Способ получения адсорбента для препаративной хроматографии белков

Способ получения адсорбента для препаративной хроматографии белков

Реферат

Изобретение относится к области хроматографии белков, может быть использовано в биотехнологии для очистки и фракционирования ферментов и касается способа получения адсорбента - гидроксиапатит.

Известен способ получения гидроксиапатита (RU 2349377, МПК B01Y 20/04, опубл. 20.03.2009), включающий стадию получения брушита (СаНРО₄) из карбоната кальция путем обработки эквимолярным количеством ортофосфорной кислоты при рН 1.0, комнатной температуре и при самопроизвольном перемешивании суспензии в результате выделения углекислого газа. Далее суспензию нейтрализуют, брушит отфильтровывают, промывают и обрабатывают щелочью при комнатной температуре.

Недостатком способа является разрушение частиц брушита в результате выделения углекислого газа, что снижает сорбционную емкость сорбента. Это ограничивает его использование для очистки белков методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах и для препаративной хроматографии.

Известен способ получения гидроксиапатита (RU 2209665, МПК B01J 20/04, опубл. 10.08.2003), выбранный за прототип, включающий стадию получения брушита из фосфата кальция путем его обработки 1 М ортофосфорной кислотой при кипячении и гидромодуле реакции 1:3.5. Далее суспензию нейтрализуют, брушит отфильтровывают, промывают и обрабатывают щелочью при 100°С и гидромодуле 1:6.

Недостатком способа является низкая сорбционная емкость, обусловленная образованием микропористой структуры сорбента в результате жестких (100°С) условий обработки. Это затрудняет его использование для препаративной хроматографии и для очистки белков методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах.

Техническим результатом настоящего изобретения является увеличение сорбционной емкости целевого продукта, упрощение и удешевление способа его получения.

Технический результат достигается тем, что брушит получают из фосфата кальция путем обработки 3 М раствором ортофосфорной кислоты при комнатной температуре и гидромодуле реакции 1:1.2, а получение гидроксиапатита осуществляют посредством обработки брушита щелочью при комнатной температуре и гидромодуле 1:3.

Способ осуществляют следующим образом.

Получение брушита проводят согласно реакции 1:

Фосфат кальция с размерами частиц 50-250 мкм добавляют при перемешивании к раствору, содержащему эквимолярное количество ортофосфорной кислоты. При этом используют гидромодуль реакции 1:1.2 (вес Са₃(РO₄)₂/объем Н₃РO₄). После этого суспензию оставляют на несколько часов при комнатной температуре 20-25°С для завершения реакции. Образование брушита происходит на поверхности твердых частиц фосфата кальция, что способствует получению более крупных фракций брушита. В ходе реакции происходит увеличение объема твердой фазы на 40-50% от исходного, в результате чего брушит занимает весь объем реакционной смеси. При этом получение брушита в указанных условиях не требует перемешивания и способствует образованию более пористого материала. После установления рН суспензии в диапазоне от 3.0 до 4.0 ее нейтрализуют до рН 6.8-7.2 добавлением раствора щелочи. Для получения гидроксиапатита брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 литрами воды и обрабатывают гидроксидом натрия при комнатной температуре 20-25°С и гидромодуле 1:3.

Сорбционную емкость целевого продукта (мг/г) определяют по связыванию бычьего сывороточного альбумина (БСА) в растворе с рН 6.0 при комнатной температуре. Концентрацию БСА определяют по поглощению (оптической плотности) раствора при λ=280 нм.

Пример 1 (прототип). К 100 г Са₃(РO₄)₂ приливают 350 мл 1 М раствора Н₃РO₄ (гидромодуль 1:3.5), помещают суспензию в кипящую водяную баню и выдерживают при периодическом перемешивании, пока не установится рН среды в пределах 2.5-3.5. Суспензию нейтрализуют до рН 6.8-7.2 добавлением 50%-ного NaOH и дают медленно остыть до комнатной температуры. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 л воды и суспендируют в 500 мл воды, после чего добавляют 100 мл 50%-ного NaOH (гидромодуль 1:6) помещают в кипящую водяную баню, периодически перемешивая суспензию. По истечении 2-х часов гидроксиапатит отфильтровывают и промывают на фильтре водой до нейтральной реакции фильтрата.

Сорбционная емкость гидроксиапатита составляет 25-29 мг БСА/г сорбента.

Пример 2. К 120 мл 3 М раствора ортофосфорной кислоты добавляют при перемешивании 100 г Са₃(РO₄)₂ (гидромодуль 1:1.2). После этого суспензию оставляют на несколько часов при комнатной температуре 22.5°С для завершения реакции и установления рН суспензии в диапазоне от 3.5 до 4.0 Далее суспензию нейтрализуют до рН 6.8-7.2 добавлением 50%-ного NaOH. Брушит отфильтровывают, промывают на фильтре 2 л воды и суспендируют в 200 мл воды, после чего добавляют 100 мл 50%-ного NaOH (гидромодуль 1:3) и выдерживают 1 час при комнатной температуре 22.5°С. В случае кристаллизации суспензии ее подвергают слабому нагреву (до 40°С) или добавляют равный объем воды. Гидроксиапатит отфильтровывают и промывают на фильтре водой до нейтральной реакции фильтрата. Сорбционная емкость гидроксиапатита составляет 68-72 мг БСА/г сорбента.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить сорбционную емкость целевого продукта по сравнению прототипом, а также упростить процесс получения гидроксиапатита за счет исключения операции кипячения.

Способ получения адсорбента для препаративной хроматографии белков, включающий взаимодействие твердого фосфата кальция с раствором ортофосфорной кислоты, получение нейтрализованной суспензии брушита, введение в суспензию, содержащую брушит, раствора щелочи и выдержку полученной суспензии до образования суспензии гидроксиапатита, отличающийся тем, что на взаимодействие фосфата кальция с ортофосфорной кислотой подают 3М ортофосфорную кислоту в эквимолярном количестве при гидромодуле, равном 1:1,2, обработку брушита раствором щелочи проводят при гидромодуле, равном 1:3, и процесс осуществляют при комнатной температуре.