Рекомбинантная экспрессия дефенсинов в мицелиальных грибах

Рекомбинантная экспрессия дефенсинов в мицелиальных грибах

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к рекомбинантной экспрессии антимикробных пептидов дефенсина в мицелиальных грибах.

Уровень техники

Дефенсины принадлежат к классу малых антимикробных пептидов. Они способны уничтожать широкий спектр микроорганизмов, некоторые из которых становятся все более и более устойчивыми по отношению к традиционным антибиотикам. По этой причине все больший интерес приобретает возможность получения дефенсинов в больших количествах по низкой цене.

Так как дефенсины обычно включают только 30-50 аминокислотных остатков, их часто трудно эффективно получать с использованием способов рекомбинантной ферментации. Химический пептидный синтез является альтернативным способом, но это становится слишком дорого, когда размер пептидов превышает 25-30 аминокислотных остатков. Другая сложность состоит в том, что дефенсины отличаются особым расположением остатков цистеина, которое трудно создать с помощью химического синтеза.

Соответственно задачей настоящего изобретения является предложение способов для получения улучшенных уровней экспрессии антимикробных пептидов дефенсина в рекомбинантной ферментации мицелиальных грибов.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что путем вставки одной или нескольких интронных последовательностей в конструкцию нуклеиновой кислоты, которая направляет экспрессию дефенсина, уровень рекомбинантной экспрессии может быть улучшен более чем на 50% по сравнению с применением конструкции нуклеиновой кислоты без интронных последовательностей. Интронная последовательность(и) может быть вставлена в любое место конструкции нуклеиновой кислоты, такой как последовательность, кодирующая зрелый дефенсин, или даже в последовательность, кодирующую сигнальный пептид.

Соответственно настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину мицелиальных грибов, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, которая содержит чужеродную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую дефенсин, и одну или несколько интронных последовательностей.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу рекомбинантной продукции дефенсина в клетке-хозяине мицелиальных грибов, который включает культивирование клетки-хозяина мицелиальных грибов, содержащей конструкцию нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид дефенсина, и одну или несколько интронных последовательностей; и получение пептида дефенсина.

В третьем аспекте изобретение относится к применению конструкции нуклеиновой кислоты, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид дефенсина и одну или несколько интронных последовательностей для улучшения уровня рекомбинантной экспрессии дефенсина в клетке-хозяине мицелиальных грибов.

Определения

Антимикробная активность: термин «антимикробная активность» обозначает здесь активность, способную уничтожать микробные клетки или ингибировать их рост. В контексте настоящего изобретения подразумевается, что термин «антимикробный» обозначает, что существует бактерицидный, и/или бактериостатический, и/или фунгицидный, и/или фунгистатический эффект, и/или вироцидный эффект, где термин «бактерицидный» следует понимать, как способный уничтожать бактериальные клетки. Термин «бактериостатический» следует понимать, как способный ингибировать бактериальный рост, т.е. ингибировать рост бактериальных клеток. Термин «фунгицидальный» следует понимать как способный уничтожать клетки грибов. Термин «фунгостатический» следует понимать, как способный ингибировать рост грибов, т.е. ингибировать рост клеток грибов. Термин «вироцидный» следует понимать, как способный инактивировать вирус. Термин «микробные клетки» обозначает бактериальные клетки или клетки грибов (включая дрожжи).

В контексте настоящего изобретения подразумевается, что термин «ингибирование роста микробных клеток» обозначает, что клетки не находятся в стадии роста, т.е. они не имеют возможности репродуцироваться.

Для целей настоящего изобретения антимикробная активность может быть определена согласно процедуре, описанной Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991). В качестве альтернативы антимикробная активность может быть определена согласно NCCLS рекомендациям из CLSI (Института Клинических и Лабораторных Стандартов; широко известного, как Национальный Комитет по Клиническим и Лабораторным Стандартам).

Дефенсины, имеющие антимикробную активность, могут иметь способность уменьшать количество живых клеток Escherichia coli (DSM 1576) до 1 из 100 после 8 часов (предпочтительно, после 4 часов, более предпочтительно, после 2 часов, наиболее предпочтительно, после 1 часа и в особенности, после 30 минут) инкубации при 20°С в водном растворе 25% (масс./масс.) дефенсина, имеющего антимикробную активность; предпочтительно, в 10% (масс./масс.) водном растворе; более предпочтительно, в 5% (масс./масс.) водном растворе; еще более предпочтительно, в 1% (масс./масс.) водном растворе; наиболее предпочтительно, в 0,5% (масс./масс.) водном растворе; и, в особенности, в водном растворе 0,1% (масс./масс.) дефенсина, имеющего антимикробную активность.

Дефенсины, имеющие антимикробную активность, могут также иметь способность ингибировать разрастание Escherichia coli (DSM 1576) в течение 24 часов при 25°С в микробном субстрате роста при добавлении в концентрации 1000 м.д.; предпочтительно, при добавлении в концентрации 500 м.д.; более предпочтительно, при добавлении в концентрации 250 м.д.; еще более предпочтительно, при добавлении в концентрации 100 м.д.; наиболее предпочтительно, при добавлении в концентрации 50 м.д.; и, в особенности, при добавлении в концентрации 25 м.д. Дефенсины, имеющие антимикробную активность, могут иметь способность уменьшать количество живых клеток Bacillus subtilis (ATCC 6633) до 1 из 100 после 8 часов (предпочтительно, после 4 часов, более предпочтительно, после 2 часов, наиболее предпочтительно, после 1 часа и, в особенности, после 30 минут) инкубации при 20°С в водном растворе 25% (масс./масс.) дефенсина, имеющего антимикробную активность; предпочтительно в 10% (масс./масс.) водном растворе; более предпочтительно в 5% (масс./масс.) водном растворе; еще более предпочтительно в 1% (масс./масс.) водном растворе; наиболее предпочтительно в 0,5% (масс./масс.) водном растворе; и в особенности в водном растворе 0,1% (масс./масс.) дефенсина, имеющего антимикробную активность.

Дефенсины, имеющие антимикробную активность, могут также иметь способность ингибировать разрастание Bacillus subtilis (ATCC 6633) в течение 24 часов при 25°С в микробном субстрате роста при добавлении в концентрации 1000 м.д.; предпочтительно, при добавлении в концентрации 500 м.д.; более предпочтительно, при добавлении в концентрации 250 м.д.; еще более предпочтительно, при добавлении в концентрации 100 м.д.; наиболее предпочтительно, при добавлении в концентрации 50 м.д.; и, в особенности, при добавлении в концентрации 25 м.д.

Дефенсины по настоящему изобретению имеют, по меньшей мере, 20%, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 95%, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 100% антимикробной активности дефенсина, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-42 SEQ ID NO:2.

кДНК: Термин «кДНК» обозначает здесь молекулу ДНК, которая может быть получена путем обратной транскрипции из зрелой сплайсированной молекулы мРНК, полученной в эукариотической клетке. кДНК лишена интронных последовательностей, которые обычно присутствуют в соответствующей геномной ДНК. Исходный первичный транскрипт РНК является предшественником мРНК, который процессируется через серию стадий, перед тем как появится в виде зрелой сплайсированной мРНК. Эти стадии включают удаление интронных последовательностей с помощью процесса, называемого сплайсингом. кДНК, полученная из мРНК, лишена, таким образом, любых интронных последовательностей.

Конструкция нуклеиновой кислоты: Термин «конструкция нуклеиновой кислоты», использованный здесь, имеет отношение к молекуле нуклеиновой кислоты как одноцепочечной, так и двухцепочечной, которая выделена из существующего в природе гена или которая модифицирована таким образом, что содержит сегменты нуклеиновых кислот, которые иначе не могли бы существовать в природе. Термин «конструкция нуклеиновой кислоты» является синонимом термину «экспрессирующая кассета», когда конструкция нуклеиновой кислоты содержит контрольные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности настоящего изобретения.

Контрольная последовательность: Термин «контрольные последовательности» определяется здесь, как включающий все компоненты, которые необходимы или полезны для экспрессии полинуклеотида, кодирующего дефенсин. Каждая контрольная последовательность может быть нативной или чужеродной по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей дефенсин. Такие контрольные последовательности включают, но не ограничиваются ими, лидер, последовательность полиаденилирования, пропептидную последовательность, промотор, последовательность сигнального пептида и терминатор транскрипции. Минимально контрольные последовательности включают промотор и стоп-сигналы транскрипции и трансляции. Контрольные последовательности могут быть снабжены линкерами с целью введения специфических сайтов рестрикции, облегчающих лигирование контрольных последовательностей с кодирующей областью нуклеотидной последовательности, кодирующей дефенсин.

Функционально связанный: Термин «функционально связанный» обозначает здесь конфигурацию, в которой контрольная последовательность располагается в соответствующем положении по отношению к кодирующей последовательности полинуклеотидной последовательности, таким образом, что контрольная последовательность направляет экспрессию кодирующей последовательности дефенсина.

Кодирующая последовательность: При использовании здесь термин «кодирующая последовательность» обозначает нуклеотидную последовательность, которая непосредственно определяет аминокислотную последовательность ее белкового продукта. Границы кодирующей последовательности в основном определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается с ATG старт-кодона или альтернативного старт-кодона, такого как GTG или TTG. Кодирующая последовательность может быть ДНК, кДНК или рекомбинантной нуклеотидной последовательностью.

Экспрессия: Термин «экспрессия» включает любой шаг, вовлеченный в продукцию дефенсина, включая, но не ограничиваясь ими, транскрипцию, пост-транскрипционную модификацию, трансляцию, пост-трансляционную модификацию и секрецию.

Экспрессирующий вектор: Термин «экспрессирующий вектор» определяет здесь линейную или циклическую молекулу ДНК, которая содержит полинуклеотиды, кодирующие пептид дефенсина, который функционально связан с дополнительными нуклеотидами, которые обеспечивают его экспрессию.

Клетка-хозяин: Термин «клетка-хозяин», использованный здесь, включает любой тип клетки, который восприимчив к трансформации, трансфекции, трансдукции и к подобным операциям с конструкцией нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.

Модификация: Темин «модификация» обозначает здесь любую химическую модификацию дефенсина. Модификация(и) может быть как заменой(ами), делецией(ями) и/или вставкой(ами) аминокислоты(от), так и замещением(ями) в боковой цепи(ях) аминокислоты; или модификация может быть связана с применением неприродных аминокислот с похожими характеристиками в аминокислотной последовательности. В особенности модификации могут представлять собой амидирования, такие как амидирование по С-концу.

Идентичность: Сходство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывают с помощью параметра «идентичность».

Для целей настоящего изобретения степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями определяют с помощью программы FASTA, включенной в программный пакет FASTA (см. W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448; и W. R. Pearson (1990) “Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA”, Methods in Enzymology 183:63-98). Для количественной оценки матрикса использовали BLOSUM50, для штрафа пробела -12, для штрафа протяженного пробела -2.

Степень идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием того же алгоритма и пакета программного обеспечения, как описано выше. Для количественной оценки матрикса использовали идентичность матрикса, для штрафа пробела -16 и для штрафа протяженного пробела -4.

В качестве альтернативы сравнение двух аминокислотных последовательностей определяют с помощью программы Needle из EMBOSS пакета (http://emboss.org) версии 2.8.0. Программа Needle выполняет глобальный алгоритм сравнения, описанный в Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. Использованной заменой матрикса является BLOSUM62, штраф открытого пробела составляет 10 и штраф протяженного пробела составляет 0,5.

Степень идентичности между двумя аминокислотными последовательностями по настоящему изобретению («последовательность по изобретению», например, последовательность аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2) и различными аминокислотными последовательностями («чужеродная последовательность») рассчитывают как количество точных пар перекрывания при сравнении двух последовательностей, деленное на длину кратчайшей из двух последовательностей «последовательности по изобретению» или «чужеродной последовательности». Результат выражают в проценте идентичности.

Точная пара встречается, когда «последовательность по изобретению» и «чужеродная последовательность» имеют идентичные аминокислотные остатки в одних и тех же положениях перекрывания. Длиной последовательности является количество аминокислотных остатков в последовательности (например, длина последовательности аминокислот 1-40 SEQ ID NO:2-40).

Подробное описание

Дефенсины

Дефенсин по изобретению представляет собой любой антимикробный пептид, определяемый специалистом в данной области, как принадлежащий к дефенсинам - классу антимикробных пептидов. Чтобы определить, является ли антимикробный пептид дефенсином согласно изобретению, аминокислотную последовательность предпочтительно сравнивают со скрытой моделью профайлов Маркова(HMM профайлы) хорошо известной базы данных PFAM (см. Пример 6).

Дефенсины могут принадлежать к классу альфа-дефенсинов, классу бета-дефенсинов, классу тета-дефенсинов, классу дефенсинов членистоногих, классу дефенсинов насекомых, классу дефенсинов растений.

Дефенсины могут также быть синтетическими, обладающими при этом характерными чертами любого из классов дефенсинов.

В одном воплощении аминокислотная последовательность дефенсина согласно изобретению включает 4-9 или 10 остатков цистеина, предпочтительно, 6-9 или 10 остатков цистеина, более предпочтительно, 6, 8 или 10 остатков цистеина и, наиболее предпочтительно, 6 или 8 остатков цистеина.

Примеры дефенсинов включают, но не ограничиваются ими, α-Дефенсин HNP-1 (человеческий нейтрофильный пептид), HNP-2 и HNP-3; β-Дефенсин-12, Дрозомицин, Гелиомицин, γ1-пуротионин, Дефенсин насекомых А и дефенсины, описанные в РСТ заявках WO 9953053 (RHONE POULENC AGROCHIMIE) 1999-10-21 и WO 02085934 (ENTOMED) 2002-10-31, которые включены сюда посредством ссылки; или их представляют в виде зрелых аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:16 или аминокислотных последовательностей, идентичных этим аминокислотным последовательностям, по меньшей мере, на 60%, предпочтительно, на 70%, более предпочтительно, на 80%, еще более предпочтительно, на 90% и, наиболее предпочтительно, на 95%. Дефенсин согласно изобретению может в дальнейшем включать одну или несколько химических модификаций по сравнению с этими аминокислотными последовательностями.

Альфа-дефенсины могут быть определены как антимикробные пептиды, включающие аминокислотную последовательность:

С-Х₁-С-Х₂-С-Х₃-С-Х₄-С-С,

где Х₁ представляет 1 аминокислоту; предпочтительно, Х₁=Y, F, A, R, I, S, T, H или V; более предпочтительно, Х₁=Y, F, A или R; еще более предпочтительно, Х₁=Y или F; наиболее предпочтительно, Х₁=Y;

Х₂ представляет 4 или 5 аминокислот; предпочтительно, Х₂ представляет 4 аминокислоты; более предпочтительно, Х₂=Z₁-Z₂-Z₃-Z₄, где

Z₁ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₁=R, T или K; более предпочтительно, Z₁=R;

Z₂ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₂=R, I, T, K;

Z₃ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₃=R, P или G;

Z₄ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₄=G, A или R;

Х₃ представляет 9 аминокислот; предпочтительно, Х₃=Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇-G-Z₈, где

Z₁ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₁=K, L или R;

Z₂ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₂=R, F, A, S или G;

Z₃ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₃=R, G, P или T, более предпочтительно, Z₃=R или G;

Z₄ представляет любую аминокислоту; Z₄=E или Y; предпочтительно, Z₄=E;

Z₅ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₅=R, H или S;

Z₆ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₆=R, M или L;

Z₇ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₇=N, S, Y или I;

Z₈ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₈=T, S, Y или A;

Х₄ представляет 9 аминокислот; предпочтительно, Х₄=Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇-Z₈-Z₉, где

Z₁ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₁=R или I;

Z₂ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₂=K, I, Y, F или L;

Z₃ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₃=G, N, R или Q;

Z₄ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₄=G, H или N;

Z₅ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₅=R или L;

Z₆ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₆=I, L, M, V или R;

Z₇ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₇=Y, W, H или F;

Z₈ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₈=T, R или A;

Z₉ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₉=L, F или R; более предпочтительно, Z₉=L или F.

Бета-дефенсины могут быть определены как антимикробные пептиды, включающие аминокислотную последовательность:

С-Х₁-С-Х₂-С-Х₃-С-Х₄-С-С,

где

Х₁ представляет шесть аминокислот; предпочтительно, Х₁=Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆, где

Z₁ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₁=R, V или L;

Z₂ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₂=R, I, K или Q;

Z₃ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₃=N или S;

Z₄ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₄=G, K или R;

Z₅ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₅=G;

Z₆ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₆=Q, I, V или F;

Х₂ представляет 3 или 4 аминокислоты; предпочтительно, Х₂ представляет 4 аминокислоты; более предпочтительно, Х₂=Z₁-Z₂-Z₃-Z₄, где

Z₁ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₁=L, V, I, H или A;

Z₂ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₂=P или Y;

Z₃ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₃=S, I, N или G;

Z₄ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₄=R, A или S;

Х₃ представляет 9 аминокислот; предпочтительно, Х₃=Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆-Z₇-Z₈-Z₉, где

Z₁ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₁=P;

Z₂ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₂=G, I, R или P;

Z₃ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₃=Y, N, P, R, F или H;

Z₄ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₄=T, M или Y;

Z₅ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₅=R или K;

Z₆ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₆=Q или I;

Z₇ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₇=I или Q;

Z₈ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₈=S;

Z₉ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₉=T;

Х₄ представляет 6 аминокислот; предпочтительно, Х₄=Z₁-Z₂-Z₃-Z₄-Z₅-Z₆, где

Z₁ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₁=Y, F, G или L;

Z₂ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₂=G, H, P, L, R или T;

Z₃ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₃=G, P или R;

Z₄ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₄=K, P, R, G или Q;

Z₅ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₅=V, A, I или G;

Z₆ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₆=K.

Дефенсины насекомых могут быть определены как антимикробные пептиды, включающие аминокислотную последовательность:

С-Х₁-С-Х₂-С-Х₃-С-Х₄-С- Х₅-С,

где

Х₁ представляет 5-16 аминокислот;

Х₂ представляет 3 аминокислоты; предпочтительно, Х₂=Z₁-Z₂-Z₃, где

Z₁ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₁=A или H;

Z₂ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₂=A или R;

Z₃ представляет любую аминокислоту; предпочтительно, Z₃=H;

Х₃ представляет 9-11 аминокислот;

Х₄ представляет 4-10 аминокислот;

Х₅ представляет 1 аминокислоту; предпочтительно, Х₅=V, T, I, H, K, N или L.

В одном воплощении дефенсин по изобретению имеет более чем одну антимикробную активность, выбранную из антигрибковой активности, антибактериальной активности и антивирусной активности.

Дефенсин по изобретению может быть получен из микроорганизмов любого рода. Для целей настоящего изобретения термин «получен из», использованный здесь в связи с данным источником, будет обозначать, что дефенсин, кодируемый нуклеотидной последовательностью, получен с использованием этого источника или линии, в которую вставили нуклеотидную последовательность из этого источника. В предпочтительном аспекте дефенсин, полученный из данного источника, секретируется во внеклеточное пространство.

Дефенсин по настоящему изобретению может быть дефенсином грибов и, более предпочтительно, дрожжевым дефенсином, таким как дефенсин Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia; или более предпочтительно, дефенсином мицелиальных грибов, таким как дефенсин Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Miceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium или Trichoderma.

В предпочтительном аспекте дефенсин является дефенсином Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis или Saccharomyces oviformis, имеющим антимикробную активность.

В другом предпочтительном аспекте дефенсин является дефенсином Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochrowm, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei или Trichoderma viride.

Будет понятно, что для вышеуказанных видов изобретение охватывает как совершенные, так и несовершенные состояния, а также другие таксономические эквиваленты, например анаморфные, несмотря на названия видов, под которыми они известны. Для специалистов в данной области будет легко определить идентичность подходящих эквивалентов.

Линии этих видов коммерчески общедоступны из ряда коллекций клеточных культур, таких как Американская Типовая Коллекция Культур (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и из Коллекции Культур Сельскохозяйственной Исследовательской Патентной Службы, Северного Регионального Исследовательского Центра (NRRL).

Кроме того, такие дефенсины могут быть идентифицированы и получены из других источников, включая микроорганизмы, выделенные из природных источников (например, почвы, компоста, воды и т.д.) с использованием вышеупомянутых зондов. Методики для выделения микроорганизмов из природных источников хорошо известны из уровня техники. Полинуклеотид может затем быть получен путем подобного скрининга геномной или кДНК библиотеки другого микроорганизма. Как только полинуклеотидную последовательность, кодирующую дефенсин, детектируют с помощью зондов(а), полинуклеотид может быть выделен или клонирован с использованием методик, хорошо известных среднему специалисту в данной области (см., например, SAMBROOK, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2,: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ISBN 0879693096).

Дефенсины по настоящему изобретению также включают слитые дефенсины или расщепляемые слитые дефенсины, в которых другой дефенсин присоединяется к N-концу, или С-концу дефенсина, или его фрагмента. Слитый дефенсин получают путем присоединения нуклеотидной последовательности (или ее части), кодирующей другой дефенсин, к нуклеотидной последовательности (или ее части) по настоящему изобретению. Методики для получения слитых дефенсинов известны из уровня техники и включают лигирование последовательностей, кодирующих дефенсины, так, чтобы они находились в одной рамке считывания и чтобы экспрессия слитого дефенсина находилась под контролем одного и того же промотора(ов) и терминатора.

Последовательности нуклеиновых кислот

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, имеющим нуклеотидную последовательность, которая кодирует дефенсин по изобретению.

Примеры таких полинуклеотидов включают, но не ограничиваются ими, примеры, описанные в PCT заявке WO 99/53053, которая включена сюда посредством ссылки.

В предпочтительном воплощении нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 или в SEQ ID NO:15 настоящего изобретения. В другом предпочтительном воплощении нуклеотидной последовательностью является кодирующая область зрелого дефенсина из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 или из SEQ ID NO:15. Настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, которые кодируют дефенсин, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 или SEQ ID NO:16, или зрелый дефенсин этих последовательностей, который отличается от SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 или от SEQ ID NO:15 качеством вырожденности генетического кода.

Методики, которые использовали, чтобы выделить или клонировать полинуклеотид, кодирующий дефенсин, хорошо известны из уровня техники и включают выделение из геномной ДНК, получение из кДНК или их комбинацию. Клонирование полинуклеотидов, кодирующих дефенсины по изобретению, из такой геномной ДНК может быть осуществлено, например, с использованием хорошо известной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или с помощью скрининга с антителами экспрессионных библиотек, чтобы детектировать клонированные ДНК фрагменты с похожими структурными чертами (см., например, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York). Могут быть использованы другие процедуры амплификации нуклеиновых кислот, такие как лигазная цепная реакция (LCR), лигированная активированная транскрипция (LAT) и базирующаяся на нуклеотидной последовательности амплификация (NASBA). Полинуклеотиды могут быть клонированы из штаммов Eurotium, Aspergillus, Pseudoplectania, Crassostrea, Mesobuthus или из других, или из родственных организмов, и, таким образом, может существовать аллельный вариант или вариант по образцу области нуклеотидных последовательностей, кодирующей дефенсин.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, имеющим нуклеотидную последовательность, которая имеет степень идентичности с кодирующей зрелый дефенсин последовательностью SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 или в SEQ ID NO:15, по меньшей мере 60%, предпочтительно, по меньшей мере 65%, предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, более предпочтительно, по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 97% идентичности в области, которая кодирует антимикробный полипептид дефенсина.

Модификация нуклеотидной последовательности, кодирующей дефенсин по изобретению, может быть необходима для синтеза дефенсинов, по существу подобных дефенсину. Термин «по существу подобный» дефенсину имеет отношение к не встречающимся в природе формам дефенсина. Эти дефенсины могут отличаться в некоторых особенностях конструкции от дефенсина, выделенного из нативного источника, например искусственные варианты отличаются специфической активностью, термостабильностью, оптимальным значением рН или подобными. Вариант последовательности может быть сконструирован на базе нуклеотидной последовательности, представленной в виде кодирующей дефенсин области SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:15, например, в виде части этих последовательностей, и/или путем введения нуклеотидных замен, которые не приводят к созданию другой аминокислотной последовательности дефенсина, кодируемого этой нуклеотидной последовательностью, но которые соответствуют используемым организмом-хозяином кодонам, предназначенным для продукции белка, или путем введения нуклеотидных замен, которые могут привести к созданию другой аминокислотной последовательности. Для общего описания нуклеотидных замен см., например, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Для специалистов в данной области будет ясно, что такие замены могут быть произведены вне области, критичной для функции молекулы, и по-прежнему приведут к получению активного дефенсина. Аминокислотные остатки, которые существенны для активности дефенсина, и таким образом, предпочтительно, не подвергаются заменам, могут быть идентифицированы согласно процедурам, известным из уровня техники, таким как сайт-направленный мутагенез или сканирующий аланином мутагенез (см., например, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). В последней методике мутации вводят в каждый положительно заряженный остаток молекулы, и полученные мутантные молекулы тестируют на предмет антимикробной активности, чтобы идентифицировать аминокислотные остатки, критичные для активности молекулы. Сайты взаимодействия также могут быть определены путем анализа трехмерной структуры, определенной такими методиками, как анализ ядерного магнитного резонанса, кристаллография или фотоафинное мечение (см., например, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 244: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим дефенсин по изобретению, которые гибридизуются в условиях низкой жесткости, предпочтительно, в условиях средней жесткости, более предпочтительно, в условиях средне-высокой жесткости, еще более предпочтительно, в условиях высокой жесткости и, наиболее предпочтительно, в условиях очень высокой жесткости с (i) кодирующей зрелый пептид нуклеотидной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:15, (ii) с последовательностью кДНК, содержащейся в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:15, или (iii) с комплементарной цепью (i) или (ii); или с аллельными вариантами и частями этих последовательностей (Sambrook et al., 1989, выше), как здесь определено.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, полученным (a) путем гибридизации популяции ДНК при условиях низкой, средней, средне-высокой, высокой или очень высокой жесткости с (i) кодирующей зрелый дефенсин нуклеотидной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:15, (ii) с последовательностью кДНК, содержащейся в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:15, или (iii) с комплементарной цепью (i) или (ii); и (b) путем выделения гибридизующегося полинуклеотида, который кодирует полипептид, имеющий антимикробную активность.

Конструкции нуклеиновой кислоты

Настоящее изобретение также относится к конструкциям нуклеиновой кислоты, включающим полинуклеотид, кодирующий дефенсин по изобретению, функционально связанный с одной или несколькими контрольными последовательностями, которые направляют экспрессию кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине при условиях, совместимых с контрольными последовательностями.

Чтобы обеспечить экспрессию дефенсина, на полинуклеотид, кодирующий дефенсин по изобретению, можно воздействовать множеством способов. Воздействие на полинуклеотидную последовательность перед ее вставкой в вектор может быть желательным или необходимым в зависимости от экспрессирующего вектора. Методики модификации полинуклеотидных последовательностей, использующие методы рекомбинантной ДНК, хорошо известны из уровня техники.

Контрольной последовательностью может быть подходящая промоторная последовательность, нуклеотидная последовательность которой распознается клеткой-хозяином для экспрессии полинуклеотида, кодирующего дефенсин по изобретению. Промоторная последовательность содержит последовательности транскрипционного контроля, которые содействуют экспрессии дефенсина. Промотором может быть любая нуклеотидная последовательность, которая демонстрирует транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине, включая мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и может быть получена из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды как гомологичные, так и чужеродные для клетки-хозяина.

Примерами подходящих промоторов для направления транскрипции конструкций нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению в клетке-хозяине мицелиальных грибов служат промоторы, полученные из генов Aspergillus oryzae TAKA амилазы, Rhizomucor miehei аспарагиновой протеиназы, Aspergillus niger нейтральной альфа-амилазы, Aspergillus niger кислотоустойчивой альфа-амилазы, Aspergillus niger или Aspergillus awamori глюкоамилазы (glaA), Rhizomucor miehei липазы, Aspergillus oryzae щелочной протеазы, Aspergillus oryzae триозофосфат изомеразы, Aspergillus nidulans ацетамидазы, Fusarium venenatum амилоглюкозидазы (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), Fusarium oxysporum трипсин подобной протеазы (WO 96/00787), Trichoderma reesei бета-глюкозидазы, Trichoderma reesei целлобиогидролазы I, Trichoderma reesei эндоглюконазы I, Trichoderma reesei эндоглюконазы II, Trichoderma reesei эндоглюконазы III, Trichoderma reesei эндоглюконазы IV, Trichoderma reesei эндоглюконазы V, Trichoderma reesei ксилоназы I, Trichoderma reesei ксилоназы II, Trichoderma reesei бета-ксилозидазы, также как NA2-tpi промотор (гибрид промоторов генов Aspergillus niger нейтральной альфа-амилазы и Aspergillus oryzae триозофосфат изомеразы); а также их мутантные, усеченные и гибридные промоторы.

Контрольной последовательностью может также быть подходящая последовательность терминатора транскрипции, распознаваемая клеткой-хозяином при терминации транскрипции. Терминаторная последовательность функционально связана 3' концом нуклеотидной последовательности, кодирующей дефенсин. В настоящем