Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца

Способ обнаружения неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного физиологического образца

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу ранней диагностики неопластических заболеваний, таких как рак и предшествующие ему стадии, в частности рак дыхательных путей, рак мочевыделительной системы, рак репродуктивной системы, рак, ассоциированный с HPV-инфекцией, или рак аногенитального тракта, исходя из солюбилизированного физиологического образца.

Предшествующий уровень техники

Уже в середине пятидесятых годов были предложены программы по предупреждению рака различных типов. Во многих развитых странах существуют программы для широкого обследования населения в целях выявления рака шейки матки. Однако аналогичные программы обследования применимы и для других типов рака и предраковых состояний, таких как, например, рак мочевыделительной системы, рак дыхательных путей и т.п. В нижеследующем описании настоящего изобретения рак шейки матки служит лишь примером, на котором будут показаны недостатки современных профилактических мер. Однако после соответствующих изменений (mutandis mutatis) эти меры могут быть применены и для других программ по профилактике любых раковых заболеваний.

Что касается внутриэпителиальной неоплазии шейки матки и поражений гландулярного эпителия шейки матки, то программы по их профилактике основаны, главным образом, на морфологическом и цитологическом исследовании цитологических мазков шейки матки, которое называется Рар-тестом и которое проводят путем рутинного гинекологического обследования женщин, начиная с 20-летнего возраста, через определенные интервалы времени. В соответствии с морфологией клеток эти мазки подразделяют на различные степени интенсивности диспластических клеточных изменений. В соответствии с методом Рар I-V эти степени интенсивности клеточных изменений разделяются на следующие категории: нормальные клетки, легкая дисплазия, умеренная дисплазия, тяжелая дисплазия и инвазивная карцинома соответственно. Если Рар-тест дает неожиданный результат, то проводят биопсию с получением небольшого образца, который подвергают гистопатологическому анализу для определения типа и степени дисплазии, которая может быть классифицирована как внутриэпителиальная неоплазия шейки матки (CIN1-3).

Несмотря на профилактические программы, рак шейки матки, который ежегодно диагностируется у 400000 человек, является вторым по частоте встречаемости опухолевых заболеваний у женщин. Это, inter alia, обусловлено тем фактом, что примерно до 30% из всех результатов индивидуальных Рар-тестов являются ложноотрицательными.

В стандартном скрининг-анализе на внутриэпителиальную дисплазию шейки матки, проводимом для выявления неопластических поражений шейки матки, используются мазки. В этой скрининг-процедуре идентифицируются поражения различного происхождения. Причинами, вызывающими такие поражения, могут быть, например, воспаления (вызванные инфекционными агентами, либо физическими или химическими повреждениями) или неопластические изменения. При морфологическом анализе поражения различного характера трудно поддаются дифференциации. Так, например, для анализа цервикальных мазков и других мазков цитологи и патологи должны пройти особую подготовку, и даже опытные специалисты-диагносты при проведении диагностических анализов цитологических образцов получают результаты, которые в высокой степени отличаются как от наблюдений других сотрудников, так и от их собственных наблюдений. В основном, результат такого исследования основан на субъективной интерпретации диагностических критериев патологом/цитологом, проводящим исследование. В итоге, число ложноположительных и ложноотрицательных результатов в таких скрининг-анализах является недопустимо высоким.

Воспроизводимость результатов таких исследований может быть увеличена путем применения подтверждающих молекулярных методов. Однако проблема, связанная с хранением и получением образцов, не может быть решена лишь дополнительным использованием молекулярных маркеров. Еще одной проблемой, с которой сталкиваются цитологи или гистологи при проведении скрининга, в частности, при осуществлении методов детектирования молекулярных маркеров, является необходимость соблюдать строгие меры предосторожности при хранении образцов для предотвращения образования артефактов или получения ложных результатов.

Это обусловлено, отчасти, ненадежностью информации о морфологии клеток и, отчасти, нестабильностью молекулярных маркеров, детектируемых во время проведения тестов. Если приготовление, транспортировка или хранение образцов не соблюдается надлежащим образом, то информация о клетках или даже молекулярная информация может быть вообще утрачена или искажена. Поэтому в данном случае диагноз не может быть установлен, либо он может быть искажен артефактами. Так, например, интерпретация биоптата или цитологических препаратов часто значительно затруднена или вообще невозможна из-за повреждения клеток (физического или биохимического). Кроме того, что касается образцов ткани или биоптатов, то сохранение молекулярной структуры образцов, которые подвергаются быстрому метаболизму, представляется довольно трудной задачей, поскольку до помещения всего образца в соответствующие консерванты проходит много времени.

Хотя программы по профилактике неопластических поражений были рассмотрены выше на примере рака шейки матки, однако, в основном, такие программы могут быть также направлены и на лечение других раковых заболеваний, поскольку в их течении наблюдаются почти те же самые ситуации. Диагностические методы, подтверждаемые морфологическими анализами и осуществляемые в соответствии со стандартными процедурами, имеют два главных недостатка. Во-первых, эти методы в высокой степени зависят от субъективной оценки исследователя. Во-вторых, информация, полученная в морфологических исследованиях, является достаточно чувствительной к процессам разрушения клеток, и поэтому она может приводить к возникновению артефактов после получения образцов. Оба этих аспекта являются причиной плохой воспроизводимости результатов.

Поэтому целью настоящего изобретения является разработка метода, с помощью которого могут быть надежно и на ранней стадии диагностированы неопластические поражения, такие как рак и предшествующие ему стадии. Кроме того, этот метод позволяет дифференцировать доброкачественные воспалительные состояния или метапластические изменения от неопластических поражений, таких как дисплазии и предрак. Более того, настоящее изобретение относится к способам выявления рака на биохимическом уровне исходя из солюбилизированных образцов. Такими образцами могут быть любые образцы, включая клетки в консервирующем растворе, используемом в методах цитологического анализа в растворе (LBC).

В другом аспекте настоящего изобретения авторы настоящего изобретения рассматривают использование LBC-образцов в качестве источников исследуемого материала в целях разработки диагностических тест-наборов для неклеточного биохимического анализа для диагностики клинически релевантных состояний. Рассматриваемые LBC-образцы используются для разработки анализов клеточного формата. Однако лизис образцов в описанном здесь способе дает авторам настоящего изобретения базу для разработки наборов для биохимического анализа образцов материала, которые являются подходящими для получения информации о статусе заболевания пациента, диагностированного в результате проведения других диагностических процедур, исходя из того же самого материала образца.

Способ детектирования нуклеиновой кислоты HPV в образцах LBC описан Digene Corp. В этом способе в качестве базы для проведения анализа используются LBC-образцы. Детектирование нуклеиновой кислоты HPV осуществляют после лизиса клеток, содержащихся в LBC-образцах. В этом методе количество LBC-образца, используемого в биохимическом неклеточном детектировании нуклеиновой кислоты HPV, не нормализуют в отношении информации, полученной исходя из цитологического образца, взятого из того же самого LBC-образца. Поэтому способ, описанный Digene, ограничен лишь качественными измерениями. Любой количественный или даже полуколичественный метод, основанный на неклеточном биохимическом анализе, требует наличия информации относительно состава образцов, получаемой либо с помощью биохимических маркеров, либо из анализов образца с помощью микроскопа или проточной цитометрии. В настоящем изобретении использование LBC-образцов в целях установления диагноза или разработки наборов и in vitro диагностических устройств позволяет проводить точный и сравнительный анализ с получением цитологической информации, которая может быть использована в биохимических неклеточных тестах. В этих случаях не требуется биохимической нормализации по отношению к маркерам, которые являются индикаторами присутствия или отсутствия клеток или типов клеток. Преимущество использования LBC-образцов заключается в том, что цитологическая информация поступает непосредственно из гомогенного LBC-образца, что позволяет получить надежные и точные данные, которые могут быть использованы для оценки результатов биохимических неклеточных тестов.

С другой стороны, способ детектирования молекулярных маркеров на уровне белков или нуклеиновых кислот в солюбилизированных образцах описан в различных публикациях. Однако в этих публикациях не приводится каких-либо упоминаний, связанных с использованием LBC-образцов в качестве источника для взятия препаратов проб. В общих чертах, LBC-методы используются специалистами для более точной морфологической оценки цитологических препаратов. Поэтому область применения LBC-образцов предусматривает их применение лишь в цитологии. Исходя из описаний предшествующих работ, можно отметить, что в этих работах не рассматривается использование LBC-образца для последующей его солюбилизации в целях проведения биохимического анализа. Кроме того, в этих работах в любом из методов, который не основан на проведении клеточной морфологической оценки образцов, описаны преимущества LBC-процедур, и ничего не сказано о применении LBC-образцов. В соответствии с данными, полученными авторами настоящего изобретения, использование LBC-образцов в качестве источников для биохимических неклеточных анализов на определение уровней белка в солюбилизированных образцах, дает то преимущество, что полученные результаты могут непосредственно сравниваться с результатами цитологического анализа образца. В этой связи биохимический анализ белка может служить в качестве предварительного теста или для получения дополнительной информации, или даже для подтверждения цитологически неоднозначного результата. В других вариантах осуществления изобретения информация, полученная из биохимических неклеточных тестов, может быть использована для разработки процедур цитологического анализа.

Поэтому разработка описанного здесь способа имеет важное значение для достижения эффективных и надежных наборов и устройств для диагностики in vitro. Способ для разработки описанных здесь наборов и устройств для диагностики in vitro позволяет осуществлять сравнение результатов, полученных в биохимических неклеточных анализах, с результатами цитологических анализов посредством нормализации. Такую нормализацию образца для его применения в формате биохимического теста осуществляют по отношению к данным LBC-образца, полученным из его цитологического анализа. Такая информация включает, например, объем клеточного содержимого в LBC-образце, объем LBC-образца, массу образца или параметры, которые могут быть определены только путем приготовления тонкослойного препарата из LBC-образца. В соответствии с этим авторами настоящего изобретения заявлены способы, которые являются надежными способами для получения наборов и устройств для диагностики in vitro с использованием LBC-образцов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу диагностики неопластических заболеваний исходя из солюбилизированного образца, взятого у пациента. Этот способ включает стадии (а) взятия физиологического образца у индивидуума, (b) солюбилизации указанного физиологического образца в среде для лизиса и (с) определения сверхэкспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы в солюбилизированном образце путем сравнения уровня указанного ингибитора циклин-зависимой киназы в указанном солюбилизированном образце с уровнем указанного ингибитора, присутствующего в солюбилизированном образце здорового человека. Образцами, используемыми в способе настоящего изобретения, могут быть любые образцы, включая клетки в растворе для консервации клеток, используемом в цитологических методах, осуществляемых в растворе.

Настоящее изобретение также относится к тест-набору для определения уровня ингибиторов циклин-зависимой киназы, включающему зонды, специфичные для указанного ингибитора циклин-зависимой киназы, и среду для лизиса, используемую для солюбилизации физиологического образца. Указанный тест-набор может представлять собой устройство для диагностики in vitro.

В некоторых своих вариантах настоящее изобретение относится к набору, используемому в качестве устройства для диагностики in vitro. Кроме того, настоящее изобретение также относится к устройству для диагностики in vitro, содержащему зонды, направленные против ингибитора циклин-зависимой киназы и фиксированные на твердых носителях, где указанное устройство предназначено для измерения уровня ингибитора циклин-зависимой киназы в солюбилизированном образце.

Настоящее изобретение также относится к способу получения наборов и устройств для диагностики in vitro в целях установления диагноза клинически релевантных состояний с использованием солюбилизированных физиологических образцов, где указанный способ осуществляют с использованием физиологических образцов, приготовленных в среде для консервации клеток, и где указанные консервированные клетки предназначаются и приготавливаются для их использования в способах цитологического анализа, таких как способы цитологического анализа в растворе. Образцы, применяемые в способах цитологического анализа в растворе (далее называемые LBC-образцами), солюбилизируют в соответствующей среде для лизиса и используют в целях разработки эффективных наборов и устройств для диагностики in vitro клинически релевантных состояний путем проведения биохимических неклеточных анализов солюбилизированных образцов.

Настоящее изобретение также относится к способу установления диагноза клинически релевантных состояний путем проведения биохимического неклеточного анализа на присутствие или отсутствие или на уровень маркерной молекулы в солюбилизированных физиологических образцах, где указанным физиологическим образцом является LBC-образец, и где детектирование маркерных молекул осуществляют путем определения наличия или отсутствия белков, пептидов, нуклеиновых кислот или их фрагментов в указанных солюбилизированных образцах и/или определения их уровней. Маркерные молекулы, которые могут быть использованы в этом способе, описаны выше как “маркерные молекулы, ассоциированные с клинически релевантными состояниями”. Этот способ может быть применен для диагностики любого клинически релевантного состояния.

Краткое описание графического материала

На фигуре 1 представлены значения OD, полученные в ELISA-тесте на детектирование уровней p16^INK4a в солюбилизированных цервикальных образцах; подробное описание эксперимента см. в примере 1.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на предположении авторов изобретения о том, что при многих неопластических заболеваниях, таких как рак, например, рак дыхательных путей, рак мочевыделительной системы, рак репродуктивной системы, рак, ассоциированный с HPV-инфекцией, или рак аногенитального тракта, в частности рак шейки матки, и предшествующие стадии вышеуказанных раковых заболеваний, соответственно, происходит сверхэкспрессия продуктов гена ингибиторов циклин-зависимой киназы. Примерами ингибиторов циклин-зависимой киназы являются белки р14, p15^INK4b, p16^INK4a, p18^INK4c, p19^INK4d, p21^WAF1/CIP1 и p27^KIP1. В контексте настоящего изобретения термин “ингибитор циклин-зависимой киназы” также включает белок-регулятор клеточного цикла p14^ARF, который по своей функции не является ингибитором циклин-зависимой киназы.

Заявителем было также обнаружено, что степень сверхэкспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы, определяемая в цитологических образцах, коррелирует со степенью дисплазии, определяемой в соответствующих гистологических образцах.

В соответствии с настоящим изобретением заявителями был предложен способ ранней диагностики неопластических заболеваний, таких как раковые заболевания и предшествующие им стадии, где указанный способ предусматривает установление сверхэкспрессии ингибиторов циклин-зависимой киназы в физиологическом образце.

В соответствии с настоящим изобретением процедуры цитологического и/или гистологического анализа подтверждаются с помощью молекулярных маркеров. Такие маркеры могут быть, например, использованы в реакциях иммуноцитохимического окрашивания, или в реакциях гибридизации in situ. Комбинирование морфологических исследований и реакций иммуноцитохимического окрашивания, проводимых с использованием маркерных молекул, характерных для неопластических заболеваний, таких как рак, например рак шейки матки, рак мочевого пузыря или легких, может давать лучшие результаты. Морфологическое исследование, даже при его комбинировании с молекулярными методами, которые дают более надежный результат, пока еще остается трудоемким и дорогостоящим методом, требующим много времени. Кроме того, диагноз, поставленный на основе данных клеточно-морфологического анализа, даже при его подтверждении молекулярными параметрами, зависит от субъективной оценки морфологии отдельными специалистами. Таким образом, диагноз зависит от специалиста, проводящего исследование.

Авторами настоящего изобретения, кроме того, было показано, что в определенных случаях молекулярные маркеры могут быть использованы в качестве диагностических средств, не требующих дополнительного подтверждения путем проведения морфологического исследования клеток. Методы диагностики неопластических заболеваний, таких как рак, осуществляемые лишь на молекулярном уровне и не подтвержденные информацией о морфологии клеток, ограничены лишь теми случаями, где используются маркеры или уровни маркеров, которые являются строго специфическими для диагностируемого состояния. Особенно это относится к тем случаям, когда маркерами являются вещества, не происходящие от организма человека. Так, например, обнаружение вирусных инфекций может быть осуществлено в растворах образцов, поскольку маркеры, указывающие на присутствие вирусов в тканях, не обнаруживаются в нормальных тканях человека.

Однако авторами настоящего изобретения было обнаружено, что некоторые ингибиторы циклин-зависимой киназы человека могут служить в качестве маркера ракового заболевания в процедурах детектирования с использованием биохимических маркеров, хотя в любой нормальной пролиферирующей человеческой клетке, в определенных фазах клеточного цикла, этот белок регуляции клеточного цикла экспрессируется на низком уровне.

Ингибиторами циклин-зависимой киназы, используемыми в настоящем изобретении, являются р14, p15^INK4b, p16^INK4a, p18^INK4c, p19^INK4d, p21^WAF1/CIP1 и p27^KIP1. В описанном здесь способе, помимо ингибиторов циклин-зависимой киназы, может быть также использован белок регуляции клеточного цикла p14^ARF, кодируемый альтернативной рамкой считывания гена p16^INK4a. Для удобства в контексте настоящего изобретения термин “ингибитор циклин-зависимой киназы” также включает белок-регулятор клеточного цикла p14^ARF, который по своей функции не является ингибитором циклин-зависимой киназы.

Используемые здесь термины “р16” или “ингибитор циклин-зависимой киназы p16^INK4a” означают ингибитор циклин-зависимой киназы p16^INK4a (также обозначаемый CDKN2 или MTS1), ген которого локализован в области хромосомы 9р21. p16^INK4a впервые был описан Serrano M., et al., Nature, 1993, Dec 16; 366(6456):704-7. Термины “p16^INK4a” или “ингибитор циклин-зависимой киназы p16^INK4a”, используемые в контексте настоящего изобретения во всех грамматических формах, означают нуклеиновую кислоту, а также полипептидные молекулы. Термины “p16^INK4a ” или “ингибитор циклин-зависимой киназы p16^INK4a” также включают, например, РНК (мРНК, чРНК и т.п.), ДНК (кДНК, геномную ДНК и т.п.), белки, полипептиды, протеогликаны, гликопротеины и соответствующие фрагменты этих молекул.

Используемый здесь термин “уровень” ингибиторов циклин-зависимой киназы или других маркерных молекул означает полуколичественную, а также количественную величину, относящуюся к количеству соответствующего маркера (ингибиторов циклин-зависимой киназы или других маркерных молекул), присутствующего в образце. Количественная величина может быть, например, определена как концентрация. Полуколичественная величина может быть выражена в виде шкалы уровней, например, неопределяемых уровней, низких уровней, промежуточных уровней, высоких уровней, или любым другим подходящим способом. Уровень маркера, такого как p16^INK4a, может быть также представлен как зависимый параметр, такой как интенсивность сигнала, генерируемого в формате анализа в ответ на присутствие, например, ингибитора циклин-зависимой киназы. В некоторых вариантах осуществления изобретения термин “уровень” может также означать качественную величину, определяющую присутствие маркерной молекулы.

Вследствие экспрессии ингибиторов циклин-зависимой киназы (например, p16^INK4a) в некоторых доброкачественных клетках, присутствующих в физиологическом образце (например, в цервикальных образцах, в образцах, взятых из полости рта, в моче, мокроте и т.п.), установление диагноза неопластического заболевания, исходя только из уровня ингибиторов циклин-зависимой киназы, но без дополнительной информации о морфологии клеток, представляет определенные трудности или вовсе невозможно. Специалистам известно, что в определенном количестве цервикальных образцов, составляющем до 30%, лишь некоторые из многих метапластических клеток могут оказаться иммунореактивными по отношению к ингибитору циклин-зависимой киназы p16^INK4a на умеренном или на высоком уровне. Кроме того, клетки эндометрия, которые в некоторых случаях могут присутствовать в цервикальных мазках, могут оказаться позитивными по p16^INK4a. В цитологических или гистологических тест-процедурах этот факт не влияет на установление диагноза, поскольку клетки этого типа могут быть легко идентифицированы от диспластических клеток по их клеточной морфологии.

Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что определение пороговой величины ингибиторов циклин-зависимой киназы (например, p16^INK4a) позволяет выявлять или диагностировать дисплазию даже без какой-либо информации о клеточной морфологии.

Термин “неопластические заболевания”, используемый в контексте настоящего изобретения во всех его грамматических формах, означает рак любого вида и происхождения и его предшествующие стадии соответственно. В соответствии с этим термин “неопластическое заболевание” включает рассматриваемое здесь поражение, называемое “неоплазией”, “неоплазмой”, “раком”, “предраком” или “опухолью”. Кроме того, в объем используемого здесь термина “неопластическое заболевание” входит также цитологический аналог, идентифицируемый в гистологической патологии как “диспластическое поражение” или “дисплазия”.

Неопластические заболевания, для диагностики которых применяются способы настоящего изобретения, включают, например, неопластические поражения дыхательных путей, рак мочевыделительной системы, рак желудочно-кишечного тракта, рак аногенитального тракта, а также неопластические заболевания, ассоциированные с HPV-инфекцией и др. Такими заболеваниями могут быть рак дыхательных путей, мочевыделительной системы, репродуктивной системы или рак аногенитального тракта, рак, ассоциированный с HPV-инфекцией, и, в частности, рак шейки матки. Что касается последнего заболевания, то в этой связи могут быть упомянуты его предшествующие стадии, например, внутриэпителиальная неоплазия шейки матки (CINI-III), карцинома in situ (CIS) и т.п. Термин “предшествующие стадии”, используемый здесь во всех его грамматических формах, включает все предшествующие стадии рака и предрак или любые другие злокачественные заболевания. Используемый здесь термин “предрак шейки матки” или его “предшествующие стадии” может, например, означать стадии внутриэпителиальной неоплазии шейки матки, идентифицированные в соответствии с такими системами классификации, как, например, классификация CIN (CIN I-CIN III), классификация РАР (РАР I-РАР V) или классификация Bethesda (NILM, LSIL, HSIL).

Термин “рак дыхательных путей” может означать любое злокачественное заболевание дыхательных путей, такое как, например, рак легких, рак альвеол, рак бронхиол, рак бронхиального дерева и рак бронхов, рак носоглотки, рак ротовой полости, рак гортани, рак носовой полости и околоносовой пазухи. К раку легких относится мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточная карцинома легких, мелкоклеточная карцинома легких, аденокарцинома легких, крупноклеточная карцинома легких, плоскоклеточная аденокарцинома легких, карциноидная опухоль легких, опухоль бронхиальных желез или (злокачественная) мезотелиома. Общее описание опухолей дыхательных путей можно найти в работе Colby T.V. et al.: Tumors of the Lower Respiratory Tract, Atlas of Tumor Pathology, Third Series, Fascicle 13, AFIP: Washington 1995”, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Опухоли мочевыделительной системы могут включать рак мочевого пузыря, рак почек, рак почечной лоханки, рак мочеточника, рак уретры и т.п. Опухоли репродуктивной системы могут включать рак и предрак яичника, матки, яичек, предстательной железы, эпидидимиса и т.п.

В некоторых вариантах осуществления изобретения термин “неопластическое заболевание”, в общих чертах, относится к HPV-ассоциированным неопластическим заболеваниям. В соответствии с этим настоящее изобретение применяется к HPV-ассоциированным неопластическим заболеваниям, и особенно у индивидуумов с высоким риском HPV-инфицирования и у индивидуумов с HPV слизистой. HPV-инфекция высокого риска может включать подтипы HPV, такие как HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 и 58. Маркеры HPV-инфекции могут включать продукты экспрессии генов HPV, таких как L1, L2, Е2, Е4, Е5, Е6 или Е7.

Термин “физиологический образец” включает любые физиологические образцы любого типа и природы. Примерами таких физиологических образцов являются секреты, тампонированные мазки, лаважи, физиологические жидкости, сперма, образцы клеток и тканей, кровь, мазки, мокрота, моча, кал, цереброспинальные жидкости, желчь, желудочно-кишечные секреты, лимфа, костный мозг, аспираты и биоптаты органов, такие как биоптаты, взятые иглой или щипцами, и аспираты, взятые тонкой иглой. В частности, взятие цитологических мазков, тампонированных мазков и биопсии показаны в том случае, когда речь идет о выявлении аногенитального рака, например рака шейки матки. Термин “биопсия”, используемый в описании изобретения, включает все виды биопсии, известные специалистам. Таким образом, термин “биопсия”, используемый в контексте настоящего изобретения, может включать, например, образцы, полученные при резекции опухолей, образцы тканей, полученные эндоскопическими методами, или биоптаты органов, полученные с помощью щипцов или иглы. Термин “биопсия” включает образцы, полученные несколькими различными методами, такими как биопсия с помощью замораживающего микротома, LEEP-биопсия (процедура биопсии с помощью электрокатетера-петли) и т.п.

Термин “физиологические образцы”, используемый в контексте настоящего изобретения, может включать образцы фиксированных или консервированных клеток или тканей. Образцы клеток или тканей могут, например, храниться в стандартной коллекции образцов, в средах для консервации или в средах для транспортировки, известных специалистам, таких как, например, коммерчески доступная среда для консервации (раствор формалина, Cytyc “PreservCyt” или “CytoLyt”, Digene “Universal Collection Medium”, Tripath Imaging “Cytorich” и т.п.). В одном из вариантов осуществления изобретения образцами клеток или тканей, приготовленными в стандартной среде для сбора образцов, являются цитологические образцы в растворе (LBC-образцы), которые получают методами, применяемыми для приготовления цитологических LBC-образцов, или аналогичными методами, известными специалистам. Подходящая среда для консервации клеток может содержать смесь одного или нескольких веществ, выбранных из группы, включающей спирты, альдегиды, кетоны, кислоты, ионы металлов или сублиматы, а также простые эфиры и т.п., используемые для консервации клеточных компонентов. Спирты включают метанол, этанол, н- или изопропанол, н-, изо- или трет-бутанол или высшие разветвленные или неразветвленные спирты. Альдегиды включают формальдегид, ацетальдегид, глутаральдегид и т.п. Могут быть также использованы кетоны, такие как ацетон. Кислоты, используемые в стандартной среде для образцов, включают органические кислоты (уксусную кислоту, трихлоруксусную кислоту, салициловую кислоту, пикриновую кислоту) или неорганические кислоты, такие как, например, хромовая кислота. Стандартные растворы образцов могут содержать металлы, такие как серебро, медь, хром, ртуть, осмий и уран. Компонентами среды для консервации могут быть растворы солей, такие как уранилацетат, бихромат калия, сульфат аммония и т.п.

Клетки, консервированные в подходящей среде (спирте и т.п.), или образцы фиксированных тканей могут быть использованы в качестве исходных образцов в способах настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения физиологический образец может, например, содержать образец мокроты, цервикальный мазок, мазок, взятый из полости рта, мазок, взятый из уретры, или т.п., которые могут быть перенесены в среду для консервации, содержащую спирт.

Кроме того, в описанных здесь способах могут быть использованы физиологические образцы, которые были подвергнуты клеточному лизису сразу после их получения. Авторами настоящего изобретения был разработан ряд надежных, быстрых и простых способов сохранения молекулярных свойств образцов для предотвращения потери морфологической информации, которую содержат данные образцы. Такие образцы могут быть, например, получены в воспроизводимой и удобной для хранения и транспортировки форме путем солюбилизации клеточных компонентов исходного образца в подходящей среде для лизиса сразу после получения этого образца или даже во время его получения. Физиологические жидкости могут быть непосредственно взяты из организма индивидуума и перенесены в среду, содержащую подходящие детергенты и консерванты. Кроме того, образцы тканей могут быть непосредственно перенесены в условия денатурирующего лизиса (фактически поддерживаемые физическими силами), и, таким образом, они могут быть сохранены. Молекулярные компоненты исходного образца могут быть сохранены с использованием соответствующих ингредиентов в среде для лизиса, и поэтому они не могут подвергаться деградации. Деградация ферментативных активностей может быть, например, минимизирована с использованием ингибиторов ферментов. Таким образом, раствор тест-образцов в указанной среде для лизиса может легко сохранять молекулярные свойства тест-образца в процессе солюбилизации.

В соответствии с настоящим изобретением физиологические образцы могут быть солюбилизированы в любой подходящей среде для лизиса. Такой средой для лизиса могут быть, например, водные растворы хаотропных агентов, таких как мочевина, GuaSCN, формамид, водные растворы детергентов, таких как анионогенные детергенты (например, ДСН, N-лаурилсаркозин, дезоксихолат натрия, алкиларилсульфонаты, сульфаты длинноцепочечных (жирных) спиртов, сульфаты и сульфонаты олефинов, сульфаты и сульфонаты альфа-олефинов, сульфированные моноглицериды, сульфированные эфиры, сульфосукцинаты, алкансульфонаты, сложные эфиры фосфорной кислоты, алкилизетионаты, сложные эфиры сахарозы), катионогенные детергенты (например, хлорид цетилтриметиламмония), неионогенные детергенты (например, Твин-20, Nonidet P-40, Тритон Х-100, NP-40, Igepal CA-630, N-октилглюкозид) или амфотерные детергенты (например, CHAPS, 3-додецилдиметиламмонийпропан-1-сульфонат, оксид лаурилдиметиламина) и/или водные растворы гидроксидов щелочных металлов, таких как, например, NaOH или КОН. В основном, в качестве растворителя в среде для лизиса настоящего изобретения может быть использована любая подходящая жидкость. Такой жидкостью может быть органическая или неорганическая жидкость, чистая жидкость, смесь жидкостей или раствора веществ в этой жидкости, и такая жидкость может содержать добавки, улучшающие свойства растворителя. В некоторых вариантах настоящего изобретения, если лизис клеток может быть достигнут без использования детергентов, то в качестве растворителя могут быть использованы гипер- или гипотонические растворы или буферы, или просто вода или органическая жидкость. Любая жидкость, подходящая для полной или частичной солюбилизации клеточных компонентов физиологических образцов, может рассматриваться в описании настоящего изобретения как среда для лизиса. Таким образом, используемая здесь среда для лизиса необязательно должна содержать буферные вещества или обладать буферной емкостью. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения среда для лизиса может обладать буферной емкостью и может содержать буферные вещества.

В одном из вариантов осуществления изобретения среду для лизиса получают так, чтобы клетки, клеточный дебрис, нуклеиновые кислоты, полипептиды, липиды и другие биомолекулы, которые, возможно, присутствуют в исходном образце, были солюбилизированы. В других вариантах изобретения растворитель может быть выбран так, чтобы он обеспечивал дифференциальную солюбилизацию конкретных компонентов физиологического образца, но при этом другие компоненты оставались бы несолюбилизированными.

Среда для лизиса, предназначенная для солюбилизации физиологического образца, в соответствии с настоящим изобретением, может, кроме того, содержать один или несколько агентов, предотвращающих деградацию компонентов в данных исходных образцах. Такими компонентами могут быть, например, ингибиторы ферментов, такие как ингибиторы протеиназы, ингибиторы РНКазы, ингибиторы ДНКазы и т.п. В одном из вариантов настоящего изобретения образец подвергают лизису непосредственно в той форме, в которой он был взят у индивидуумов, подвергаемых обследованию. Ингибиторы протеиназы могут, например, включать ингибиторы сериновых протеиназ, ингибиторы цистеиновых протеиназ, ингибиторы аспарагиновых протеиназ, ингибиторы металлопротеиназ, ингибиторы кислотных протеиназ, ингибиторы щелочных протеиназ или ингибиторы нейтральных протеиназ. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ингибирование ферментов может быть достигнуто химическими методами, такими как денатурация ферментов посредством концентрированной соли, рН, хаотропных агентов или т.п.

В другом варианте осуществления изобретения данный физиологический образец может быть, кроме того, очищен, а затем подвергнут лизису. Такие процедуры очистки могут, например, включать удаление (путем промывки) примесей, таких как слизь или т.п., выделение или концентрирование клеточных компонентов, сохранение и транспортировку клеток. В одном из вариантов изобретения указанные клетки могут быть разделены с помощью проточной цитометрии или других подходящих методов клеточного сортинга, известных специалистам. Так, например, клеточные компоненты исходных образцов могут быть включены в один раствор образца.

Получение образца для е