Способ определения и идентификации биологических микрообъектов и их нанокомпонентов и устройство для его осуществления

Способ определения и идентификации биологических микрообъектов и их нанокомпонентов и устройство для его осуществления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, пищевых и промышленных биотехнологий, а именно к исследованию биологических материалов путем определения их физических и химических свойств с помощью оптических средств, к системам, в которых материал зондируется или возбуждается оптическими средствами и он флуоресцирует.

Известен способ обнаружения и идентификации микробов из смесей микробов, который основан на двумерном центрифугировании по степени седиментации полос равной плотности и на обнаружении связанных частиц по свойствам отраженного света и флуоресценции специфических флуоресцентных меток (United States Patent 7070739).

Способ позволяет различать инфекции, идентифицировать известные микробы, изучать и характеризовать новые микробы. Также способ позволяет достаточно уверенно проводить идентификацию микробов и способствует более эффективному лечению соответствующей инфекции.

Однако применение способа и соответствующей аппаратуры с расходными материалами требует существенных финансовых затрат. Также способ не обладает неинвазивностью диагностики, является не клиническим, а лабораторным, что затрудняет его применение врачом, так как требуется транспортировка исследуемого материала в лабораторию и передача результатов исследования обратно в клинику, что дополнительно затрудняет мониторинг процесса лечения и оценку его эффективности.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ селективной оптической диагностики микробов и устройство его реализации, который основан на регистрации как абсорбционных, так и флуоресцентных характеристик исследуемого вещества, помещенного в приспособленную для этого кювету. При этом в качестве значимых диагностических данных используют спектральные характеристики на всех предварительно выбранных длинах волн поглощения и флуоресценции, которые обрабатывают с помощью ЭВМ и программного обеспечения (ПО) на основе статистических регрессионных методов с получением информации о видовых концентрациях микроорганизмов в субстрате (М.Т.Александров. Лазерная клиническая биофотометрия. М., 2008).

Данный способ позволяет в режиме реального времени определять концентрации микроорганизмов в биологических субстратах.

Однако он не позволяет диагностировать нефлуоресцирующие биологические вещества, а также не содержит возможности интракорпорального обследования. Нами он выбран в качестве прототипа.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность качественного и количественного анализа содержимого органических веществ на основе оптического измерения для целей промышленности, медицины, экологии и пищевых технологий.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе применяются технические решения, заключающиеся в том, что в качестве феномена, имеющего действующий фактор, например лечебный, и характеризуемого физическими величинами, несущими диагностическую информацию, используют конверсию излучения лазерного (ЛИ) или иного источника света и/или другого электромагнитного излучения, имеющую такие аспекты, соответствующие характеристики количественных мер в отдельности и/или в совокупности которых измеряют с помощью соответствующих устройств, как, например, отражение, рассеяние, поглощение, флуоресценцию, комбинационное и нелинейное рассеяния, эффекты фотоакустический, термо-оптический и др., в исследуемых образцах объектов живой и неживой природы медицинского, промышленного, экологического, пищевого, биосферного, космического и др. назначения, с последующим портированием получаемой информации и диагностической и аналитической обработкой ее в соответствии с основанным на статистической регрессионной модели концентраций компонент аппаратно-адаптированным алгоритмом способа на ЭВМ, который заключается в том, что полученные характеристики сохраняют на устройстве для хранения информации на ЭВМ и приводятся в линейную по диагностическому параметру форму, и далее их обрабатывают согласно аппаратно адаптированному алгоритму способа таким образом, что сначала нормируют все измеренные характеристики, например, с использованием эталонов на пропускание, отражение, флуоресценцию и др. явлений конверсии ЛИ в диагностируемых объектах, с помощью которых находят соответствующие аппаратные функции для нормировки характеристик с помощью умножения на последние, и/или, например, в медицинской диагностике в случае экзокорпорального обследования, например, используя условие постоянства интегральной интенсивности отраженного в обратном направлении возбуждающего излучения, и/или используя условие постоянства интегральной интенсивности полосы комбинационного рассеяния воды при специально подобранной длине волны возбуждающего излучения, и/или используя условие постоянства интегральной интенсивности полосы флуоресценции добавляемых в образцы в стандартной концентрации квантовых точек и/или флуорофоров с узкополосной флуоресценцией, а при эндокорпоральном обследовании, используя условие постоянства какой-либо характеристики конверсии ЛИ в биологическом объекте (БО) либо линейного по характеристикам гомеостатического параметра биологического вида человека, и/или используют уровненную нормировку, учитывающую локальную величину на фоне общеорганизменного, по формуле

X_pi=X_ai/(1-α_i·X_эi),

где X_pi - уровненная характеристика конверсии, X_ai - экзокорпоральная абсолютная характеристика конверсии, Х_эi - эндокорпоральная относительная характеристика конверсии, α_i - коэффициент при i-й характеристике в выражении для гомеостатического параметра Р=Σα_k·I_k, и/или при этом и/или при других видах диагностик восстанавливают корректные спектры флуоресценции, используя ранее измеренные спектральные характеристики экстинкции с помощью измерительного тракта комплекса спектров реальной флуоресценции по формуле

X_{i corr}=X_i/(a₁+а₂·э_i+а₃·э_i ²),

где X_{i corr} - значение корректированной спектральной характеристики от i-го канала прибора, X_i - значение соответствующей спектральной характеристики без корректировки, a₁, a₂ и а₃ - поправочные коэффициенты, зависящие от геометрии образцов и способа сбора излучения, э_i - пространственный декремент затухания, обусловленный экстинкцией на i-й длине волны, дальше часть сохраненной спектральной информации для достаточно большого количества образцов органического вещества с заранее известным аналитическим содержимым используется для создания модели концентраций путем реализации, согласно аппаратно адаптированному алгоритму способа, процедуры регрессии аналитической информации на статистические главные компоненты спектральных характеристик этих образцов, а для остальных образцов неизвестное содержимое находится при вычислении согласно аппаратно адаптированному алгоритму способа, использующему полученную модель, и вычисленные количественные и/или качественные характеристики, которые могут характеризовать биологический или молекулярный состав, используют в целях промышленности, медицины, экологии, пищевых, биосферных, космических и др. технологий, при этом производят контроль за лечением до полного выздоровления в медицине и следят за циклами превращений БО в производстве, и в случае заканчивания цикла производства или при выздоровлении пациента диагностика прекращается, а также лечебно-диагностические установки используют для проведения радиационной терапии больных пациентов, также перед началом каждой серии диагностики измеряют характеристики эталонов сравнения и вносят их в ЭВМ для вычисления аппаратной функции, а образцы приготовляют, например, взятием некоторого количества исследуемого жидкого, твердого или газообразного объекта живой и/или неживой природы и помещением в стандартизованные кюветы для измерения спектров пропускания и лазерно-индуцированной флуоресценции и иных характеристик конверсии излучения лазерного или иного источника света, которые могут быть как большого объема, объемом приблизительно в несколько миллилитров, так и маленького, объемом приблизительно в доли микролитров и собранные на планшетную основу, содержащую также и проточную кювету, при этом также сюда могут входить интегрированные с планшетой устройства для фотоакустической, опто-термической, и др. диагностик, с помощью которых измеряют соответствующие характеристики конверсии излучения в помещенных в планшетные кюветы образцах, а для разбавленных растворов с исследуемым содержимым предварительно увеличивают концентрацию содержимого фильтрованием субстрата, с последующим определением концентрации и вида вещества, например на фильтре, а в случае неразделяемых объектов с пространственно-протяженной поверхностью часть измерений, связанных со световым откликом, выполняются непосредственно поднесением светособирающего устройства к поверхности органического вещества, и что в глобальном варианте реализации оптической диагностики с помощью дистанционных методов по измеряемым характеристикам конверсии излучения лазерного или другого источника определяют количественные и качественные параметры близких или удаленных проб, при этом диагностический комплекс стоит из единого блока анализа информации обрабатывающего спектры флуоресценции сразу нескольких блоков измеряющих эти спектры и передающих свою информацию для обработки блоку анализа по локальным или глобальным сетям связи с использованием стандартных протоколов, в том числе и протоколов шифрования, также и/или проводят реализацию индивидуально-нормированного диагностического диспансера, для чего измеряют спектральные и сигнальные характеристики конверсии оптического излучения в живом веществе каждого индивидуального организма в норме на разных стадиях его развития и заносят в базу данных головной ЭВМ, а потом используют для анализа, по приведенному выше принципу, и сравнения его результатов с анализом, сделанным в текущее время, и в случае отклонений текущих параметров диагностики как от индивидуальных, так и от коллективных диапазонов нормы делают диагноз о соответствующей вычисленному параметру патологии,

и тем, что в устройстве его реализации, содержащем кювету, к которой подвод возбуждающего излучения и отвод светового отклика идет по сложному оптоволоконному кабелю, который с первого конца выполнен многожильным, со второго конца для передачи возбуждающего излучения выполнен одножильным, жила которого переходит в центральные жилы первого конца, с третьего конца для передачи светового отклика в спектроанализатор выполнен многожильным, жилы которого переходят в периферийные жилы первого конца, второй конец сопряжен с выходом излучения лазера, а кюветы выполнены в форме, размерах и из материалов, определяемых конкретной задачей применения, при этом регистрирующую часть делают из матрицы полупроводниковых фотодетекторов, которые помещают и/или не помещают в термостат, охлажденный до низких температур, и/или многоканального фотоэлектронного умножителя, составленного по принципу конструкции фотоэлектронного умножителя жалюзийного типа с общим катодом и множеством анодов, соответствующих множеству каналов, количеством приблизительно 150-300, а измерения спектров пропускания проводят на спектроанализаторе, соединенном с одножильным световодом, который поставлен со стороны кюветы, противоположной стороне освещения источником полихроматического света, при этом дополнительно и/или отдельно измеряют спектральную флуоресцентную картину образца при помощи флуоресцентного микроскопа, снабженного проецирующей оптической частью, лазерным источником для возбуждения образца, светофильтром, поляризатором, диспергирующим элементом, окуляром для визуального контроля и/или без окуляра, высокочувствительной фотокамерой и устройством оцифровки сигнала и сопряжения с ЭВМ (PC), и система сбора флуоресцентного излучения, испускаемого диагностируемым образцом, может быть реализована в нескольких вариантах, например, представляющем простой торец оптоволоконного катетера, как для экзокорпорального, так и эндокорпорального применения, или, например, представляющем линзовую или зеркальную коллиматорную систему, которая позволяет собирать и фокусировать лучи, исходящие от сравнительно небольшого по размерам образца под разными углами, в торец приемного световода, или, например, представляющем диэлектрическую антенну, собранную из двух склеенных между собой диэлектрических пластин, одна из которых на внешней от первой пластины стороне имеет форму замедляющей волновой структуры, а граница раздела диэлектриков на одном краю пластины, где происходит максимальная фокусировка возбужденной поверхностной волны, переходит в оптоволокно, а также с целью увеличения собирательной силы антенны, в объеме второго диэлектрика располагают сеть тонких оптоволоконных жил, которые позволяют эффективно транслировать поверхностную волну в приемный световод, или, например, представляющем оптический резонатор, с возможностью вмещения в него образцов в кюветах, специальной формы, например эллипсоидальной с приемным окном световода около вершины большой полуоси, а кюветы для измерения характеристик флуоресценции и экстинкции содержимого в них выполнены в виде емкостей луночной формы с прозрачными стенками и объемами, например в десятые, в сотые доли миллилитра для визуального просмотра объектов живой и/или неживой природы и измерения характеристик конверсии, и расстояния между стенками кювет лежат в пределах, превышающих поперечные размеры микробов на 5-10% и/или в тысячные доли миллилитра для очень мутных объектов, и что для автоматизации и ускорения измерения больших партий образцов объектов живой и/или неживой природы кюветы равных и/или разных объемов 0.001-1 мл собирают в планшеты, а также кюветы выполняются с большим объемом, и/или дополнительно встроенными в планшеты, в том числе в проточном варианте, для измерения доступных в больших количествах образцов субстратов, также сюда могут входить интегрированные с планшетой устройства для фотоакустической, опто-термической и др. диагностик, с элементами сопряжения с ЭВМ, а также устройства для сбора интегрированного и/или неинтегрированного светового отклика, сопряжения с флуоресцентным микроскопом и механизмом горизонтального и вертикального перемещения планшеты, часть кювет в планшете при этом могут быть заполнены веществами, служащими эталонами, положительным, отрицательным и т.д.

Описание способа

Способ оптической диагностики живого вещества выполняют с помощью устройств, схема первого из которых приведена на фиг.1. Флуоресцентное устройство для диагностики снабжено интерфейсом для подключения ЭВМ. Оно реализуется с применением многоканальных светочувствительных элементов и аналогово-цифровых преобразователей, передающих спектральный сигнал с каждого канала, являющийся аналогом спектральной интенсивности на определенном участке спектра, на входной канал компьютера (интерфейс). Применение устройства в предложенном способе происходит при использовании соответствующего аппаратно-адаптированного алгоритма способа для установки лазерно-флуоресцентной диагностики (фиг.1), состоящей из лазера 17 с соответствующе подобранной длиной волны генерации, сложного оптического кабеля с волокнами для подвода возбуждающего излучения 11 к анализируемому образцу и снятия флуоресцентного отклика и подвода его к спектроанализатору 9, спектроанализатора 6, состоящего из оптического фильтра по длине волны возбуждения 11, диспергирующего элемента, и многоканального оптикоэлектронного детектора 3, усилителя электрического сигнала, аналого-цифрового преобразователя (2) и ЭВМ (1) с соответствующим аппаратно-адаптированным алгоритмом способа для обработки и хранения спектральной информации. Также для измерения спектра экстинкции субстрата используется источник немонохроматического (многочастотного) излучения 7. При применении планшетных кювет излучение лазера 17 проходит через выделенную ячейку планшеты, а световой отклик от ячейки 15 собирается на торце оптоволокна 12 и направляется на вход спектрофотометра 6, далее спектр оцифровывается и передается ЭВМ (1). Также на фиг.1 изображены следующие элементы: 4 - аналогово-цифровой преобразователь измерителя спектров пропускания, 5 - матрица полупроводниковых детекторов измерителя спектров пропускания, 8 - исследуемый образец, 13 - световодный оптический тракт измерителя спектров пропускания, 14 - планшета, 16 - проточная кювета планшеты. Планшета выполнена из оптически прозрачного материала и содержит на фронтальной поверхности несколько (2-500) углублений - кювет, с небольшим объемом порядка 0.1-0.001 миллилитра, причем часть из них может быть одинакового размера, а часть разного, а также может содержать проточную кювету, входной и выходной концы которой подсоединены к шлангам, сообщающимся с резервуаром входной жидкости и резервуаром для слива жидкости из кюветы и/или эталонную кювету с водой для калибровки спектров комбинационного рассеяния. Для измерения иных характеристик конверсии лазерного и/или оптического излучения используются соответствующие устройства для регистрации 19, сигнал с которых оцифровывается в АЦП 20 и подается на вход ЭВМ 1. Для сбора флуоресцентного излучения и передачи его по оптоволокну используется светособирающее устройство 18, варианты схем реализации которого приведены на фиг.2. В первом варианте светособирающее устройство представляет простой торец оптоволоконного катетера 7, который содержит центральную жилу, предназначенную для подвода возбуждающего излучения к образцу 1 и периферийные жилы для сбора и отвода флуоресцентного отклика 2. Во втором варианте светособирающее устройство представляет линзовую или зеркальную коллиматорную систему, позволяющую собирать и фокусировать лучи, исходящие от сравнительно небольшого по размерам образца 1 под разными углами, в торец приемного световода 2. Эта система состоит из зеркала 3 и одной линзы 4 или из двух линз 4 и/или без зеркала 3, собранных так, что происходит фокусировка флуоресцентного излучения образца 1 в приемное окно световода 2. В третьем варианте светособирающее устройство представляет диэлектрическую антенну 5, собранную из двух склеенных между собой диэлектрических пластин с разными показателями преломления n1 - 1 и n2 - 2, одна из которых на внешней от первой пластины стороне имеет форму замедляющей волновой структуры (фиг.3). Граница раздела диэлектриков на одном краю пластины, где происходит максимальная фокусировка возбужденной поверхностной волны, переходит в оптоволокно. Также с целью увеличения собирательной силы антенны, в объеме второго диэлектрика располагают сеть тонких оптоволоконных жил 3, которые позволяют эффективно транслировать поверхностную волну в приемный световод 4 (фиг.3). С помощью такого устройства можно сбирать флуоресцентное излучение как с объектов с большой поверхностью (стол, стена, поверхность инструментов и кожи), так и с небольших образцов флуоресцирующих жидкостей. В четвертом варианте светособирающее устройство (фиг.2) представляет оптический резонатор 6 с возможностью вмещения в него образцов 1 в кюветах приспособленной для этого формы 1. Резонатор выполнен специальной формы, обеспечивающей более эффективный сбор и передачу излучения в приемное окно световода 2, например, в форме эллипсоида 6 с зеркальной внутренней поверхностью, к которому световод подводится к вершине большой полуоси эллипсоида.

Многоканальный оптикоэлектронный детектор выполняется в нескольких вариантах. В первом варианте это многоканальная матрица полупроводниковых фотодетекторов. Во втором варианте это многоканальная матрица полупроводниковых фотодетекторов, помещенная в охлаждаемый термостат с низкой температурой. Это позволит достичь большей устойчивости к собственным тепловым шумам. В третьем варианте это многоканальный фотоэлектронный умножитель, выполненный по принципу фотоэлектронного умножителя жалюзийного типа (фиг.4). Он содержит один удлиненный фотокатод 1 и множество анодов 2, количеством, соответствующим количеству каналов регистрации, примерно 150-300. Между анодом и катодом расположена система динодов 3, состоящих из металлических пластин, наклоненных под оптимальным углом к плоскости катода, причем пластины стоящих непосредственно друг над другом динодов отклонены в противоположные стороны. В рабочем состоянии на диноды подается каскадное напряжение, умножающее фототок каждого канала. Количество пластин на динодах на один больше количества анодов.

Для проведения диагностики необходимо выполнить коррекцию спектров флуоресценции с использованием спектров экстинкции, поскольку из-за поглощения и рассеяния света в субстрате интенсивность флуоресценции снижается, а спектр при этом еще и меняет форму. Коррекцию спектров проводят по формуле (1).

где X_{i corr} - значение корректированной спектральной характеристики от i-го канала прибора, X_i - значение соответствующей спектральной характеристики без корректировки, а₁, а₂ и а₃ - поправочные коэффициенты, зависящие от геометрии образцов и способа сбора излучения, э_i - пространственный декремент затухания, обусловленный экстинкцией на i-й длине волны.

Кюветы могут быть сделаны как относительно большого, так и небольшого объема и выполнены заключенными в защитный кожух, который светонепроницаем, очернен с внутренней стороны и имеет только крышку для помещения и удаления образцов, отверстия для входного и выходного шланга проточной кюветы и разъемы для соединения со световодным и/или проекционным трактом передачи световой информации. Например, для обнаружения клеток микробов в малых концентрациях применяют тонкие кюветы объемом в несколько сотых долей миллилитра. А для субстратов с большими концентрациями используют кюветы объемом до тысячной доли миллилитра. Такие небольшие, как одинаковые, так и неодинаковые по объему кюветы можно собрать на одной планшетной основе, располагая кюветы в матричном порядке. При этом расстояние между прозрачными стенками кюветы может быть не более чем на 5-10% больше размеров исследуемого микроба и/или микробов, что дополнительно повышает точность измерения концентраций и видов микробов, и кроме этого позволяет получать истинные характеристики флуоресценции микробов без вклада спектра рассеивающей среды, особенно в субстратах с малой их концентрацией, например 10¹-10³ КОЕ/мл, где КОЕ - количество колониеобразующих единиц микробов при их высеве на питательные среды на 1 мл исследуемого субстрата и/или взвеси микробов.

Можно применить специальную планшетную технологию (фиг.12), реализованную в виде лунок 3…4, вырезанных на кварцевой пластине 2, которые изготовляются с одинаковыми и неодинаковыми размерами, такими как различная и одинаковая поперечная площадь или одинаковая и различная высота, а также из прикрывающей сверху пластины 1. Данная технология обладает многими преимуществами по сравнению с подобными технологиями. Например, простота при приготовлении измеряемых субстратов на ней и при очистке, когда содержимое легко смывается водой или спиртом. Также при одинаковых поперечных площадях лунок легко реализовать стандартизацию результатов измерений. Например, при измерении отклика пространственно-интегрирующими устройствами, такими как микроскоп, измеренную величину нормируют на объем лунки:

Х_н=X/V,

где Х_н - нормированная величина, Х - величина без нормировки, V - объем лунки. А, например, при измерении оптоволоконным катетером, поднесенным к поверхности пластины 1, и при равномерном освещении лунки лазером, измеренную величину нормируют так:

Х_н=Х·h/V,

где h - толщина пластины 1. При измерении оптоволоконным катетером, поднесенным к поверхности пластины 1, и освещении лунки из выходного окна катетера измеренную величину нормируют так:

Х_н=X·h³/V.

Измерения флуоресценции дополнительно и/или отдельно проводят на флуоресцентном микроскопе, схема которого показана на фиг.5. Здесь поляризованное излучение, например, эксимерного лазера 8 направляют в кювету 7 с исследуемым образцом 6. Излучение флуоресценции от единичной бактерии через поляризатор 5 и спектральный фильтр 4 попадает в микроскоп 3, снабженный, например, камерой 2. RGB сигнал камеры служит набором характеристик исследуемого образца, фильтра и длины волны возбуждения. Компьютер, на вход 1 которого подается сигнал от CCD камеры 2, сравнивает этот сигнал с имеющейся библиотекой и определяет вид бактерии. Зная объем кюветы и сосчитав «поштучно» бактерии, вычисляют их концентрацию. В некоторых случаях степень деполяризации может уточнить и дополнить спектральный сигнал.

Для измерения спектральных характеристик флуоресценции и экстинкции водных сред с низкой концентрацией микробов применяют предварительное обогащение субстрата диагностируемым конституентом при прогонке большого объема водной среды через фильтр. При этом на фильтре остаются микробы, которые либо снимают и растворяют в воде до необходимых концентраций и помещают в кюветы для измерения, либо все диагностические измерения проводят непосредственно на фильтре, и зная, например, объем прошедшей через него жидкости, скажем воды, легко пересчитать полученные результаты диагностики концентрации вида микроба или микробов на единицу обследуемого общего объема жидкости, например воды.

Второе устройство, которое используют в качестве опционального источника диагностической информации в предполагаемом способе, представляет собой аппаратурный узел для измерения фотоакустичксого эффекта, состоящий из стандартного набора комплектующих его устройств. В его состав входят лазер и фотоакустическая ячейка. Кювету с исследуемым веществом помещают в ячейку, включают лазерный импульс и измеряют фотоиндуцированный акустический отклик. Полученный сигнал оцифровывают и заносят в базу данных на ЭВМ. Если сигнал по техническим или иным причинам оказывается нелинейно-искаженным, его предварительно линеаризуют, используя предварительно измеренную аппаратную функцию.

Третье устройство, которое используют в качестве опционального источника диагностической информации в предполагаемом способе, представляет собой аппаратурный узел для измерения опто-термического эффекта. Это устройство выполняется в стандартном варианте. Снимаемый сигнал переводится путем преобразования на ЭВМ в линейный формат данных и заносится в базу данных.

Четвертое устройство, которое используют в качестве опционального источника диагностической информации в предполагаемом способе, представляет собой аппаратурный узел для измерения линий комбинационного рассеяния лазерного излучения. Это устройство тоже выполняется в стандартном варианте. Снимаемый сигнал переводится путем преобразования на ЭВМ в линейный формат данных и заносится в базу данных.

Также с целью получения диагностической информации об исследуемом объекте могут быть дополнительно использованы устройства, принципы и методы работы которых основаны на измерении одного или нескольких из остальных эффектов конверсии электромагнитного излучения в иные формы энергии внутри объекта при соответствующем объекте. Получаемый при этом сигнал оцифровывается и поступает на порт ввода/вывода ЭВМ. На ЭВМ с помощью аппаратно-адаптированного алгоритма способа сигнал преобразуется в линейную по количественным внутренним параметрам объекта форму.

Способ позволяет нормировать измеряемые спектральные характеристики без использования дополнительных устройств нормировки, так как объектом и средством нормировки является сама водная среда исследуемого субстрата и/или вводимые в нее квантовые точки, при применении предложенных способов нормировки. Также можно в начале каждой серии измерений вычислять аппаратные функции для нормировки всех показаний приборов. Для этого измеряют соответствующие характеристики конверсии ЛИ в эталонах и, используя полученные характеристики, вычисляют поправки на аппаратную функцию, используя критерий необходимости постоянства данных характеристик во времени для эталонов.

Для нормировки на абсолютные и относительные величины результатов измерений характеристик конверсии ЛИ в БО и их НК используют два типа калибратора: эндокорпоральный и экзокорпоральный. В первом случае все измеренные характеристики нормируются с учетом соответствующих поправочных коэффициентов на какую-либо индивидуально выраженную и регистрируемую внутреннюю характеристику или на гомеостатический параметр конверсии ЛИ (опто-термическую, фотоакустическую, флуоресцентную, комбинационную и др.), которые пропорциональны интенсивности ЛИ в каждом локальном участке БО как в норме, так и при патологии (а также с учетом предыстории этих параметров до и во время возникновения патологии), при этом непосредственные характеристики нормируются, приводятся к линейному по диагностическому параметру виду:

Х_эi=I_i/Р, P=Σα_k·I_k,

где Х_эi - нормированная величина характеристики, I_i, I_k - непосредственные показания прибора, приведенные к линейному по диагностическому параметру виду, Р - нормировочный коэффициент, определяемый в общем случае в виде суммы от измеряемых величин I_k, умноженных на весовые коэффициенты α_k, находимых по алгоритму, описанному ниже, в результате статистических исследований на определение, например, гомеостатического параметра биологического вида, или другого не меняемого от индивидуальностей константного параметра, i, k - порядковый номер характеристики.

Во втором случае все измеренные характеристики во время экстракорпорального обследования нормируются и корректируются по абсолютным величинам с использованием характеристик конверсии ЛИ в исследуемом объекте как внутреннего источника (нативные молекулы, клетки), так и внешнего источника конверсионного сигнала (флуоресцирующие добавки, квантовые точки, различные эталоны и т.д.), а также вычитанием фоновых эффектов (от прибора, пробирки), что определяется по формуле вида:

X _ai=(I_i-I_iф)/Р,

где X_ai - абсолютная величина характеристики, I_iф - показания прибора на фоне.

Можно использовать уровненную количественную величину, полученную с учетом обеих вышеперечисленных поправок, позволяющую рассматривать локальные изменения характеристик на фоне общеорганизменного:

X_pi=X_ai/(1-α_i·Х_эi),

где X_pi - уровненная величина характеристики.

Для объективной диагностики вида и концентрации химических компонент или микробов с целью нормировки спектров используют несколько способов, в зависимости от специфики субстрата. Используют нормировку на интенсивность отраженного возбуждающего излучения, прошедшего по измерительному тракту и давшему свой вклад в общий спектр светового отклика субстрата. Нормировочный множитель равен обратной интегральной интенсивности отраженного возбуждающего излучения. Так же используют нормировку по интенсивности полосы комбинационного рассеяния молекулами воды лазерного излучения. Этот способ нормировки дает наиболее точный нормировочный множитель, поскольку интенсивность полосы комбинационного рассеяния пропорциональна лишь интенсивности лазерного излучения в субстрате. Нормировочный множитель равен обратной интегральной интенсивности полосы комбинационного рассеяния молекул воды. Для нормировки сигнала можно вместо спектров комбинационного рассеяния использовать спектр Релеевского рассеяния молекул воды, но при этом значительно труднее исключить вклад самого лазерного излучения (бликов). Еще применяют нормировку с использованием флуоресцентных или люминесцентных добавок со стандартной концентрацией непосредственно в субстрате. Этот метод нормировки тоже достаточно точен. При этом требуется применение квантовых точек или флуорофоров с узкими спектральными полосами флуоресценции. Нормировочный множитель равен обратной интегральной интенсивности полосы флуоресценции добавки.

Аппаратно-адаптированный алгоритм способа основан на методе концентраций, позволяя на основе сравнения базы данных и полученных спектров оценивать качественный и количественный состав биологических и химических компонент содержимого диагностируемого вещества в виде концентрации микроорганизма и его видовой принадлежности. Этот алгоритм позволяет проводить количественный специфический анализ микробосодержащего биологического субстрата и растворенных в нем элементов по их спектральной информации посредством реализации линейной регрессии на главные компоненты (ГК) спектральных характеристик. ГК и коэффициенты регрессии хранятся в базе данных и являются статической, исходной информацией в ходе процедуры диагноза. Сигнал, полученный в результате флуоресцентной диагностики, является спектром на заданном диапазоне длин волн и заданным шагом дискретизации. Сигнал для остальных методов, применяемых в способе, тоже можно представить в виде набора данных, как многомерной векторной величины (размерность при этом равна количеству дискретных значений в данных) или спектра.

В основу метода концентраций была положена феноменологическая модель характеристик конверсии ЛИ в образце как суммы соответствующих характеристик молекулярных или иных компонент. Согласно ей, в образцах биологического субстрата присутствуют несколько общих для всех образцов видов таких компонент. При возбуждении излучением красного диапазона этими компонентами, например флуорофорами или хромофорами, обычно являются порфирины. Считаем, что характеристики, снятые в образце, в первом приближении является суммой характеристик содержащихся компонентов. В результате анализа спектров флуоресценции или других характеристик конверсии ЛИ мы получаем дискретный набор интенсивностей флуоресценции или иного измеряемого явления, испускаемых образцами на различных длинах волн. Предполагаем, что любой анализируемый спектр является сверткой нескольких спектров, создаваемых различными компонентами в исследуемом образце. Тогда любое значение интенсивности для каждого образца из этого набора согласно модели является суммой спектральных интенсивностей флуоресцирующих или иных компонент, умноженных на их концентрационные коэффициенты

где x_sj - дискретная спектральная интенсивность s-го образца на j-й длине волны, y_kj - дискретная интенсивность k-го компонента на j-й длине волны, c_sk - концентрационный коэффициент, пропорциональный количественной мере присутствия k-го компонента в S-ом образце.

Компонентой может быть и отдельная молекула, и целая биологическая клетка, например клетка микроба. В терминах линейной алгебры спектральные интенсивности образцов представляют собой координаты соответствующих этим образцам векторов в многомерном пространстве, размерность которого определяется числом шагов дискретизации в данных исходных спектров. При таком представлении спектральной информации дискретные спектральные интенсивности компонент y_kj определяют базисные вектора, по которым раскладываются векторы характеристик образцов. Это обстоятельство базисности объясняется тем, что множество векторов образцов входит в линейную оболочку векторов компонент y_kj, поскольку вектора y_kj имеют ту же размерность, что и x_sj, и они полностью исчерпывают возможные варианты построения суммарных спектров флуоресценции, считая при этом, что компоненты присутствуют во всех образцах и только эти компоненты в них присутствуют.

Для устойчивости модели, а также ее универсальности эти базисные вектора находятся не для исходного пространства спектральных характеристик, размерность кот