракцию ВРПС трутовика лекарственного) в дозе 100 мл/кг в течение 5 дней. Иммунизацию животных осуществляют внутрибрюшинным введением эритроцитов барана в дозе 2·10⁸ клеток/мл.

Статистическая обработка материала осуществляется по Т-критерию Стьюдента.

Исследование иммунотропного действия ВРПС трутовика лекарственного проводят путем изучения неспецифических и специфических механизмов защиты, обусловленных клеточными и гуморальными факторами.

1. Гуморальные факторы неспецифической резистентности изучают по определению бактерицидной активности сыворотки (БАС) крови нефелометрическим методом [Бухарин О.В. Факторы естественного иммунитета. - Оренбург, 1979. - С.43-45]. Выраженность реакции определяют по разнице процента гибели суточной культуры Esherichia coli (штамм 011) в контрольной и опытной пробе, содержащей сыворотку. Процент активности вычисляют по формуле:

,

где

А_к - оптическая плотность контроля;

A_о - оптическая плотность опыта.

В результате проведенных исследований установлено, что под влиянием ВРПС трутовика происходит снижение бактерицидной активности сыворотки крови на 45,8%. Препарат сравнения не изменяет исходный интактный уровень БАС (табл.1).

2. Клеточные неспецифические факторы изучают на примере фагоцитоза путем добавления в цитратную кровь суточной культуры Esherichia coli (штамм 0 11) [Иванов А.И., Чухловин Б.А. К методике определения поглотительной и переваривающей способности нейтрофилов. - Лабораторное дело, 1967, №10, С. 108-110; 610-613]. В мазках крови подсчитывают показатели фагоцитарной активности нейтрофилов: фагоцитарную активность лейкоцитов (ФАЛ), фагоцитарный индекс лейкоцитов (ФИЛ), показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ). Показатели фагоцитарной активности опыта выше относительно контроля: ФАЛ - на 47%, ФИЛ - на 59%, ПЗФ - на 59% соответственно (табл.2).

3. Специфические механизмы защиты рассматривают на модели формирования первичного иммунного ответа по гуморальному типу методом безагарового локального гемолиза в монослое эритроцитов в модификации Каннингейма. Метод используют для оценки гуморального иммунитета [Иммунологические методы / Под ред. Фримеля Г. - М.: Медицина, 1987. - С.57-62]. Иммунный ответ оценивают после иммунизации путем подсчета количества антителообразующих клеток (АОК) кариоцитов в селезенке у крыс.

Под влиянием препарата «Бефунгин» наблюдают снижение АОК на 45,8%, а под влиянием ВРПС трутовика - на 39,8% (табл.3).

4. Специфические механизмы защиты по оценке клеточного иммунитета изучают на модели формирования первичного иммунного ответа путем определения розеткообразующих клеток (РОК) в селезенке у крыс. В мазке подсчитывают 200 лейкоцитов, определяя среди них РОК в пересчете на их процентное содержание [Иммунологические методы / Под ред. Фримеля Г. - М.: Медицина, 1987, - С.242-252]. Под влиянием препарата «Бефунгин» и ВРПС наблюдают значительное повышение уровня клеточного иммунитета относительно интактных животных. Бефунгин повышает активность клеточного иммунитета на 51,17%, а ВРПС трутовика - на 74,61% (табл.4).

Результаты показали, что введение ВРПС трутовика в организм влияет на формирование специфического ответа в организме у крыс и факторов неспецифической резистентности. Происходит стимулирование ответа по клеточному типу на формирование иммунного ответа в селезенке у крыс и повышение показателей фагоцитарной активности нейтрофилов крови. Однако при действии на гуморальное звено заявляемого объекта наблюдается угнетение формирования гуморального ответа в селезенке и снижение бактерицидной активности сыворотки у крыс.

Таблица 1
Влияние ВРПС трутовика на бактерицидную активность сыворотки крови (БАС)
№ п/п	Исследуемые группы	БАС (% активности)	Процентное содержание относительно контроля
1	Контроль-1 (интактные)	32,75±2,08	-
2	Контроль-2	29,08±2,0
(Бефунгин - препарат сравнения)	Р>0,05
3	Опытная группа	17,95±2,12	45,8↓
(ВРПС трутовика)	Р<0,001
Примечание: Р - (достоверность) относительно контроля-1

Таблица 2
Влияние ВРПС трутовика на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов крови у крыс
№ п/п	Исследуемые группы	ФАЛ (%)	ФИЛ, ед.	ПЗФ (%)	Процентное содержание относительно контроля
ФАЛ	ФИЛ	ПЗФ
1	Контроль (интактные)	31,05±1,83	0,33±0,02	34,27±2,54	-	-	-
2	Бефунгин	47,12±2,47	0,49±0,02	26,25±2,77	52↑	48↑	30↑
Р<0,01	Р<0,001	Р<0,005
3	ВРПС трутовика	45,5±2,18	0,47±0,02	54,63±2,5	47↑	42↑	59↑
Р<0,01	Р<0,001	Р<0,001
Примечание: Р - (достоверность) относительно контроля - 1

Таблица 3
Влияние ВРПС трутовика на гуморальный иммунный ответ в селезенке у крыс
№ п/п	Исследуемые группы	Количество АОК×106 спленоцитов	Процентное содержание относительно контроля
1	Контроль-1 (интактные животные)	89,28±9,95
2	Контроль-2	48,34±4,62	45,8↓
(Бефунгин - препарат сравнения)	Р<0,01
3	Опытная группа	53,78±3,51	39,8↓
(ВРПС трутовика)	Р<0,01
Примечание: Р - (достоверность) относительно контроля-1

Таблица 4
Влияние ВРПС трутовика на клеточный иммунитет в селезенке у крыс
№ п/п	Исследуемые группы	Количество РОК (%) в селезенке	Процентное содержание относительно контроля
1	Контроль (интактные)	29,86±1,62	-
2	Бефунгин	45,14±3,21	51,17↑
Р<0,01
3	ВРПС трутовика	52,14±3,1	74,61↑
Р<0,001
Примечание: Р - (достоверность) относительно контроля-1

Способ получения средства, обладающего иммунотропной активностью, характеризующийся тем, что плодовое тело гриба трутовика измельчают до размеров частиц не более 3 мм, экстрагируют смесью хлороформа и спирта этилового 95%, которые берут в соотношении 1:2, высушенный шрот экстрагируют трижды горячей водой при соотношениях сырья и экстрагента 1:20, 1:15, 1:10 в течение 6 ч, объединенное извлечение упаривают при температуре 50°С до 1/5 первоначального объема, фильтруют, осаждают спиртом этиловым 95%, центрифугируют, отделяют и очищают.